Studieretningsprojekt
STX 3.g
1.
Summary
I have in my report chosen to engage myself in the world of food colorants. As a way of creating a
foundation for the learning’s of colorant chemistry, I start out with a tutorial in the basics of light
and colour. Here you’ll learn about the duality of light waves, electromagnetic waves, the visible
spectre, the energy of a photon, the law of Lambert-Beer and much more. After this short
walkthrough you will step into the world of molecule orbits, bindings and energy levels as I try to
explain the function of conjugated systems, colour leading, colour amplifying and other functional
groups that defines the coloured molecule.
A short section, explaining natural and synthetic colorants in food, and then we’ll be of to the
testing grounds! Here you will receive a little theory in the two ways to analyse our colorant, and
then we’ll get started. I will take you through a series of three experiments, first isolating the
colorants, then analysing the contents of our colorant, which will, if all goes well, end up with us
having measured the amount of food colour in a yellow soda. You can then see the result of our
experiment compared with the values posted in the positive list, which is a list that has been put up
by the health department to control the amount of colour in food. We might just be lucky enough to
catch a bunch of law-breakers, trying to dope us with large amounts of colour in our drinks.
Studieretningsprojekt
2.
Indholdsfortegnelse:
Summary ..................................................................................................................... 1
1. Indledning ............................................................................................................... 3
2. Farveteori, centrale og relevante begreber ...................................................... 4
2.1 To forskellige opfattelser af lys ........................................................................................ 4
2.2 Det synlige spektrum ........................................................................................................... 4
2.3 Fotonenergi ............................................................................................................................ 5
2.4 Lambert-Beers lov................................................................................................................ 6
3. Molekyler og farvedannelse ............................................................................... 7
3.1 Orbitaler .................................................................................................................................. 7
3.2 Bindinger og energiniveauer ............................................................................................. 8
3.3 Konjugerede systemer ......................................................................................................... 9
3.4 Farvebærende og farveforstærkende grupper ................................................................ 9
4. Levnedsmiddelindustriens farvestoffer .......................................................... 10
4.1 Naturlige farvestoffer ........................................................................................................ 10
4.2 Syntetiske farvestoffer ...................................................................................................... 11
4.3 ADI og positivlisten........................................................................................................... 11
5. Analysemetoder ....................................................................................................... 12
5.1 Chromatografi ..................................................................................................................... 12
5.2 Spektrofotometri ................................................................................................................. 13
6. Forsøg .................................................................................................................... 14
6.1 Isolering af farvestoffer ved hjælp af minikolonne ................................................... 14
6.2 Påvisning af farveindhold ved tyndtlagschromatografi ............................................ 16
6.3 Koncentrationsbestemmelse ved spektrofotometri .................................................... 20
7. Konklusion ........................................................................................................... 26
Litteraturliste ............................................................................................................ 27
Studieretningsprojekt
3.
1. Indledning
Jeg har i denne opgave valgt at beskæftige mig med farvestoffer, og under dette, farvning af
levnedsmidler. Mit valg er baseret på emnets relevans i forhold til min egen hverdag. Jeg vil
undersøge den grundlæggende farveteori og relevante begreber indenfor fysikken. Min
hovedbeskæftigelse vil dog ligge i selve molekylernes indvirkning i farvernes nuancer.
Mange levnedsmidler bliver i dag farvet for at fremme forbrugerens interesse og dermed salget
af fødevaren. Det har igennem tiden forårsaget sygdomme og dødsfald på grund af manglende
undersøgelser af tilsætningsstofferne. Fødevarestyrelsen har i dag opstillet positivlisten, som
angiver gyldige mængder tilsætning af forskellige farvestoffer. Jeg vil gennemgå to forskellige
grupper af farvestoffer, naturlige og syntetiske, deres forskelligheder og brugelighed i madvarer.
Med henblik på dette vil jeg, ved en række forsøg, undersøge mængden af farvestof i gul sodavand
og sammenligne resultaterne med de lovligt opstillede værdier i positivlisten.
Fig. 1
Opløsninger af Sunset Yellow og Tartrazin.
De to farvestoffer der er indeholdt i en Miranda.
Studieretningsprojekt
4.
2. Farveteori, centrale og relevante begreber
Et grundlæggende princip som må forstås inden vi kan bevæge os dybere ind i farvernes verden, er
det faktum at: Uden lys, ingen farver. Alt hvad vi ser, fra vi vågner om morgenen til vi igen ligger i
vores senge, er lys der er blevet produceret af, eller reflekteret på en genstand og derefter har nået
vores øjne. Faktisk er lys det eneste vores øjne kan se og jeg vil derfor ligge ud med en gennemgang
af det grundliggende omkring lyset og farverne.
2.1 To forskellige opfattelser af lys
Det er siden helt gamle dage blevet diskuterer, hvad er lys? Jeg vil ikke komme ind på den
historiske baggrund, men mange undersøgelser har nu vist, at lys besidder en dualitet, partikel-bølge
dualiteten. Det gælder for de to forskellige opfattelser:
Bølgemodel
Lys er elektromagnetiske bølger, der udbreder sig langs rette linier, og som herved overfører energi
med en konstant hastighed c, c = 3,0
10
8
m/s i vakuum.
1
Partikkelmodel
Lys er elektromagnetisk stråling, der består af rumligt afgrænsede energikvanter. Lyskvanterne
kaldes fotoner. De har ingen masse og bevæger sig med lysets hastighed c uafhængigt af hinanden.
2
Lys indeholder altså begge disse definitioner og de kan hver især bruges til at beskrive forskellige
egenskaber ved lyset. F.eks. bruger man bølgemodellen, da det er bevidst at lys besidder de samme
egenskaber som bl.a. vandbølger. Erfaringer som lysets refleksion eller de tre bølgeegenskaber,
bølger kan interferere, bølger kan gå om hjørner og bølger kan passere gennem hinanden, kan ikke
forklares med partikelmodellen. Derimod kan bølgemodellen ikke forklarer lysets overførsel af
energi til et stofs atomer og molekyler. Da vi har med farvestoffer at gøre, er det hovedsageligt
partikelmodellen vi interessere os for. Jeg vil i afsnit 2.3 komme nærmere ind på fotoners energi og
i afsnit 3 vil jeg give en dybere forklaring på fotonernes påvirkning af atomer og molekyler.
