Studiekompasset.dkKlasse: STX 3.g · Fag: SRP, Bioteknologi A
Studieretningsprojekt i Bioteknologi
MONOKLONALE ANTISTOFFER
STX 3.g
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
1
ABSTRACT
This paper examines how monoclonal antibodies are a part of the fight against cancer
diseases. The focus will be on how the monoclonal antibodies work and how they are
produced and used against cancer diseases. Through research in scientific articles, approved
books and authorized websites, the paper will furthermore give a thorough examination of
how cancer occurs and how the immune system reacts to unknown organisms. Through a
laboratory experiment, the paper determines how the monoclonal antibodies’ glycosylation
profiles and amount of glycation are affected by fermentation with a high level of glucose.
This will be analyzed via ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry). Additionally,
advantages and disadvantages of monoclonal antibodies as a treatment for cancer diseases
will be discussed. The paper determines that the amount of glycation of the monoclonal
antibodies is affected by the concentration of glucose that the monoclonal antibodies are
produced in. Furthermore the experiment does not show any correlation between the
concentration of glucose and the glycosylation profiles of the monoclonal antibodies.
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
2
INDHOLDSFORTEGNELSE
Abstract ...................................................................................................................................... 1
1. Indledning ............................................................................................................................... 3
2. Baggrund ................................................................................................................................ 3
3. Cancercellen ........................................................................................................................... 5
4. Behandling af cancer .............................................................................................................. 6
4.1 Kirurgi .............................................................................................................................. 7
4.2 Strålebehandling ............................................................................................................... 7
4.3 Kemoterapi ....................................................................................................................... 8
5. Immunsystemet ...................................................................................................................... 8
5.1 Det uspecifikke immunforsvar ......................................................................................... 9
5.2 Det specifikke immunforsvar ......................................................................................... 10
6. Antistoffer ............................................................................................................................ 12
6.1 Monoklonale Antistoffer ................................................................................................ 13
6.2 Antistoffets kulhydrater .................................................................................................. 14
7. Effekt af fermentering af antistoffer i medie med højt glukoseindhold ............................... 15
7.1 Formål ............................................................................................................................. 15
7.2 Metoder ........................................................................................................................... 15
7.3 Materialer og forsøgsopstilling ....................................................................................... 19
7.4 Forsøgsbeskrivelse.......................................................................................................... 20
7.5 Resultater ........................................................................................................................ 23
7.6 Databehandling ............................................................................................................... 25
7.7 Vurdering af usikkerheder og fejlkilder ......................................................................... 25
7.8 Forsøgskonklusion .......................................................................................................... 26
8. Anvendelse af monoklonale antistoffer ....................................... 26
9. Konklusion ........................................................................................................................... 28
10. Litteraturliste ...................................................................................................................... 30
11. Bilag ................................................................................................................................... 33
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
3
1. INDLEDNING
Kemoterapi, kirurgi og strålebehandling, er gennem længere tid kendte behandlingsformer
mod cancersygdomme. Behandlingen resulterer dog ofte i, at cancerpatienterne, oplever en
række bivirkninger, der blandt andet kan omfatte hårtab, træthed eller blodmangel. Desuden
er disse former for behandling ikke altid effektive og det er langt fra alle, der bliver helbredt.
Der forskes aktivt og intenst i nye og forbedrede behandlingsformer mod cancersygdomme.
En af de behandlingsformer, som medicinalindustrien har stor fokus på, er anvendelse af
specifikke proteiner, kaldet monoklonale antistoffer. Anvendelsen og forskningen i antistoffer
er kun i startfasen, men det anslås at cirka 30 % af al den medicin der lanceres gennem det
næste århundrede, vil være baseret på monoklonale antistoffer.
1
Men hvordan vil et lille specifikt mikroskopisk protein, kunne helbrede en sygdom som
cancer, der har eksisteret så længe og været årsag til så mange dødsfald? Dette vil blive
beskrevet, analyseret og diskuteret i denne opgave.
Arbejdet omfatter en bioteknologisk gennemgang, laboratorieforsøg og analyser af dette, samt
en afsluttende diskussion om hvordan monoklonale antistoffer, kan være et led i bekæmpelsen
af cancersygdomme.
I det følgende vil der blive redegjort for hvordan en cancercelle er opbygget og de mest
anvendte behandlingsformer mod cancersygdomme, vil blive beskrevet. Dernæst vil
opbygningen af kroppens immunsystem og dets funktion beskrives, efterfulgt af en
redegørelse for hvad et antistof er og hvordan det fremstilles i medicinalindustrien. Derefter
vil et laboratorieforsøg, blive udført og beskrevet. Dette forsøg er et led i fremstillingen af
monoklonale antistoffer hos medicinalvirksomheden Symphogen. Til sidst, vil det blive
diskuteret hvordan monoklonale antistoffer kan bruges som en behandlingsform mod
cancersygdomme og hvilke fordele og ulemper der vil være ved denne type af behandling.
2. BAGGRUND
De fleste personer i den vestlige verden bliver i dag, på den ene eller den anden måde, berørt
af cancersygdomme. Omkring hver fjerde dansker får selv cancer inden 75-års alderen.
2
Eftersom den gennemsnitlige levealder stiger og risikoen for at få cancer øges med alderen,
vil antallet af cancerpatienter stige. Men også yngre personer bliver ramt af cancersygdomme.
Arvelige forhold, samt levevis og miljøfaktorer er forhold der påvirker forekomsten af cancer.
