Aarhus Katedralskole, 09/10 Kemirapport d. 4/5-10 [navn fjernet], 2.l
1
Formål:
Bestemmelse af ukendt aminosyre ud fra TLC (tyndtlagscromatografi) samt titrering.
Teori:
Beskrivelse af aminosyre: En aminosyre består af en carboxylsyregruppe og en aminogruppe.
Aminogruppen indeholder kvælstof (nitrogen) og er en funktionelgruppe ligesom
carboxylsyregruppen er funktionel. Derfor er aminosyren et såkaldt difunktionelt stof.
Idet aminer indeholder et kvælstofatom, er disse svage baser – begrundelsen herfor ligger i, at
nitrogen ligger i femte hovedgruppe i det periodiske system. Dette gør, at der er ”3 frie pladser” i
yderste elektron skal – dvs. 3 andre atomer kan binde sig hertil.
Derudover gælder det også, at det frie elektronpar til højre, gør aminerne
meget ivrige efter at optage hydroner – et kendetegn for svage baser.
Således gælder det at den generelle formel for en 2-aminosyre ser ud:
I dette eksperiment har vi benyttet følgende aminosyrer:
- Gly (glycin):
- Val (valin):
- Cys (cystein):
- Asp (asparagin)
for hvilke deres pK
s
-værdier er blevet slået op. I tabellen nedenfor ses disse samt bestemmelsen af
hvorvidt stoffet er polært eller upolært. pK
s
-værdiernes relevans skal ses på baggrund af
titreringen, men hvordan polariteten præcist har relevans forklares i forbindelse med beskrivelsen
STX 2.g
Aminosyre
pK
1
pK
2
Polaritet
Gly
2,34
9,60
mindre polær end
Asp, mere end Val
Val
2,32
9,62
Upolær
Cys
1,71
8,35
Polær
Asp
1,88
3,65
Mindre polær end Cys,
mere end Gly
Aarhus Katedralskole, 09/10 Kemirapport d. 4/5-10 [navn fjernet], 2.l
2
Første del af identifikationen af den ukendte aminosyre foregår ved et eksperiment, hvor
tyndtlagschromatografi benyttes.
Tyndtlagschromatografi, forkortet TLC kan eksempelvis bruges til at undersøge hvor mange
komponenter, der er i en bestemt opløsning eller – som i dette forsøg – bestemme identiteten af
forskellige stoffer.
Når denne metode bruges, udnytter man stoffers polaritet. Når man i sin analyse bruger
chromatografi, består dette af to faser, en stationær og en mobil fase. I dette forsøg er TLC den
stationære fase, mens løbevæsken er den mobile. TLC-pladen er belagt med cellulose, som er et
meget polært stof. Løbevæsken, derimod, er ikke så polær. Den består af en blanding af butan-1-
ol, ethansyre og deminiraliseret vand. De upolære aminer vil derfor følge den upolære løbevæske
op ad pladen, når væsken bliver absorberet i pladen. De polære stoffer derimod binder sig hurtigt
til den ligeledes polære TLC-plade.
Den ukendte aminosyre, vil følge én af de førnævnte aminers spor, og med sammenligning, vil det
være muligt at få en startidentifikation på hvilken aminosyre, der er den ukendte.
Ud over TLC-analyse, bliver den ukendte aminosyre titreret. Ved dette forsøg titreres aminosyren
med NaOH. Hvordan dette ser ud ses på min graf i databehandlingen. På denne graf vil det være
muligt at aflæse ækvivalsenpunkterne, og dermed finde halvækvivalenspunkterne. Det gælder, at
pH-værdien ved halvækvivalenspunktet er lig pK
s
-værdien, idet en syre titreres med en stærk base.
Ud fra følgende formel er det muligt at bestemme pH:
Når opløsningen er ved sit halvækvivalenspunkt er forholdet ml. syre og base lige 1, og derfor ses
der bort fra sidste led, da log(1) er lig 0. Derfor kan formlen også skrives således:
I tabellen på foregående side ses pK
s
-værdierne for de aminosyrer, der beskæftiges med i dette
forsøg.
Jf. forsøgsvejledningen forekommer aminosyren på forskellige former, alt afhængigt af pH-
værdien:
+
H
3
NCHRCOOH, hvilket er den form, forsøget starter med. Dette er syreformen af aminosyren.