2.2 Det synlige spektrum
1
Parbo, Henrik: ”Bag den farvede virkelighed”, 1986, systime a/s, s. 12
2
Parbo, Henrik: ”Bag den farvede virkelighed”, 1986, systime a/s, s. 13
Studieretningsprojekt
5.
Fig. 3
Synligt lys dækker kun en meget lille del af det
elektromagnetiske spektrum og har bølgelængder
der bevæger sig mellem 380 og 780 nm.
Fig. 2
Lysbølge
Ligesom vandbølger består lysbølger af energi der vibrere op og ned i lige vinkler på bølgens
retning. Lysbølger er dog en smugle mere komplicerede. En lysbølge består af energi i form af
elektriske og magnetiske felter og kaldes også for elektromagnetisk stråling. Felterne vibrere i lige
vinkler på bølgens retning og på hinanden, som det ses på fig. 2.
3
Lysbølger kommer i mange forskellige størrelser, som er bestemt efter bølgelængden.
Bølgelængden er defineret som længden mellem sammenhængende punkter på bølgen, f.eks. fra
bølgetop til bølgetop. Synligt lys har bølgelængder der befinder sig indenfor 380 til 780 nm og er en
meget lille del af det elektromagnetiske spektrum, se fig. 3.
2.3 Fotonenergi
Fotoners energi er, som jeg vil komme ind på i
afsnit 3, en vigtig bestanddel i farvestoffernes
kemi. Jeg vil derfor udlede formlen for
fotonenergien og dens sammenhæng med bølgelængden, som også er en brugbar størrelse indenfor
farvekemi.
Bølger er et periodisk fænomen og perioden kan defineres som tid pr. gentagelse. Altså tiden det
tager for en bølgelængde at passere. Frekvens er en anden måde til beskrivelse af lysbølger.
Frekvensen svarer til gentagelse pr. tidsenhed og kan skrives,
T
f
1
, hvor T svarer til perioden.
Da lysbølgen i løbet af perioden T netop tilbagelægger en bølgelænge og farten er defineret ved den
tilbagelagte strækning pr. tidsenhed, kan lysbølgens udbredelsesfart c skrives,
T
c
. Vi kan nu
omskrive så vi får,
f
T
c
1
. Der er altså en sammenhæng mellem lysets hastighed,
bølgelængde og frekvens.
Energien for en foton er proportional med lysets frekvens og det gælder at,
fhE
foton
, hvor h
er Plancks konstant og har værdien
sJh
34
,6
.
4
Vi kan nu omskrive formlen ved
hjælp af vores forrige konstateringer og udregne fotonenergien ved brug af bølgelængden,
3
http://science.howstuffworks.com/light2.htm
4
Hartling, Niels m.f.: ”Spektrum – fysik II“, 2004, Gyldendal, s. 152
Studieretningsprojekt
6.
Fig. 4
Det er med et prisme muligt at spalte
hvidt lys i dets farver.
Fig. 5
Farvecirklen -
komplementærfarve
ch
fhE
foton
. Værdien for
mJch
25
106445,198
. Fotonenergien for fotoner i
det synlige spektrum, ligger altså imellem,
J
m
ch
ogJ
m
ch
19
7
19
7
10227,5
10380
10547,2
10780
.
2.4 Lambert-Beers lov
Der er flere forskellige måder at ”fremtvinge” farvet lys fra det hvide lys, der jo som sagt består af
alle farver i det synlige spektrum. En af de mere berømte er Newtons forsøg med prisme. Da
farverne bevæger sig med forskellige hastigheder igennem prismens materiale, får de forskellige
afbøjningsvinkler og det vide lys spaltes i det synlige spektrum, se fig. 4.
Farvestoffer har dog en anden måde at ”fremtvinge”
farverne på. Som jeg senere vil forklarer absorbere
farvestofferne lys med bestemte bølgelængder, hvorved
stoffet antager farve som komplementærfarven til den absorberede farve. På fig. 5 ses
komplementærfarverne sat op over for hinanden.
Der er opstillet en formel der viser sammenhængen mellem et farvestofs absorbans og
farvestoffets koncentration i en given blanding. Denne ligning hedder
Lambert-Beers lov og ser ud som følgende:
A = ε
λ
· c · l
A = absorbansen, c = stofmængdekoncentrationen, l = lysvejlængden i opløsningen
ε
λ
= en konstant der kaldes, den molare ekstinktionskoefficient og som afhænger af bølgelængden.
Det kan på formlen ses at, hvis bølgelængden og lysvejlængden holdes konstant, er der en lineær
sammenhæng mellem absorbans og koncentration og formlen kan omformuleres til:
A = k · c
Man kan ved at måle absorbansen for en række kendte opløsninger opstille, hvad der kaldes en
standardkurve, med absorbansen som funktion af koncentrationen. Det skulle gerne danne en ret
linie med k som hældningskoefficient. Denne formel skal også bruges i vores senere forsøg med
spektrofotometer.
Studieretningsprojekt
7.
Fig. 6
De tre p-orbitaler,
p
x
, p
y
og p
z,
har
symmetriakser
vinkelret på
hinanden.
3. Molekyler og farvedannelse
Hovedprincippet bag farvestoffernes ”farvedannelse” ligger i stoffernes absorbtion af lys i det
synlige spektrum. Farvestofferne absorberer fotoner med energiniveauer der befinder sig inden for
det synlige spektrum, hvorved elektronerne i de enkelte molekyler eller ioner exciteres til et højere
energiniveau. For at kunne absorbere synligt lys kræver det at molekylerne kan absorbere
fotonenergier der svarer til bølgelængder befindende sig indenfor 380 til 780 nm. Jeg vil i det
følgende give en forklaring på hvordan orbitaler og bindingstyper ændrer på molekylernes
absorbtionsenergier. Dvs. den energi der kræves for, at en elektron i det givne molekyle, kan
bevæge sig fra sin grundtilstand og op i anslået(exciteret) tilstand.
3.1 Orbitaler
Først er vi nødt til at vide noget grundlæggende om atomer og deres opbygning. Atomer er
opbygget af en kerne, bestående af protoner og neutroner og uden om den kerne befinder
elektronerne sig. I farvestoffernes verden er det elektronerne og deres fordeling omkring
atomkernen, der er det interessante.