1
Jefferis, Roy, 2009 s. 226
2
Kristjansen, Paul S. 9
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
4
Cancer er ikke noget nyt fænomen. 100 millioner år gamle fossiler af dinosaurer har haft
cancerlignende knuder, og menneskelige knogler fra 100.000 år tilbage har vist tegn på
knoglecancer.
3
Cancer er en sygdom, eller en lang række af sygdomme, der har eksisteret
længe og det ser heller ikke ud til, at de kommer til at forsvinde i den nærmeste fremtid.
Cancersygdomme kan opstå i næsten alle typer af kroppens væv. De navngives efter hvor i
kroppen de opstår og spredes fra, men alle cancersygdomme har det til fælles, at de uden
behandling fører til død, som følge af spredning i kroppen.
4
I dag findes der behandlingsformer der gør det muligt for cancerpatienter, enten at kunne leve
med sygdommen eller i bedste fald, blive helbredt fra sygdommen. Kemoterapi, kirurgi og
strålebehandling er kendte former for behandling, der kan anvendes mod næsten alle typer af
cancersygdomme. Disse behandlingsformer har dog mange bivirkninger og desuden kan de
være for uspecifikke, hvis målet er helbredelse. Forskning og udvikling går derfor mod nye
behandlingsformer, hvor målet er at finde mere specifikt virkende stoffer.
Et eksempel på en behandlingsform der vinder frem, er brugen af monoklonale antistoffer,
også kaldet mAbs. Monoklonale betyder, at antistofferne er producerede af produktionsceller
der alle nedstammer fra samme celle. Produktionscellerne er identiske efterkommere af den
første celle hvilket vil sige at de tilhører en klon. Det at produktionscellerne er identiske er
vigtigt, da kun en lille variation i antistoffet, kan forårsage en anderledes behandlingseffekt.
Det er kompliceret at få dannet identiske antistoffer, eftersom der er mere end 5.000 led i
produktionen af mAbs. Selv den mindste ændring i antistoffets struktur, kan ændre
sammensætningen af lægemidlet og dermed ændre ved den måde det virker på.
5
De første
mAbs blev produceret i 1975. To forskere formåede her at sammensmelte en celle, der
producerede antistoffer og en cancercelle, der havde mistet evnen til kontrolleret celledeling.
Dermed havde de produceret en lille ”antistoffabrik” hvor cellekopierne var identiske kloner
af de oprindelige sammensmeltede celler.
Som behandlingsmetode mod cancer, er de monoklonale antistoffers opgave, at binde sig til
cancercellens antigener og sende en immunrespons ud til kroppens immunsystem om, at det
skal slå cancercellerne ihjel.
6
Disse monoklonale antistoffer dyrkes i dyreceller og produceres
i store mængder i medicinalindustrien. Udfordringen ved at producere monoklonale
antistoffer i storskala er, at antistoffer er meget komplekse i deres opbygning og struktur.
Derudover er mAbs per definition ustabile og processen i produktionen af monoklonale
antistoffer er en uforudsigelig kemisk proces, eftersom der er tale om en unik levende
cellelinje. Det er derfor svært på forhånd at karakterisere slutproduktet.
7
3
Kristjansen, Paul s. 10
4
Kristjansen, Paul s.13
5
https://www.pharmadanmark.dk/aktuelt/pharma/Documents/2014-april/Pharma04-2014_s22-25.pdf
6
http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/Therapy/biological
7
https://www.pharmadanmark.dk/aktuelt/pharma/Documents/2014-april/Pharma04-2014_s22-25.pdf
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
5
3. CANCERCELLEN
Kroppen består af billioner af celler, der er opdelt i forskellige celletyper. Langt de fleste af
disse almindelige celletyper kan udvikle sig til cancerceller. Derfor er den eneste forskel på
kroppens naturlige celler og cancerceller der forårsager cancer, at der i cancercellens
cellekerne sker en lille ændring i dens DNA, hvilket kan give fatale følger. Hvordan det sker
og hvorfor det sker, forklares i følgende afsnit.
Kroppens naturlige celler gennemgår en livscyklus hvor de vokser, deler sig og dør for at gøre
plads til de nye celler.
8
Dette sker under regulerende processer, der findes i kroppen. De
regulerende processer indebær cellevækst, celledeling, celledød og celledifferentiering.
Cancer kan opstå hvis reguleringen af disse processer forstyrres.
Cellens evne til at dele sig og dø er kontrolleret af cellens egen kerne, kaldet nukleus. Nukleus
indeholder kromosomer og kromosomerne indeholder gener, der er bygget op af DNA. I visse
tilfælde kan der ske en tilfældig ændring i en lille del af DNA’et, hvilket påvirker kernen til at
sende uvante signaler ud til cellen. Disse signaler kan få cellen til at dele sig ukontrolleret.
Alle celler, der opstår ud fra celledeling skabt af den ukontrollerede celle, vil indeholde
samme gener og dermed samme DNA fejl. Dette betyder at cellen vil indeholde egenskaber
for ukontrolleret cellevækst og celledeling. Når der sker nok celledelinger, uden at cellen
bekæmpes, vil de ukontrollerede celler danne en svulst, også kaldet en tumor. Det kan tage op
til 30 år fra den første fejl sker i cellens DNA til en tumor på 1 kubikcentimeter er dannet.
Der findes både godartede tumorer, også kaldet benigne tumorer, der ikke skader organismen
og ondartede tumorer, også kaldet maligne tumorer, der kan forårsage cancer.
9
Tumoren danner blodkar for at overleve. Blodkarrene forsyner tumoren med oxygen og
næringsstoffer så den er i stand til at leve og vokse. Denne proces kaldes for tumor
angiogenesis.