+
H
3
NCHRCOO
-
, som er aminosyrens amfolytform. Dette betyder, at aminosyren kan være både
syre og base. Den ene ende vil fungere som base og derfor gerne optage en hydron, mens den
Aarhus Katedralskole, 09/10 Kemirapport d. 4/5-10 [navn fjernet], 2.l
3
anden ende gerne vil afgive én. Enderne er carboxylsyren hhv. aminogruppen. Denne har en
ladning på 0 og kaldes også for Zwitterion.
H
2
NCHRCOO
-
er baseformen af aminosyren.
Reaktionerne ved første og andet ækvivalenspunkt ser sådan ud:
Apparaturfortegnelse:
TLC med cellulosebelægning, glasplade, kapillærrør, blød blyant, petriskål, firkantet
glaselktrolysekar, skinkskab, føntørrer, pH-meter, burette, magnetomrører, magnet,
buretteholder, magnet, magnetomrører, bægerglas (250 mL), glastragt.
Kemikalier:
Asparagin, glycin, cystein, valin samt ukendt aminosyre – alle 0,1 M, butan-1-ol, konc. ethansyre,
deminiraliseret vand, ninhydrin 2 % i propanon, NaOH – 0,1 M.
S-sætninger: Ninhydrin: giftigt, konc. ethansyre: ætsende.
Udførelse:
Eksperimentet adskilt: en TLC-del og en titreringsdel.
TLC:
Pladen klippes således den passer til karet. Løbevæsken blandes af butan-1-ol, ethansyre og
demineraliseret vand i forholdet 60:25:25 (100 mL i alt). Løbevæsken hældes omkring 1 t cm op i
karet. I mens er der blevet tegnet med en blød blyant en streg omkring 1,5 cm fra nederste kant.
Derudover er der ligeligt fordelt 5 punkter med blyanten. På disse skal de 4 kendte og den 1
ukendte aminosyre påsættes. Omhyggelighed er nøgleordet, idet celluloselaget ikke må
beskadiges af blyanten. Kapillærrørene klargøres: opvarmet af gasflammen fra en
bundselbrænder, udtrækkes disse. Dette gøres således, at spidsen er mellem 1 og 2 cm lange.
Herpå podes med de 4 kendte aminosyrer og den ukendte – med hver sit kapillærrør. Hver
aminosyre påsættes ca. 5 gange hver, adskilt af indtørring.
Til sidst er det kun at placere TLC-pladen med aminosyrene i karet. Låget lægges på, og der ventes
til væskefronten er omkring 1 cm fra toppen, da denne ikke må løbe over. Ved dette punkt tages
pladen op, og denne tørres. Er man utålmodig kan en føntørrer benyttes.
Aarhus Katedralskole, 09/10 Kemirapport d. 4/5-10 [navn fjernet], 2.l
4
Efter dette dyppes hele pladen i en ninhydrinopløsning, som fordamper meget hurtigt. Endnu
engang skal pladen tørre. Når pletter tydeligt viser sig på pladen er det muligt at se hvordan den
ukendte aminosyre løber i forhold til de 4 kendte.
Da det ikke er sikkert at den ukendte aminosyre kun følger én bestemt kendt aminosyre, benyttes
titrering med NaOH.
Ved titreringen blandes 10,00 mL aminosyreopløsning med demineraliseret vand til et samlet
volumen på 100 mL i et 250 mL’s bægerglas. Magneten puttes i, og bægerglasset placeres på
magnetomrøreren. pH-meteret klargøres, idet den kalibreres ved brug af en pufferopløsning, hvis
pH-værdi er kendt. Efter dette anbringes elektroden i bægerglasset, men vær opmærksom på at
den ikke er så tæt på bunden at den kolliderer med magneten. Derefter klargøres buretten, hvor
natriumhydroxiden fyldes i, eventuelle lufthuller i buretten fjernes og burettestanden bliver
aflæst.
Herpå begynder titreringen. Efter hver tilsætning aflæses pH og burettestand. Det er vigtigt at
være nøjagtig og påpasselig, da blot en meget lille tilsætning vil ændre pH-værdien meget omkring
ækvivalenspunktet. Derfor: små tilsætninger.