Elektronerne bevæger sig i nogle bestemte baner omkring atomkernerne, i forskellige niveauer
kaldet atomets skaller. De baner elektronerne bevæger sig i kaldes atomorbitaler og der findes flere
forskellige orbitaler med forskellige energiniveauer, dem vi vil fokusere på er s-orbitalerne og
hovedsageligt p-orbitalerne. Egentlig kan man ikke kalde elektronernes baner
for bestemte, idet man ikke ved præcis, hvor elektronerne befinder sig.
Orbitalerne er i stedet et udtryk for, hvor der er størst sansynlighed for at finde
de elektroner der cirkler om kernen, og de afbildes derfor som elektronskyer. I
s-orbitalerne bevæger elektronerne sig rundt om kernen i en cirkel og skyen
har form som en kugle. P-orbitalens elektronsky har form som to dråber, hvor
den spidse ende peger ind mod atomets kerne. Første skal består af en s-
orbital og anden skal består af en s-orbital og tre p orbitaler. Alle skaller med undtagelse af første
indeholder tre p-orbitaler der hver i sær er rotationssymmetriske omkring en akse og med
symmetriakser der står vinkelrette på hinanden, se fig. 6.
Studieretningsprojekt
8.
Fig. 7
Nitrogens
eletkronfordeling
med sorte pile.
Neon med ekstra 3
(blå).
Fig. 8
En kovalent binding mellem to s-
orbitaler, kaldes en
(sigma)-
binding.
Fig. 9
-orbital (antibindende
orbital)
I hver orbitale kan opholde sig to elektroner, men kun hvis de har modsat spin. Elektronerne roterer
om sig selv samtidig med deres rotation om atomet og danner, på grund af deres ladning, en lille
magnet. Elektronernes spin angives med pile, , hvilket svarer til højre og venstre spin.
5
De
forskellige skaller har forskellige energier og det samme har orbitalerne. Elektronerne vil altid
fordele sig så det kræver mindst mulig energi og så spredt så muligt. På fig. 7 ses atomerne nitrogen
og neons elektronfordeling som eksempel.
3.2 Bindinger og energiniveauer
Når to atomer binder sig i en kovalent binding, vil det sige at de deler en
elektron fra hver imellem sig og danner et fælles elektronpar. Et eksempel
kunne være dihydrogen:
H
+ H
H H
Elektronerne befinder sig ikke længere i hver deres atomorbital, men i en samlet molekylorbital. På
fig. 8 ses et eksempel på den simpleste binding, hvilket er en binding mellem to s-orbitaler. En
sådan binding kaldes for en -binding og alle enkeltbindinger er -bindinger. Da det gælder, at der
altid dannes ligeså mange molekylorbitaler som der
oprindeligt var atomorbitaler, må der være to forskellige
molekylorbitaler.
6
Det er også tilfældet. Der dannes den
bindende molekylorbital, der fører til overlap, som det ses på fig. 8 og den anti-bindende
molekylorbital(angives ved ) uden overlap, se fig. 9. Dette fænomen ligner det man ser hos bølger,
hvor to bølgetoppe forstærker hinanden, hvorimod en bølge top og en bølgedal svækker hinanden
(konstruktiv og destruktiv interferens).
7
Og nu begynder det at blive
interessant.
Den bindende molekylorbital har en lavere energi end den anti-
bindende molekylorbital og er derfor den ”foretrukne” tilstand for molekylet. Det er dog muligt, ved
absorbtion af en foton, altså lysenergi, at en elektron bliver exciteret og springer fra en bindende til
en anti-bindende orbital. For et molekyle som kun består af sigma-bindinger er energiforskellen
mellem - og
-orbitaler dog så stor at det kræver ultraviolet lys at excitere elektronerne.
8
Det er
5
Parbo, Henrik: ”Bag den farvede virkelighed”, 1986, systime a/s, s. 33
6
http://homepage.svendborg-gym.dk/rk/kemi/noter-b/orbitaler/orbitaler2.htm
7
Parbo, Henrik: ”Bag den farvede virkelighed”, 1986, systime a/s, s. 34
8
Parbo, Henrik: ”Bag den farvede virkelighed”, 1986, systime a/s, s. 35
Studieretningsprojekt
9.
Fig. 10
Bindende og anti-bindende p-orbitaler.
Fig. 11
System af konjugerede
dobbeltbindinger
Tabel 1
for to rotationssymetriske p-orbitaler også muligt at danne en bindende -bindinger og en
antibindende
. Men lidt sjovere bliver det, hvis der er tale om orbitaler som ikke er
rotationssymmetriske, f.eks. to p
y
-orbitaler. De kan minde om to parallelle sløjfer og danner, hvad
der kaldes en -binding. Der findes for -bindinger også to forskellige orbitaler. Den bindende -
orbital og den anti-bindende
-orbital, se fig. 10. Energiforskellen mellem en - og en
-binding
er ikke så stor som den er hos sigma-bindinger. Det kan også ses at elektronskyen ikke er så
konsentreret imellem atomerne i pi-bindingen. Der skal altså ikke så høj en foton-energi til at
excitere en elektron i en -binding som i en -binding.
3.3 Konjugerede systemer
Konjugerede systemer består af C-atomer, hvor hver
anden binding er en enkeltbinding C – C og hver anden består af en dobbeltbinding C = C, se fig.
11. En dobbeltbinding indeholder en af de før omtalte -bindinger og en -binding. Det at der kun
befinder sig én enkelt enkeltbinding imellem dobbeltbindingerne, gør at elektronerne i -orbitalerne
breder sig ud over enkeltbindingerne. På den måde bliver bindingerne ”svagere” og det kræver
dermed ikke så stor en energi at excitere elektronerne i molekylets -bindinger. Dvs. at energien
mellem de bindende og de anti-bindende orbitaler, omtalt i
forrige afsnit, falder. Når et molekyle indeholder over 8
konjugerede dobbeltbindinger er dets absorbtionsenergi faldet i en sådan grad, at det er muligt for
molekylet at absorbere fotonenergier der befinder sig indenfor det synlige spektrum.