10
Den maligne tumor bliver først farlig når cancercellerne fra tumoren begynder
at trænge ind i blodkarrene og ud til de omkringliggende organer.
11
Derfra kan cancercellerne
metastasere, hvilket vil sige at de invaderer andre dele af kroppen. Hvis cellen metastasere, vil
den foretage sig celledelinger i andre områder af kroppen, og dermed forårsage dannelsen af
dattersvulster, også kaldet metastaser.
12
Det kan derfor være altafgørende, at behandlingen
mod cancer sker i et så tidligt stadie som muligt. Når cancercellerne har spredt sig fra den
oprindelige tumor, vil det være svært og mange gange umuligt at fjerne alle metastaserne.
Yderligere vil der være cancerceller i store dele af kroppens væv og disse er næsten også
8
http://www.cancer.org/cancer/cancerbasics/what-is-cancer
9
Sørensen, Annette B. m.fl. s. 198
10
http://www.sciguru.org/newsitem/5082/Daring-Tumors-Tumor-Cells-Make-Their-Own-Blood-Vessels
11
http://en.sanofi.com/event/Sanofi_TV_Cancer.aspx
12
Kristjansen, Paul s. 16
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
6
umulige at fjerne. Derimod kan den rette behandling holde spredningen af cancer nede,
hvilket, i mange tilfælde, gør det muligt at leve med cancer.
13
Det er, som nævnt tidligere i afsnittet, en af kroppens egne normale celler der kan blive til en
cancercelle. Der kan være flere grunde til, at en normal celle bliver til en cancercelle. For
eksempelvis kan udsættelse for radioaktivitet, solstråling, kemikalier og virusser, som HIV og
Hepatitis B være årsager til at der sker en ændring i cellekernens DNA og cellen kan dermed
miste sin evne til kontrolleret celledeling. Hvis mutationen i DNA’et der medfører
ukontrolleret celledeling og cellevækst, nedarves kan det også medføre øget risiko for
udvikling af cancer. Derudover er en usund kost, for meget alkohol eller for meget tobak også
hyppige årsager til cancersygdomme, og det er netop den usunde levemåde, der forårsager
størstedelen af alle cancerformer.
14
Som nævnt i afsnit 2 findes der dog behandlingsformer
der gør det muligt at få patienter til at leve med cancer og i bedste fald helbrede sygdommen.
4. BEHANDLING AF CANCER
Der findes mange former for behandling af cancersygdomme, og de tre mest anvendte former
for behandling er kirurgi, strålebehandling og kemoterapi. Målet med disse
behandlingsformer er at fjerne tumoren eller forhindre tumoren i at sprede sig yderligere.
Stråling og kemoterapi bygger på at påvirke cancercellerne til at foretage sig apoptose, dvs.
begå selvmord.
15
Strålebehandling og kirurgi kaldes lokal behandling, da disse former for
behandling er begrænset til, at omfatte enkelte veldefinerede områder af legemet. Kemoterapi
eller medicinsk behandling er en systematisk behandlingsform hvor den cancercelledræbende
behandling gives så den virker i hele kroppen. I dag anvendes, så hvidt det er muligt, en
kombination af kirurgi, strålebehandling og kemoterapi som behandling. Dette samspil
mellem flere behandlingsformer kaldes multimodal behandling.
16
13
http://www.cancercenter.com/what-is-cancer/
14
http://www.ssi.dk/~/media/Indhold/DK%20-
%20dansk/Sundhedsdata%20og%20it/NSF/Registre%20og%20kliniske%20databaser/Registre/Cancerregisteret
%202013.ashx
15
Skadhede, Thomas m.fl. s. 203
16
Kristjansen, Paul s. 76-77
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
7
4.1 KIRURGI
Kirurgi indebærer fjernelse af det cancersyge organ eller væv ved operation. Kirurgi anvendes
også til at diagnosticere cancer og til at finde ud af om sygdommen har spredt sig, og i så fald
hvor til. Der anvendes mange forskellige former for kirurgi. Laserkirurgi indebærer at lægen
anvender en tynd stråle af højt intensivt lys, til at fjerne det syge væv.
17
Ved endoskopi, også
kaldet en kikkertundersøgelse, kan lægen, ved hjælp af en tynd kikkertslange, opdage og
fjerne små cancerknuder i mange organer.
18
Ved en primær operation, anvender lægen en
skalpel eller lignende til at fjerne tumoren og omkringliggende sygt væv. Dette er den mest
anvendte form for cancerkirurgi.
19
Disse er kun nogle af de metoder, der anvendes inden for
cancerkirurgi.
Ved et kirurgisk indgreb er kroppens indre udsat for bakterieinfektioner. Der kan derfor let
opstå betændelse hvis ikke såret beskyttes og renses. Derudover skal man ofte faste op til en
operation, hvilket kan forårsage træthed i tiden efter operation. Smerte er også en faktor der er
meget almindelig efter en operation. Tumoren medfører et stort pres på kroppen og hvis den
ligger omkring et organ, kan den udstrække organet, hvilket forårsager smerte når tumoren
fjernes.
20
4.2 STRÅLEBEHANDLING
Strålebehandling kaldes også radioterapi og til denne form for behandling anvendes
ioniserende stråling, som kan være enten elektromagnetisk stråling eller partikelstråling.