Data:
I første del af bestemmelsen af aminosyren, foretoges en TLC-
analyse. Vores TLC-plade så således ud efter at været blevet
podet med de 4 kendte aminer samt den ukendte og at have
stået og ”trukket” i en del minutter:
Data for titreringen ses i vedlagte bilag.
Databehandling:
TLC:
Her er det tydeligt, at den ukendte aminosyre er løbet ligeså langt som Valin. Idet Valin løb så
langt op ad TLC-pladen og samtidig var den eneste upolære aminosyre – lig løbevæsken, er det
muligt at bestemme at Valin var den ukendte aminosyre.
Aarhus Katedralskole, 09/10 Kemirapport d. 4/5-10 [navn fjernet], 2.l
5
Titrering:
Ud fra aflæsning på grafen er det muligt at fastlægge ækvivalenspunkterne samt hvor mange mL
NaOH, der er tilsat ved dette punkt:
Ækvivalenspunkt 1: pH=6,4 Antal mL tilsat=8,2
Ækvivalenspunkt 2: pH=10,2 Antal mL tilsat=16,4
Disse data gør det muligt at beregne halvækvivalenspunkterne og derfor pK
s
-værdierne.
Mit første halvækvivalenspunkt må være efter 4,1 mL tilsat NaOH, idet det er halvt så meget som
tilsætningen ved første ækvivalenspunkt. pH aflæses til at være 2,8, og derfor må min pK
1
-værdi
være 2,8. Ud fra tabellen fra første side må den ukendte aminosyre være enten Valin eller Glycein,
da disses værdier er tilnærmelsesvis 2,8: 2,32 hhv. 2,34.
Afvigelsen er derfor:
2. halvækvivalenspunkt er pH=9,4, og dermed er pK
2
-værdien fundet. Dette stemmer også overens
med påstanden om at den ukendte aminosyre er Valin eller Glycein, da deres pK
2
-værdier er 9,62
hhv. 9,60.
Denne gang er afvigelsen:
0
2
4
6
8
10
12
14
25 30
pH
Tilsat ml NaOH
Titrering af ukendt aminosyre
Serie1
Aarhus Katedralskole, 09/10 Kemirapport d. 4/5-10 [navn fjernet], 2.l
6
Diskussion, fejlkilder og måleusikkerheder:
- Intervallet mellem NaOH-tilsætningsnoteringerne viste sig for stort, idet titreringskurven
havde relativt få punktet. Dette gjorde det sværere at aflæse halvækvivalens- og
ækvivalenspunkter.
- TLC-analysen gav en så tydelig indikation på hvilken aminosyre, den ukendte var, at
titreringen virkede næsten overflødig – dog underbyggede dette resultat blot, at det var
Val, der var x.
- TLC-analysen kunne sagtens have gået hen og blevet utydelig: mængden af stof, der blev
podet kunne have været for lidt. Var der blevet stukket hul med kapillærrøret på det tynde
lag cellulose, kunne dette også have gjort resultatet utydeligt.
- En grum fejl kunne have været, at kapillærrørene blev blandet sammen, så flere aminer
blev podet med samme. På den måde ville det have været umuligt at skelne den ene
aminosyre fra den anden.
- Den umiddelbart høje procentvise afvigelse ved første pK
s
-værdi skal ses i lyset af, at der
arbejdes med meget små tal. Derfor er en afvigelse på omkring 20 % faktisk ret lav.
- Ved 2. pK
s
-værdi er den procentvise afvigelse langt lavere, fordi tallene er højere, men
måske også målingerne er blevet mere præcise.
- Af måleusikkerheder skal nævnes aflæsningen af burettestanden og aflæsningen af
ækvivalenspunkter på grafen som de væsentligste.
- Hvis TLC-pladen bliver berørt, påvirker sveden fra hænderne resultatet. På den måde kan
der have været andre aminosyrer på TLC-pladen end de opgivne.
Konklusion:
Med blot TLC-analysen var det muligt at bestemme, hvilken aminosyre den ukendte var; nemlig
Valin. Titreringen underbyggede denne teori ved at passe med både Valin og Glycein, men idet
denne slet ikke stemte overens med TLC-analysen, var dette udelukket.
Både titreringen og TLC-analysen gav meget præcise og enslydende svar, hvilket gjorde
identifikationen klar og simpel.