9
Konjugerede
dobbeltbindinger er meget almindeligt at finde i farvestoffer.
3.4 Farvebærende og farveforstærkende grupper
Farvebærende grupper, mere korrekt kaldet chromofore grupper, er grupper der mindsker
arbsorbtionsenergien for molekylet de er bundet i. Måden de gør det på er ved, enten at indeholde
en dobbeltbinding eller ledige elektronpar, eller begge dele. Virkningen af det ledige elektronpar,
forklares ved, at dets orbitalenergi befinder sig et sted mellem de bindende -obitaler og de
antibindende
-orbitaler. Det betyder at forskellen mellem den højest optagede orbitalenergi,
energien for det ledige elektronpar, og energien for den laveste ubesatte
-orbital formindskes
9
Parbo, Henrik: ”Bag den farvede virkelighed”, 1986, systime a/s, s. 36
Studieretningsprojekt
10.
Fig. 12
Strukturformel
-caroten
betragteligt. Hvis man f.eks. udskifter en C=C i et konjugeret system med en N=N, som indeholder
to ledige elektronpar, kan man sænke molekylets absorbtionsenergi lige så meget som mange ekstra
konjugerede led med C=C.
10
Auxochrome grupper er det som man kalder for farveforstær-kende grupper. Disse grupper
forøger molekylets absorbtion og gør farven mere intens, men de rykker ikke på
absorbtionsbølgelæng-den og ændre derfor ikke på stoffets farve. De auxochrome grupper,
”skubber” deres ledige elektronpar ind i et system af konjugerede dobbeltbindinger og forøger på
den måde farveinten-siteten. Se tabel 1 for en oversigt over enkelte chromofore og auxochrome
grupper.
4. Levnedsmiddelindustriens farvestoffer
Levnedsmiddelkemien har inddelt farvestofferne i en række af forskellige grupper. Først bestemmes
det om der er tale om farvestoffer eller pigmenter, alt efter stoffets opløselighed i vand
(farvestofferne er de opløselige). Derefter om det er syntetiske,
naturlige, natur-identiske eller uorganiske pigmenter. Jeg vil nu
kort komme ind på nogle hovedgrupper af naturlige og syntetiske
farvestoffer, til brug i levnedsmidler.
4.1 Naturlige farvestoffer
Polyener, xanthofyller og anthocyaniner er nogle af de mest brugte
naturlige farvestoffer indenfor levnedsmiddelindustrien. Polyenere
er umættede kulbrinter der indeholder mange konjugerede dobbeltbindinger. Et eksempel på en
polyene er farvestoffet -caroten, se fig. 12.
-caroten er et natur-identisk farvestof, idet det findes i naturen, men fremstilles syntetisk.
Xanthofyller og anthocyaniner er eksempler på carotenlignende forbindelser.
10
Parbo, Henrik: ”Bag den farvede virkelighed”, 1986, systime a/s, s. 38
Chromofore
grupper
Auxochrome
grupper
C=O
-NH
2
-N=N-
-OH
-N=CH-
-SH
-NO
2
-N=O
Studieretningsprojekt
11.
4.2 Syntetiske farvestoffer
Azofarvestofferne er blandt de vigtigste, mest omdiskuterede, syntetiske farvestoffer. Som det
fremgår af navnet er azofarvestofferne kendetegnet ved at indeholde en eller flere chromofore
azogrupper(-N=N-).
11
Tartrazin og Sunset Yellow(fig. 19 og 20), som vi senere skal arbejde med i
vores forsøg, er eksempler på azofarvestoffer der bruges i levnedsmidler.
4.3 ADI og positivlisten
Positivlisten er en liste der er opstillet af levnedsmiddelstyrelsen, da det har vist sig at nogle
farvestoffer kan forsage kraft og allergi ved indtagelse af for store mængder. Den beskriver, hvilke
madvarer farvestoffer må forekomme i og i hvilke mængder. Der indgår i positivlisten 7
azofarvestoffer, som er de farvestoffer der hidtil har været mest omtalt, idet de siges at være de mest
skadelige. Der findes også maksimal-værdier for tilsæting af enkelte natur-identiske farvestoffer.
ADI står for acceptabel daglig indtagelse og er angives i mg pr. kg legemsvægt. Den er opstillet af
en gruppe politisk uafhængige forskere, da de mener at nogle farvestoffer er tilladt på grund af
økonomiske fordele.
11
Parbo, Henrik: ”Bag den farvede virkelighed”, 1986, systime a/s, s. 39
Studieretningsprojekt
12.
Fig. 14
Tyndtlagsplade nedsænket i
chromatografikar.
Fig. 13
Tyndtlagsplade
klar til chro-
matografering.
5. Analysemetoder
Jeg gennemgår i dette afsnit principperne for og teorien bag de to analysemetoder, chromatografi og
spektrofotometri, som jeg senere vil bruge i mine forsøg med farvestoffer. Emner jeg ikke tager fat
i, i dette afsnit, som f.eks. fordele og ulemper, findes under gennemgangen af forsøgende.
5.1 Chromatografi
Formålet med chromatografi er at bestemme hvilke forskellige stoffer en blanding indeholder. Der
er flere former for chromatografi, men den vi bruger i vores senere forsøg kaldes tyndtlagschroma-
tografi.
Ideen bag tyndtlagchromatografi er, at udnytte stoffers opløselighed i forskellige væsker til at
adskille stofferne i en blanding, for på den måde at finde blandingens sammensætning. Forsøg med
tyndtlagschromatografi udføres på en plade af f.eks. aluminium, hvilket er tilfældet i det forsøg jeg
senere vil komme ind på. Denne plade er belagt med et tyndt lag af et fast, porøst stof. Til
”opløsning” af de stoffer der ønskes undersøgt, laves nu hvad man kalder for en løbevæske. Årsagen
til navnet er at væsken ”løber” op af vores plade når denne sænkes ned i væsken. Det der sker er, at
det tynde porøse lag på pladen begynder at suge væske op, men før dette skal vi tilføje vores
opløsninger til pladen. Der tegnes en startlinie med blød blyant, for ikke at
beskadige det porøse lag, og de ønskede stoffer prikkes på pladen, ved
startlinien, se fig. 13. En nærmere beskrivelse af hvordan dette gøres findes
under forsøg 6.2.