Strålingen beskadiger DNA’et i cellen enten ved direkte beskadigelse eller ved indirekte
beskadigelse. Ved direkte beskadigelse rammer strålingen cancercellen, og dermed dens
kerne, der går i stykker og dør. Ved indirekte beskadigelse, vil vandmolekyler opløses og
danner frie radikaler som for eksempel et hydroxylradikal der vil ramme DNA’et i cellen. Ved
at DNA’et går i stykker vil cancercellen miste sin evne til at vokse og dele sig, og over tid vil
den dø.
21
Problemet med strålebehandling er, at strålingen ikke kun virker på cancercellerne, men også
på de normale celler, da cancercellerne, som tidligere nævnt, dannes ud fra de normale celler.
Dermed beskadiges de omkringliggende raske celler også ved strålingen, hvilket medfører
skade på cellernes DNA, som vil forårsage en række bivirkninger. Bivirkningerne afhænger af
17
http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/surgery/what-cancer-surgery
18
http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/behandlingsformer/operation/
19
http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/surgery/what-cancer-surgery
20
http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/surgery/side-effects-surgery
21
Kristjansen, Paul s. 86-90
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
8
hvilket område der bestråles, men kunne være slimhindeirritation, hudreaktion eller øget
bindevævsdannelse.
22
4.3 KEMOTERAPI
I kemoterapi anvendes forskellige cellegifte, kaldet cytostatika, der har den funktion at dræbe
cancercellerne så effektivt som muligt, uden samtidigt at ødelægge kroppens normale celler.
Cytostatika beskadiger cellers evne til at dele sig og påvirker også cellers evne til at danne
nødvendige proteiner. Ligesom ved strålebehandling, er det vigtigste mål for medicinen at
beskadige DNA’et i den cancerramte celle.
23
Kemoterapi kan også hæmme og beskadige de normale celler. Kemoterapi beskadiger
cancercellernes evne til at dele sig, og jo oftere en celle deler sig jo større sandsynlighed er
der for at medicinens virkning træder i kraft. Dermed er det ikke udelukkende cancercellerne
der dør ved kemoterapi, men også nogle typer af de raske celler og især dem der foretager sig
celledeling ofte. Celler som hårceller, blodceller og hudceller er celletyper der ofte deler sig
og de er derfor raske celler der er udsat ved kemoterapi.
24
Virkningen af den
kemoterapeutiske medicin mod disse raske celletyper, forårsager en lang række bivirkninger.
Træthed, nedsat immunforsvar og blodmangel er nogle af de bivirkninger, der skyldes at de
normale celler dør som følge af medicinen.
25
Derudover er hårtab en kendt bivirkning ved
kemoterapi, da medicinen påvirker cellerne i hårrødderne.
26
5. IMMUNSYSTEMET
Cancersygdomme kan, som nævnt i kapitel 3, skyldes mange forskellige ydre årsager. Men
uanset de forskellige ydre forårsagende faktorer, er der nogle indre fællestræk ved langt de
fleste cancersygdomme, som gør sig gældende for at cancer opstår. Disse fællesstræk er
mutationer, eller ændringer, i bestemte gener. Cancer er derfor en vanskelig sygdom, da
kroppens eget forsvar, kaldet immunsystemet, ikke forsvarer sig imod kroppens egne celler,
men kun imod fremmede celler. Det vil i følgende afsnit blive beskrevet, hvordan
immunsystemet er opbygget og hvordan immunsystemet fungerer, når udefrakommende
fremmede organismer trænger ind.
22
http://www.caigrau.dk/temp/mpl_intro.pdf
23
Kristjansen, Paul s. 98-99
24
http://ed.ted.com/lessons/how-do-cancer-cells-behave-differently-from-healthy-ones-george-zaidan
25
http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/behandlingsformer/kemoterapi/bivirkninger-kemoterapi/
26
http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/bivirkninger-senfolger/gode-raad-ved-haartab/aarsager-
til-haartab/
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
9
Immunsystemets primære funktion er at beskytte organismen mod sygdomsfremkaldende
mikroorganismer, også kaldet patogene mikroorganismer. Immunsystemet er derfor i stand til
at skelne indtrængende fremmede celler, fra kroppens egne celler. Det vil sige, at når en
sygdomsfremkaldende bakterie trænger ind i kroppen, vil den registreres som fremmed og
immunsystemet vil derfor begynde at bekæmpe bakterien. I forsvaret mod en indtrængende
mikroorganisme, er mange forskellige celletyper involveret.
27
De organer der udgør immunsystemet kaldes, de lymfoide organer, som indebær
knoglemarven, thymus, lymfeknuderne, mandlerne, milten, polypperne og blindtarmen.
Immunsystemet er inddelt i det uspecifikke, medfødte forsvar og det specifikke, tillærte
forsvar.
5.1 DET USPECIFIKKE IMMUNFORSVAR
Det uspecifikke forsvar er rettet mod alle typer af mikroorganismer, og opdeles i en passiv og
en aktiv del. Det passive forsvar, forhindrer langt de fleste patogene mikroorganismer i at
trænge ind i kroppen.
På huden og slimhinderne lever der en lang række ufarlige mikroorganismer, der konkurrerer
om plads og næringsstoffer og de er derfor med til at holde de udefrakommende patogene
mikroorganismer nede. Huden består af flerlaget epitel, hvilket er uigennemtrængeligt for de
fleste mikroorganismer. Endvidere har huden en lav pH-værdi på 4-5, da nogle af de bakterier
der lever på huden danner frie fedtsyrer, og dette er med til at beskytte kroppen mod andre
bakterier. Slimhinderne danner slim i svælg, kønsorganer og luftveje og fanger
udefrakommende organismer og skubber dem ned i mavesækken, hvor mavesyren slår dem
ihjel. Tårevæske, spyt og slim indeholder desuden lysozymer, som er bakterienedbrydende
enzymer.