Som det ses på fig. 13 er der på-prikket opløsninger af f.eks. to kendte
stoffer A og B. Disse opløsninger består af to rene stoffer som vi kalder referencestoffer og vores
formål er at undersøge, hvor vidt disse stoffer befinder sig i vores (ukendte) blanding. Dette gøres
ved, at nedsænke en lille del af tyndtlagspladen i løbevæsken som befinder sig i et chromatografikar
(fig. 14).
Når det porøse stof, som nævnt, suger løbevæsken op, vil denne passere startlinien med vores
opløste stoffer og disse vil i en vis grad bevæge sig op ad pladen
sammen med løbevæsken. Hvor opløseligt et stof er i
løbevæsken og den grad stoffet binder sig til pladens materiale
definere hvor villigt stoffet følger med løbevæsken. På det tidspunkt, hvor løbevæsken næsten er
Studieretningsprojekt
13.
Fig. 16
Simpel skitse af et
spektrofotometer.
Fig. 15
Tyndtlagchromatogram
efter chromatografering.
steget til pladens overkant, tages tyndslagspladen op af karet. Pladen kan da, muligvis se ud som på
fig. 15.
Vi kan se at blandingen består af mindst to forskellige stoffer. Referencestof B er løbet præcis
lige så langt som det ene af stofferne i blandingen. Det betyder at der er en mulighed for at
blandingen inde-holder stof B. Derimod kan vi med sikkerhed sige at
blandingen ikke indeholder referencestof A, da ingen af stofferne i
blandingen har samme placering. For med sikkerhed at påvise
tilstedeværelsen af stof B i blandingen, kræver det at man laver en
række forsøg med forskellige løbevæsker. Hvis blandingen fortsat, på
de nye chromato-grammer, danner en plet med samme placering som
stof B, er det påvist at blandingen indeholder dette stof.
5.2 Spektrofotometri
Som nævnt i afsnit 2.4 er der flere forskellige måder at ændre på synligt lys og skabe en
farvedannelse, altså lys med bestemte bølgelængder. Spektrofotometri er en måde at analysere lys
der passerer igennem en (farvet) opløsning, altså en farvedannelse ved absorption. I denne farvede
opløsning befinder der sig en ion eller et molekyle som kan absorbere det synlige lys, derfor
farvedannelsen. I et spektrofotometer måler man den lysabsorberende ions absorbans, hvilket f.eks.
kan have til formål at finde ionens koncentration i opløsningen. Et spektrofotometer er (lidt simpelt)
opbygget som det ses på fig. 16.
Lyset fra spektrofotometerets lyskilde passerer igennem en
monokromator, så vi får monokromatisk lys, dvs. lys med en bestemt
bølgelængde. Derefter passere lyset igennem den opløsning, hvis absorbans skal måles. Noget af
lyset bliver da absorberet af de absorberende molekyler eller ioner. Da det har passeret opløsningen
måles intensiteten af lyset med en fotocelle.
12
Jeg vil i forsøg 6.3 give en nærmere beskrivelse
omkring brugen af spektrofotometri og komme med eksempler på, hvordan man kan bruge sine
måleresultater.
12
Mygind, Helge: ”Kemi 2
3 - øvelser”, 1991, P. Haase & Søn, s. 230
Studieretningsprojekt
14.
Fig. 18
Minikolonne sammensat
med sprøjte og i brug
Fig. 17
Lille udsnit af kolonnematerialets
polymere struktur.
base-form
syre-form
6. Forsøg
6.1 Isolering af farvestoffer ved hjælp af minikolonne
Formål:
Formålet med den første del af vores forsøg, vores brug af minikolonne, er at isolere og
opkoncentrere farvestofferne i en Miranda (gul sodavand). Hensigten med dette er, at vi senere kan
bruge de isolerede farvestoffer i vores forsøg med chromatografi og spektrofotometri.
Teori:
Minikolonne:
En minikolonne består af en væskebeholder hvori der befinder
sig et kolonnemateriale, se nederst på fig. 18. Dette materiale består af en polymer forbindelse af
oxygen og silicium. Til
nogle af siliciumatomerne er bundet et radikale. I vores forsøg bruger vi en kolonne af typen
aminopropyl. Dvs. at en amino-
propylgruppe er bundet til nogle af siliciumatomerne, som det
ses på fig. 17. Formålet med disse grupper ligger i deres basiske
egenskaber. Ved at presse en sur opløsning igennem kolonnen
omdannes aminogruppen til dens korresponderende syre, dette
ser således ud:
Da farven hos de syntetiske farvestoffer hovedsageligt er knyttet til de negative ioner (se fig. 19 og
20) som SO
3
-
, og ikke f.eks. den positive Na
+
, vil der ske en ionbytning mellem de negative
farvestof-ioner og den negative syrerest. Altså vil Farvestoffet, når det presses igennem kolonnen,
binde sig til de positivt ladede grupper i kolonne-materialet. Neutrale molekyler som f.eks.
sukkermolekyler i en sodavand vil passere igennem kolonnen. Ved nu at sende en basisk opløsning
Si-CH
2
CH
2
CH
2
NH
2
+ H
3
O
+
Si-CH
2
CH
2
CH
2
NH
3
+
+ H
2
O
Studieretningsprojekt
15.
igennem minikolonnen, med en høj pH-værdi, får man igen kolonnen på baseform.
Aminopropylgrupperne mister deres positive ladning og binder ikke længere farveionerne. Man kan
uden den store mængde base få farvestofferne ud af kolonnen og kan derved komme op på større
koncentrationer af farvestof. Samtidig er farvestoffet blevet adskilt fra mange af de andre stoffer,
som er i det levnedsmiddel vi skal analysere. Det er en stor fordel når vi senere skal bruge det i
chromatografi og spektrofotometri.
Apparatur og kemikalier:
10 mL sprøjte. Adapter. Dråbepipette. Bægerglas. Minikolonne med kolonnemateriale af typen
aminopropyl.
1 M NH
3
(ammoniakvand). 1 M CH
3
COOH(eddikesyre). Miranda(gul sodavand).
Fremgangsmåde:
a. Vi gør minikolonnen klar til brug ved sende en opløsning af 1 M eddikesyre igennem
kolonnematerialet. Det gør vi ved at montere sprøjten på kolonnen og trykke let på stemplet.
Aminopropylgrupperne kommer derved i deres syreform og er klar til at modtage vores
farvestof(fer).
b. Nu afvejer vi 25 mL Miranda med dråbepipette. Derefter sender vi det igennem vores
klargjorte minikolonne, det gentages til al Miranda er sendt igennem.
c. Vi kan nu se at vores farvestoffer fra mirandaen er bundet til kolonnematerialet og væsken
der er dryppet ud er klar og uden farve. For at få vores farvestoffer ud af kolonnen afmåler
vi nu med dråbepipette 10 mL NH
3
som vi sender igennem minikolonnen. På den måde
kommer kolonnematerialet igen på base-form og farvestoffet, der ikke længere er bundet i
kolonnen, siver ud med ammoniakvandet.
Fejlkilder:
Minikolonnen er ikke kommet fuldstændig på syreform og binder derfor ikke alle
farvemolekylerne.
Det lykkedes ikke at udtrække al stoffet af minikolonnen.
Studieretningsprojekt
16.
Konklusion:
Det er muligt, ved hjælp af minikolonne, at isolere og opkoncentrere et farvestof, som på den måde
senere kan bruges til chromatografi og spektrofotometri.
6.2 Påvisning af farveindhold ved tyndtlagschromatografi
Formål:
Vi er i dette forsøg i besiddelse af vores opkoncentrerede farvestof fra mirandaen og en grøn
frugtfarve til indfarvning af konfekt. Formålet med forsøget er, ved hjælp af tyndtlagschroma-
tografi, at finde frem til, hvilke farvestoffer de to væsker indeholder. Da vores opløsninger stammer
fra indkøbte levnedsmidler er det dog angivet hvilke farvestoffer væskerne indeholder. Vores
formål må da være at tjekke korrektheden i disse angivelser. Vi skal kende farvestofferne i
opløsningen til vores senere forsøg med spektrofotometer.
Teori:
Se afsnit 5.1 omkring chromatografi.
Apparatur og kemikalier:
Tyndtlagsplader af aluminium med porøst stof værende, 4 plader med cellulose og 4 plader med
kiselgel. Smeltepunktsrør. 6 små bægerglas. 4 store bægerglas. 4 glasplader. Bunsenbrænder.
Dråbepipette med stativ, til at lave løbevæsker.
Grøn frugtfarve.
Angivne farvestoffer: Quinolingult (E 104) og Brilliant Blue FCF (E 133).
Da vi ikke er i besiddelse af farvestoffet Brilliant Blue FCF vil mit formål med chromatografering
af vores grønne frugtfarve, bestå i at afprøve korrektheden af vores tyndtlagschromatografiske
undersøgelser. Til forsøget bruges derfor opløsninger af Quinolingult og et andet blåt farvestof,
Brilliant Blue G, som referencestoffer.
Miranda.
Angivne farvestoffer: Sunset Yellow (E 110) og Tartrazin (E 102).
Studieretningsprojekt
17.
Til forsøget vil vi bruge en opløsning af Sunset Yellow og Tartrazin som referencestoffer.
Løbevæske 1: 37 mL 2-propanol. 2,5g CCl
3
COOH. 11 mL H
2
O. 2 mL 1,0 M NH
3
.
Løbevæske 2: 25 mL 2-butanol. 17 mL ethanol. 10 mL H
2
O. 7,5 mL 1,0 M NH
3
.
Fremgangsmåde:
a. Vi starter med at lave de to løbevæsker. Det foregår med dråbepipette. Derefter fordeler vi
løbevæske 1 i to store bægerglas. Bægerglas 1 og 2. Løbevæske 2 fordeles i bægerglas 3 og
4 og alle fire bægerglas dækkes af en glasplade. Det gør vi allerede nu, da bægerglassene
skal nå at fyldes med væskedamp inden de bruges til chromatografi.
b. Med bunsenbrænder opvarmer vi midten af vores smeltepunktsrør, imens vi hiver let i begge
ender. Når røret bliver tyndt på midten tager vi det af flammen og knækker det over på
midten. Vi har nu to tilspidsede glasrør som vi skal bruge til påsætning af vores pletter. Dem
laver vi 6 af. En til hver farveopløsning.
c. I fire af de små bægerglas laves vi en vandig opløsning af hvert farvestof. Vores to
farveblandinger hældes i de sidste to bægerglas.
d. Vi tegner nu en startlinie på de otte tyndtlagsplader, se afsnit 5.1 fig. 13.
e. Vi er klar til, med de tilspidsede glasrør, at prikke vores farvestoffer på tyndtlagspladerne.
Prikkerne skal ikke være mere end et par millimeter i diameter, men farven skal dog være
tydelig. Efter at blandingerne er tilføjet til pladerne og løbevæskerne har befundet sig ca. en
halv time i chromatografikarrene sænker vi tyndtlagspladerne ned i karrene med
løbevæsken. Påprikning af opløsninger og valg af bægerglas/chromatografikar gør vi i
følgende orden:
Studieretningsprojekt
18.
f. Når løbevæsken næsten er nået til pladens overkant tager vi den op af chromatografikarrene.
Resultater:
Diskussion af resultater
Det er for alle tyndtlagschromatogrammerne, hvor der er påført pletter af miranda, tartrazin og
sunset yellow, muligt at se overensstemmelsen i deres placeringer. Vores opkoncentrerede farvestof
fra mirandaen, har delt sig i to pletter, og den gule og den orange plet befinder sig, næsten præcist
ud for henholdsvis tartrazinpletten(den gule) og pletten fra sunset yellow(den orange).
Det samme gælder for tyndtlagschromatogrammerne, hvor der er påført grøn frugtfarve.
Frugtfarven har tydeligt delt sig i to pletter, hvor den gule befinder sig på linie med den gule plet fra
quinolingult. Den blå Brilliant Blue G, som ikke fandtes i den grønne frugtfarve, skulle ikke befinde
sig på niveau med den blå Brilliant Blue FCF fra frugtfarven. Det er heller ikke tilfældet i
forsøgende med Cellulose som det porøse stof, men i forsøgende med kiselgel ligger de to blå
næsten på samme niveau.