I det aktive forsvar, angriber fagocytterne, eller ædecellerne, som tilhører de hvide
blodlegemer, mikroorganismerne, hvis det alligevel lykkes for disse at trænge igennem huden
eller slimhinderne.
28
Makrofager, neutrofile granulocytter og dendritceller er fagocytter der
optager mikroorganismerne ved fagocytose. Ved fagocytose optager en fagocyt en bakterie
via en transportform kaldet endocytose. Fagocytten indeholder lysosomer, som indeholder
fordøjelsesenzymer. Disse fordøjelsesenzymer nedbryder, sammen med andre cellegifte,
bakterierne.
29
Derudover udstiller makrofagen antigener, som er nogle af den patogene
mikroorganismes overfladestoffer, på sin egen overflade. Herved signalerer makrofagen til
immunsystemet, at der er fremmede mikroorganismer i kroppen og de skal bekæmpes.
27
Bruun, Kim m.fl. s. 161
28
Skadhede, Thomas m.fl. s. 61-62
29
Bruun, Kim m.fl. s. 165
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
10
Endvidere udskiller makrofagen interleukiner, som er signalstoffer der tiltrækker andre
makrofager, som kan hjælpe med at bekæmpe infektionen.
Når makrofagerne udstiller antigener og udskiller signalstoffer, aktiveres
komplementsystemet, som er en lang række proteiner på inaktiv form. Disse
komplementmolekyler hæfter til den patogene mikroorganisme og danner nogle effektive
nedbrydende enzymer, der danner en pore i membranen, hvorved bakterien sprænges.
30
Hvis
infektionen endnu ikke er blevet bekæmpet af makrofagerne eller af komplementsystemet,
kan det uspecifikke immunforsvar forsinke infektionen, imens det specifikke forsvar
aktiveres.
5.2 DET SPECIFIKKE IMMUNFORSVAR
Det specifikke forsvar aktiveres langsommere end det uspecifikke forsvar, og man kan derfor
nå at blive syg inden det træder til. Det specifikke forsvar består ligeledes af to dele: det
antistofbasserede forsvar og det cellulære forsvar. På figur 1 ses hvordan det specifikke
forsvar virker ved et virusangreb, hvilket også forklares i nedenstående tekst.
Figur 1 – Immunreaktion ved virusangreb.
31
30
Bidstrup, Bodil Blem m.fl. s. 24-25
31
Bidstrup, Bodil Blem m.fl. s. 27
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
11
Som nævnt i afsnit 5.1, udstiller makrofagen fremmede antigener, når den møder en fremmed
mikroorganisme. Ved at makrofagen udstiller fremmede antigener, aktiveres T-
hjælpecellerne. T-hjælpecellerne har to slags receptorer, kaldet CD4-receptorer og T-
cellereceptore, TCR, som kan binde sig til det udstillede antigen på makrofagen.
32
Antigenet
er udstillet på makrofagens MHC II-protein (Major Histocompatibility Complex), hvilket gør
at T-hjælpecellen ved, at antigenet befinder sig på en makrofag og ikke på en anden celle. På
de fleste celler sidder proteinet MHC I på overfladen, mens det kun er på de
antigenpræsterende celler, så som makrofager, at MHC II-proteinet sidder. MHC I viser
endogene, indre, antigener fra en celle der er blevet inficeret af en patogen mikroorganisme,
hvor MHC II viser exogene, ydre, antigener der er optaget fra omgivelserne.
Når T-hjælpecellen opdager, at der er en infektion, aktiverer den en anden af kroppens
immunforsvarsceller, der kaldes en B-lymfocyt. Når B-lymfocytten aktiveres, deler den sig til
to andre celler, nemlig en B-huskecelle og en plasmacelle. Plasmacellen kan producere et
protein, som kaldes et antistof. Antistoffet passer til de antigener som de patogene
mikroorganismer udstiller. Når antistoffet binder sig til antigenet, kan antistoffet pacificere
den patogene mikroorganisme, hvilket gør det muligt for fagocytterne, at lave fagocytose. B-
huskecellen husker de udefrakommende antigener, og kan beskytte personen mod en eventuel
fremtidig infektion, med samme mikroorganisme.
Virus bevæger sig ind i kroppens naturlige celler og overtager deres stofskifte. Antistofferne
kan ikke angribe virus, når den er inde i cellen. Derfor aktiveres T-dræbercellen, som også er
en immunforsvarscelle. Den virusinficerede celle udskiller signalstoffer, der aktiverer T-
dræbercellen. Når T-dræbercellen aktiveres, binder den sig til den virusinficerede celles MHC
I-protein med udstillet antigen, via sin TCR og CD8-receptor. Hvis T-dræbercellen aktiveres
dræber den, den virusinficerede celle.
33
Antistofferne er en vigtig del i det specifikke immunforsvar og de kan have en afgørende
virkning for, om en person bliver rask. Antistoffer produceres naturligt i kroppen, men kan
ved hjælp af bioteknologiske processer, også fremstilles kemisk, hvor de kaldes monoklonale
antistoffer. I følgende afsnit vil antistoffers gennerelle opbygning blive beskrevet. Derudover
vil det forklares hvad monoklonale antistoffer er, og hvordan de kan fremstilles.
32
Bruun, Kim m.fl. s. 174
33
Bidstrup, Bodil Blem m.fl. s. 25-27
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
12
6. ANTISTOFFER
Antistoffer, også kaldet immunglobuliner, cirkulerer i blodplasma. De forkortes Ig og opdeles
i fem forskellige klasser: IgM, IgG, IgD, IgE og IgA (figur 2).