Grøn frugtfarve på
cellulose,
1. løbevæske
Miranda på
cellulose,
1. løbevæske
Grøn frugtfarve på
cellulose,
2. løbevæske
Miranda på
cellulose,
2. løbevæske
Kiselgel, 1
løbevæske
Kiselgel, 1
løbevæske
Miranda på
kiselgel,
2. løbevæske
Kiselgel, 1
løbevæske
Miranda på
kiselgel,
1. løbevæske
Grøn frugtfarve på
kiselgel,
1. løbevæske
Grøn frugtfarve på
kiselgel,
2. løbevæske
Studieretningsprojekt
19.
Fig. 19
Tartrazin
Fig. 20
Sunset Yellow
Fejlkilder:
Hvis chromatografikarrene ikke når at blive fyldte med damp fra løbevæsken.
Blyanten presses for hårdt og ridser det porøse materiale.
Pletterne ikke når at tørre inden de sænkes ned i karrene.
For meget farve kommes på tyndtlagspladerne og den flyder ud.
Konklusion:
Jeg kan ud fra forsøget, med rimelig sikkerhed, konkludere at mirandaen indeholder stofferne
tartrazin og sunset yellow, fig. 19 og 20. Jeg kan også konkludere at den grønne frugtfarve
indeholder quinolingult og ikke brilliant blue FCF, men det var dog nødvendigt at måle på både
cellulose og kiselgel for at kunne konkludere det, da det på kiselgel godt kunne ligne at brilliant
blue G ligger på linie med det blå farvestof i den grønne frugtfarve. Jeg kan også konkludere at
dette forsøg er stærkt præget af forskellige fejlkilder, da det tog os flere forsøg at opnå et passende
resultat. Vi burde også have ventet længere tid inden vi tyndtlagspladerne op af karrene, så
afstanden mellem de forskellige farver, muligvis var blevet tydeligere. Til sidst kan jeg dog også
konkludere at det ved tyndtlagschromatografi er muligt at finde indholdet af en given opløsning.
SO
3
-
Na
+
Na
+
O
3
-
S
OH
N
N
Na
+
O
3
-
S
SO
3
-
Na
+
COO
-
Na
+
N N
OH
N
N
Studieretningsprojekt
20.
6.3 Koncentrationsbestemmelse ved spektrofotometri
Formål:
Vi er nu klar over hvilke farvestoffer en Miranda indeholder. Formålet med dette forsøg er, ved
farvestoffernes absorbtion i et spektrofotometer, at finde koncentrationen af Tartrazin og Sunset
Yellow i en Miranda og sammenligne vores resultater med værdierne fra positivlisten.
Teori:
Se afsnit 2.4 omkring absorbtion, komplimentærfarver, Lambert-Beers lov og standardkurver. Se
afsnit 5.2 omkring spektrofotometri.
Apparatur og kemikalier:
Dråbepipette med stativ. Bægerglas. 2 1L volumenflasker. Vernier spektrofotometer.
Demineraliseret vand.
0,5 M eddikesyre-acetatpuffer. 10 mL opkoncentreret farveopløsning fra Miranda (fra forsøg 6.1
med minikolonne). Farvestoffer: Sunset Yellow og Tartrazin.
Fremgangsmåde:
a. Det første vi gør er at lave en opløsning med hver af vores to farvestoffer. Koncentrationen
af opløsningerne skal være på 50,0 mg/L. Halvtreds milligram afvejes af hvert af de to
farvestoffer og hældes i hver deres volumenflaske. Vi fylder flaskerne op til 1L mærket og
har nu lavet vores opløsninger.
b. Vi skal lave den før omtalte standardkurve. For at kunne lave standardkurverne for vores
farveopløsninger, skal vi kende til farvestoffernes absorptionsmaksimum, men før vi finder
dette vil vi lave de opløsninger der skal bruges i vores standardkurver. I hver af disse
opløsninger vil vi komme 5,0 mL 0,5 M eddikesyre-acetatpuffer, hvilket svarer til 1/10 af
opløsningens volumen. Dette gøres for at sikre at opløsningen beholder samme pH-værdi,
da nogle farvestoffer er afhængige af denne. Opløsningerne laver vi efter følgende tabeller:
Studieretningsprojekt
21.
Tabel 2
Tartrazinopløsninger
til brug i
standardkurve
Tabel 3
Opløsninger af
Sunset Yellow til
brug i standardkurve
c. Vores opkoncentrerede opløsning af farvestof fra mirandaen blev dannet af 25mL miranda
og opkoncentreret til 10mL. Vi fortynder den nu med 15mL demineraliseret vand så den
igen har samme koncentration som før vores brug af minikolonne. Derefter fortynder vi
opløsningen 1/10, dvs. med 25mL opløsning til 225mL demineraliseret vand. Dette gøres
for at vi kan måle på opløsningen med spektrofotometeret.
d. Vi forbinder nu spektrofotometeret via et USB kabel, med en computer og starter
programmet LoggerPro. For brug af program og spektrofotometer, se vedlagte bilag (1),
afsnit: Klargøring og kalibrering af Vernier spektrofotometer, punkt 1 – 9.b.
e. Absorbtionkurverne finder vi med standardopløsninger af vores to farvestoffer, og vi får
absorbtionsmaksimum til:
Absobtionsmaks tartrazin: 430 nm
Absorbtionmaks sunset yellow: 489 nm
f. Vi følger nu vejledningen i bilag (1) og laver 4 standardkurver. En for tartrazin ved både
430 og 489 nm, og en for sunset yellow ved både 430 og 489 nm.
Volumen
tartrazinopløsning
50,0 mg/L
Pufferopløsning
Vand
Tartrazinkoncentration
2,0 mL
5,0 mL
43 mL
2,0 mg/L
4,0 mL
5,0 mL
41 mL
4,0 mg/L
6,0 mL
5,0 mL
39 mL
6,0 mg/L
8,0 mL
5,0 mL
37 mL
8,0 mg/L
10,0 mL
5,0 mL
35 mL
10,0 mg/L
Volumen Sunset
Yellow opløsning
50,0 mg/L
Pufferopløsning
Vand
Sunset Yellow
koncentration
2,0 mL
5,0 mL
43 mL
2,0 mg/L
4,0 mL
5,0 mL
41 mL
4,0 mg/L
6,0 mL
5,0 mL
39 mL
6,0 mg/L
8,0 mL
5,0 mL
37 mL
8,0 mg/L
10,0 mL
5,0 mL
35 mL
10,0 mg/L
Studieretningsprojekt
22.
g. Sidst måles absorbtionen for vores farveopløsning ved de to bølgelængder.