Figur 2 – De fem forskellige antistofklasser.
34
Immunsystemet producerer antistofferne, som et svar på en antigenstimulering. Antistoffer er
proteiner, der er koblet sammen med kulhydrater og de er derfor glykoproteiner.
35
Et antistof
ligner et Y (figur 3) og består af to dele, der er symmetriske omkring midten. Hver del består
af en tung kæde og en let kæde, der hænger sammen ved hjælp af disulfidbindinger på samme
måde som de to symmetriske dele hænger sammen.
36
Antistoffet er også delt op i to variable områder, kaldet F
ab
(antigen-binding fragment), der er
det yderste af de to grene på Y’et, og resten er konstante områder, kaldet F
c
(krystalliserbar
fragment).
37
Det yderste af de to variable områder, er antigenbindingssteder.
Figur 3 – Grundformen af et antistof med bundet antigen.
38
Antistoffer frigives, som tidligere nævnt, som en reaktion på en fremmed mikroorganisme.
Det er IgM antistofferne der frigives først og disse antistoffer er pentamer, hvilket vil sige at
de hver består af fem antistoffer og principielt har ti bindingssteder. Dog binder IgM ikke så
godt til antigenerne, da affiniteten af stofferne er lav.
34
http://www.mcqbiology.com/2013/01/mcq-on-immunology-antibodies-or.html
35
Falkenberg, Henrik m.fl. s. 170
36
Shade, King-Ting C., m.fl. s. 392-394
37
Jefferis, Roy, 2009 s. 226
38
Bruun, Kim m.fl. s.168
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
13
Det næste antistof, som frigives er IgG. IgG er det antistof der findes i størst koncentration i
blodet. IgG findes kun som monomer, hvilket gør at det har to bindingssteder. Derfor er
affiniteten høj og det medfører at IgG binder godt til det pågældende antigen.
39
IgD er let nedbrydeligt og findes derfor i lav koncentration i blodet. IgD er bundet til
overfladen af B-celler, som ikke er præsenteret for antigener.
IgE aktiverer fagocytter kaldet mastceller, som udskiller inflammatoriske stoffer. Derudover
er IgE involveret i immunreaktionen mod parasitter.
40
IgA findes overvejende i sekreter, hvor det hjælper med at beskytte mod indtrængen af
patogene mikroorganismer, ved at det får disse til at klumpe sig sammen, så de ikke kan
trænge igennem slimhinden.
41
IgA og IgG er også inddelt i henholdsvis fire (IgG1-4) og to
(IgA1-2) underklasser, der alle har forskellige egenskaber.
42
Ovenstående sker naturligt i kroppen. Det er dog, som tidligere nævnt, muligt at fremstille
antistoffer via bioteknologiske processer. En af de type antistoffer, der kan fremstilles ved
bioteknologiske processer, kaldes monoklonale antistoffer og denne type af antistoffer bruges
aktivt, som behandlingsform mod cancer.
6.1 MONOKLONALE ANTISTOFFER
Monoklonale antistoffer, forkortes mAb og er antistoffer, der er ens og dannede ud fra samme
oprindelige hybridcelle. Ved cellehybridisering dannes en hybridcelle, som er en blanding af
celler fra to arter. For at producere mAb anvendes B-lymfocytter og cancerceller. B-
lymfocytterne er i stand til at producere antistoffer og cancercellerne foretager sig hyppigt
celledeling og har gode overlevelsesevner. Dermed er resultatet en hybridcelle, der har alle
egenskaber fra begge celler.
43
Antistoffer varierer dog i forskellige kemiske strukturer selvom
de kommer fra samme celleklon. Hvordan det enkelte antistof ser ud, afhænger i høj grad af
hvordan hybridcellen trives, når den danner antistoffet. Derfor skal ordet ”klon” eller ”ens”
tolkes lidt løst, men er bedre end for eksempelvis ordet ”identiske”.
Symphogen er en medicinalvirksomhed, der i dag anvender CHO celler (chinese hamster
ovary cells) til at producere deres antistoffer. CHO celler anvendes i størstedelen af
produktionen af antistoffer. Grunden til at CHO celler anvendes er at de er relativ lette, at
dyrke i kulturer og derudover er de generelt bedre til at overleve, end for eksempel
39
Jefferis, Roy, 2005, s. 14
40
Bruun, Kim m.fl. s. 168-169
41
Falkenberg, Henrik m.fl s. 171-172
42
Shade, King-Ting C., m.fl. s. 393-394
43
Skadhede, Thomas m.fl. s. 107
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
14
menneskeceller, eftersom CHO celler deler sig hyppigere.
44
CHO celler er også i stand til at
optage fremmed genetisk materiale og endelig er disse celler ikke skadelige for mennesker,
hvilket er vigtigt hvis menneskelig medicin skal produceres i sidste ende.
45
Når Symphogen har produceret antistofferne i en samlet væske, som også indeholder cellerne,
skal antistofferne oprenses. Det gøres ved hjælp af proteiner og efterfølgende ved
kromatografiske metoder. Ved søjlekromatografi føres antistofopløsningen gennem en søjle,
hvor materialet af søljen er afgørende for, at det ønskede antistof adskilles fra resten af
væsken.
46
Når det ønskede antistof er oprenset, foretager Symphogen analytiske behandlinger
af dette. Denne proces er vigtigt for at teste om antistoffet er sikkert og virksomt og om det
ligner det forventede produkt.