Resultater:
Målinger på tartrazin ved hhv. 430 og 489 nm.
Studieretningsprojekt
23.
Målinger på Sunset Yellow ved hhv. 430 og 489 nm.
Studieretningsprojekt
24.
Udregninger:
Vi har nu lavet målinger for begge farveopløsninger ved begge bølgelænger. Farvestoffernes
absorbanskurver overlapper hinanden, dvs. at absorbanserne ved de to bølgelængder er summen af
de to farvestoffers absorbans ved den enkelte bølgelængde. Vi kan derfor opstille følgende ligninger
for absorbansen ved de to absorbtionsmaksimum:
)()()()(:
1111
owsunsetyellcowsunsetyellktartrazinctartrazinkA
)()()()(:
2222
owsunsetyellcowsunsetyellktartrazinctartrazinkA
Vi er i besiddelse af vores farveopløsnings absorbans ved de to bølgelængder og vi kan, ifølge
Lambert-Beers, aflæse k-værdierne for begge farvestofferne som hældningskoefficienten på vores
standardkurver. Husk at gange absorbtionen med 10 da vi fortyndede den til målingerne. Vores
resultater til brug i udregningen:
A
1
0,198610
A
2
0,089810
k
1
(t)
41,41
k
2
(t)
11,32
k
1
(sy)
19,03
k
2
(sy)
45,08
Koncentrationerne af de to stoffer kan nu udregnes som to ligninger med to ubekendte:
Først isoleres c(sy):
)(
)()(
)(
1
11
syk
tctkA
syc
Derefter sættes dens værdi ind på dens plads i
2
og værdien for c(t) kan udregnes ved solve:
L
mg
tartrazinctc
syk
tctkA
syktctksolve 867,43)(,))(,898,0)
)(
)()(
()()()((
1
11
22
Værdien for c(t) sættes nu ind i en af formlerne og vi kan udregne c(sy) ved solve:
L
mg
yellowsunsetcsycsycsyk
L
g
tksolve 905,8)(,))(,981,1)()(043867,0)((
11
Studieretningsprojekt
25.
Positivlisten:
Positivlisten for tratrazin: 100 mg/L
Positivliste for sunset yellow: 50 mg/L
Fejlkilder:
Vores målinger af den rene opløsning, skulle ifølge Lambert-Beers lov have ligget i punktet
(0,0), men dette er ikke tilfældet for vores grafer og der vil opstå nogle afvigelser omkring
hældningskoefficienter.
Da tallene der bruges til udregning af koncentrationen er forholdsvis store i sammenligning
med resultatværdien, vil små ændringer i f.eks. hældningskoefficienten for standardkurven
eller blandingens absorbtion give store ændringer ved udregningen af koncentrationen.
Konklusion:
Jeg kan konkludere at det ved spektrofotometri er muligt at finde ansorbtionen af en ukendt
blanding, og dermed muligt at udregne koncentrationen af denne ukendte blanding. Resultatet er
dog stærkt påvirket af fejlkilder og spørgsmålet er om det er brugbart. Hvis dette er tilfældet kan jeg
også konkludere, at indholdet af tartrazin og sunset yellow i en miranda, stemmer overens med de
lovlige mængder tilsætning der er er angivet i positivlisten. En lille sidekonklusion. De to
absorbtionsmaksimum befinder sig i bølgelængder med farverne blå og cyan. Det kan konkluderes
at det stemmer overens med farvestoffernes farver, nemlig gul og orange, der er
komplementærfarverne til blå og cyan.
Studieretningsprojekt
26.
7. Konklusion
Min konklusion over hele forløbet, hvor jeg har arbejdet med farvestoffer i levnedsmidler og farver
i det hele taget, er at det ikke er noget lille emne. Farveverdenen er et gigantisk interaktiv imellem
en masse forskellige spillere og for at forstå den skal man både have forståelse for den fysiske og
den kemiske del af spektret. Det er derfor svært at dykke ned i et enkelt emne, som f.eks.
levnedsmiddelfarvestoffer, da en forståelse af farvestoffernes overordnede funktioner og virkning,
også giver et godt billede af farvestoffer i levnedsmidler. Med henblik på det jeg før nævnte
omkring den fysiske og den kemiske del af farveverdenen, er et fantastisk eksempel elektromagne-
tiske bølgers dualitet, bølgemodellen og partikelmodellen. Det er to uforlignelige størrelser, men de
er begge nødt til at eksistere for at få det hele til at gå op.
Jeg kan ud fra de tre forsøg konkludere at det er muligt, først ved minikolonne at isolere et
farvestof, og derefter identificere stofferne i farveblandingen ved chromatografi, for til sidst, når
man er klar over hvilke stoffer blandingen indeholder, at finde koncentrationen af farvestofferne
ved spektrofotometri.
Det kan konkluderes at producenten af den gule sodavand miranda, overholder grænserne for
indholdet af farvestoffer i læskedrikke, opsat af fødevarestyrelsen.
Studieretningsprojekt
27.
Litteraturliste
Bøger:
Mygind, Helge: ”Kemi 2
3 - øvelser”, 1991, P. Haase & Søn
Parbo, Henrik: ”Bag den farvede virkelighed”, 1986, systime a/s
Hartling, Niels m.f.: ”Spektrum – fysik II“, 2004, Gyldendal
Ames & Hofman: ”Chemestry and physiology of selected food colorants”, 2001, American
Chemical Society
MacDougall, Douglas: “Colour in food”, 2002, CRC PRESS
Vargas, Francisco: Natural Colorants for Food and Nutraceutical Uses”, 2003, CRC
PRESS
Internet:
http://science.howstuffworks.com/light1.htm
http://homepage.svendborg-gym.dk/rk/kemi/noter-b/orbitaler/orbitaler2.htm