6.2 ANTISTOFFETS KULHYDRATER
På antistoffets konstante F
c
del sidder der kulhydrater. Disse kulhydrater varierer fra antistof
til antistof og findes i et utal af kombinationer. For eksempelvis er der på det menneskelige
IgG, fastgjort et kulhydrat, en sakkarid-polymer, kaldet et oligosakkarid, et sted på hver af de
to tunge kæder. Disse kulhydrater er afgørende for den måde de monoklonale antistoffer
virker på og effektiviteten kan variere alt afhængig af hvilket specifikt oligosakkarid, der
sidder på antistoffet.
I produktionen af mAbs, anvendes der i dag metoder, der gør det muligt at fremstille disse
med homogene oligosakkarider, også kaldet glykoformer. Humant IgG er sammensat af flere
forskellige glykoformer på grund af tilføjelsen af forskellige komplekse ’diantennary’
oligosakkarider, dvs. oligosakkarider der har to manose ’arme’, til Fc delen af antistoffet.
Tilstedeværelsen eller fraværet af IgG Fc oligosakkarider, har ikke en effekt på
antigenbindingen, men har en afgørende virkning på de biologiske mekanismer, der aktiveres
af de dannede immunkomplekser.
Forskning har muliggjort dannelsen af en række homogene antistof-glykoformer og forsøg
har vist, at der er stor forskel i effektiviteten af disse glykoformer.
47
Medicinalindustrien forsker aktivt i, hvordan de bedste monoklonale antistoffer, til
behandling af forskellige cancersygdomme, fremstilles. Målet er at mAbs kan anvendes som
en endnu mere effektiv og smertefri behandlingsform i fremtiden.
44
Chung, Shan m.fl. s. 326-327
45
http://www.aiche.org/sites/default/files/docs/pages/CHO.pdf
46
Bruun, Kim m.fl. s. 57-58
47
Jefferis, Roy, 2009 s. 226
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
15
En parameter, der kan ændres på og som der forskes intenst i, med henblik på forbedring af
antistofferne, er antistoffernes glykoformer, som kan aflæses på antistoffernes
glykosyleringsprofiler. Antistoffernes glykosyleringsprofiler opnås ved at anvende en
analysemetode kaldet massespektrometri.
48
I det følgende afsnit vil det beskrives, hvordan man kan undersøge om fermentering af
antistoffer i medie med høj glukose, har en indflydelse på deres glykosyleringsprofiler eller
mængden af glykering. Dette forsøg er en lille del af en lang proces, som gennemføres på
Symphogen med henblik på, at producere de bedst mulige og mest effektive antistoffer.
7. EFFEKT AF FERMENTERING AF ANTISTOFFER I
MEDIE MED HØJT GLUKOSEINDHOLD
7.1 FORMÅL
Formålet med forsøget er, at undersøge om fermentering af antistoffer i medie med et højt
glukoseindhold, har en indflydelse på antistoffernes glykosyleringsprofiler eller mængden af
glykering. Dette undersøges ved hjælp af en kombination af højtryksvæskekromatografi og
massespektrometri (HPLC-MS).
7.2 METODER
48
Putnam, Wendy S., m.fl., s. 509-510
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
16
For at forstå hvad forsøget indebærer og hvad formålet med forsøget er, vil jeg beskrive og
forklare en række begreber, samt beskrive en række processer og metoder der er anvendt i
forsøget.
En glykering er en ikke-enzymatisk reaktion, hvor kulhydrater, som for eksempel glukose,
bindes via en kovalent binding, til proteiner, DNA, lipider eller som i dette forsøg,
antistoffer.
49
En glykosylering, er en proces hvor kulhydrater, bindes til proteiner, DNA, lipider eller som i
dette forsøg, antistoffer.
50
Metoder der anvendes i forsøget:
ESI-MS (ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry) er en vigtig teknik for kvantitative
målinger af metabolitter i en kompleks biologisk prøve, i det kliniske laboratorium.
Under ESI (figur 4) bliver små dråber af prøven der ønskes undersøgt, ledt ind i et tyndt rør
sammen med en forstøvningsgas. Prøven bliver ’sprayet’ ud af røret og gennemgår en
forstøvningsproces hvor prøvemolekylerne bliver opvarmet af N
2
, hvilket forårsager at
dråberne bliver mindre og mindre. Dette sker under vakuum og resulterer i, at kun de positive
ioner er tilbage af molekylerne. Nogle af de positive ioner farer ind i et kapillarrør der skaber
en stråle af positive ioner. Resten af ionerne transporteres videre som affald. Efter at ionerne
forlader kapillarrøret, gennemgår de en proces kaldet CID (Collision-Induced Dissociation),
der skaber fragmenter af de molekylære ioner.
49
Goetze, Andrew M., m.fl. s. 221
50
Putnam, Wendy S., m.fl., s. 510-511
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
17
Figur 4 – Elektrospray Ionization processen.
51
Efter ElektroSpray Ioniseringsprocessen fortsætter ionfragmenterne ind i
massespektrometeret.
52
Masse spektrometri er en analytisk metode der kan give både
kvalitative, strukturen, og kvantitative, molekylærmassen eller koncentrationen, informationer
om molekyler efter de er omdannede til ioner. Der findes flere typer af massespektrometer. I
dette forsøg anvendes TOF-MS.
TOF-MS (Time-of-flight massespektrometri) er en type af massespektrometri. I denne metode
af massespektrometri opnås et massespektrum, ved at se på ionens hastighed i forhold til dens
masse (figur 5).
53
Ioner accelereres gennem et elektrisk felt og dette resulterer i, at ioner med
samme ladning opnår samme kinetiske energi. Den hastighed ionen opnår, afhænger af dens
masse-ladnings forhold.
Den tid det tager for ionen at nå detektoren, vil derfor også afhænge af ionens masse og
ladning. Dette kan måles eftersom eksempelvis tungere ioner flyver langsommere end lettere
ioner. Med kendskab til den tid det tager for ionen at nå detektoren, kan man bestemme
ionens masse-ladnings forhold, som betegnes m/z, og dermed danne et massespektrum.
Massespektrummet viser en graf, der viser signalernes relative hyppighed afhængig af deres
m/z forhold. Jo større forekomst af et molekyle med en bestemt masse, jo højere vil søjlen på
grafen være.
54
Figur 5 – TOF-MS – Tiden det tager for ionerne at nå detektoren afhænger af deres masse.
55
51
Dr. Bill Lutrell – Oklahoma Christian University
52
http://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Instruments-Systems/Mass-Spectrometry/6500-Series-
Accurate-Mass-Quadrupole-Time-of-Flight-(Q-TOF)-LC-MS/Pages/gp57723.aspx
53
Spengler, B. m.fl.
54
Ferrer, Imma, m.fl.
55
http://www.kore.co.uk/ms-200_principles.htm
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
18
Når ESI-MS kombineres med en anden metode kaldet HPLC (High-Pressure Liquid
Chromatography), der anvendes til at separere komponenter, kan denne analysere både store
og små molekyler med forskellige polariteter i en kompleks biologisk prøve. Denne proces
kaldes LC-MS.
56
HPLC (High-Pressure Liquid Chromatography) (figur 6), er en metode der anvendes til at
separere forskellige komponenter fra hinanden og karakterisere forskellige proteiner.
En solvent, kaldet den mobile fase, og en prøve, der ønskes undersøgt, føres igennem en søjle,
kaldet den stationære fase. Ved HPLC føres solventerne og prøven gennem søjlen ved hjælp
af højtrykspumper. For at opnå den ønskede separation anvendes solventer der har en
passende polaritet. Indholdet af disse solventer varierer, da succesen af separationen afhænger
af at solventerne har den rette polaritet for netop denne separation. Pumperne i HPLC’en
producerer et tryk på 15.000 kilopascal hvilket er grunden til at processen kaldes
højtryksvæskekromatografi.
Når komponenterne er separererede i søjlen ved hjælp af solventerne, føres de videre ind i en
detektor, hvor en stråle af ultraviolet lys skinner igennem dem. Det ultraviolette lys er sat til
en bølgelængde der absorberes af alle komponenterne, der skal separeres. Komponenten eller
komponenterne der absorberer UV-lyset passerer, derefter gennem detektoren. Den tid det
tager for komponenten at komme af søjlen, kaldes retentionstiden. Retentionstiden af
komponenterne udarbejdes som en graf og denne bruges til at identificere komponenterne.
Det resterende produkt transporteres videre til en separat beholder, som affald.
57
Figur 6 – HPLC processen hvor en prøve separeres.
58
56
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1853331/
57
Moldovenau, Serban C., mfl.
58
http://www.pharmacelsus.de/uploads/pics/hplc.jpg
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
19
7.3 MATERIALER OG FORSØGSOPSTILLING
6 mAb-prøver
Buffer (20mM NaAcet, 150 mM NaCl, pH 5.3)
Mikropipetter af forskellige størrelser – 5 µl og 100µl
Pipettespidser
Eppendorfrør
Mixer
Inkubator
Centrifuge
HPLC-vials
HPLC (High-Pressure Liquid Chromatography)
Solvent A -Acetonitrile med 0,1 % formic acid (Myresyre, CH
2
O
2
)
Solvent B - H
2
O med 0,1 % formic acid (Myresyre, CH
2
O
2
)
5 % isopropanol, C
3
H
8
O
ESI MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry)
Figur 7 – Figuren viser de 6 forskellige prøver, henholdsvis med og uden enzym. Til venstre
på billedet, ses bufferen, der anvendes til at fortynde prøverne.
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
20
7.4 FORSØGSBESKRIVELSE
Til forsøget anvendes to forskellige antistoffer. Medicinal firmaet oplyser ikke hvilke
specifikke antistoffer der er tale om, da dette er en firmahemmelighed. Derfor har jeg valgt at
kalde de to forskellige monoklonale antistoffer for mAb1 og mAb2.
I forsøget anvendes tre forskellige mAb1 og tre forskellige mAb2 med forskellige mængder
glukose.
De seks forskellige prøver ser således ud:
1. mAb1 – reference – fermentering under normale forhold så koncentration er 6 mg/ml
2. mAb1 – tilsat glukose så koncentrationen er 10mg/ml
3. mAb1 – tilsat glukose så koncentrationen er 16 mg/ml
4. mAb2 – reference – fermentering under normale forhold så koncentration er 6 mg/ml
5. mAb2 – tilsat glukose så koncentrationen er 10 mg/ml
6. mAb2 – tilsat glukose så koncentrationen er 16 mg/ml
Derudover har jeg 6 prøver yderligere, der anvendes som kontrol.
100 µl mAb-prøve fortyndet til 1 mg/ml i Tris buffer forberedes, så den samlede mængde
væske i hver eppendorfrør er 100µl.
Prøve
nr.
Antistof
Buffer
Koncentration
(mg/mL)
100µg
1
Reference Antistof #1
Fermentering under
normale betingelser.
6 mg/ml glukose
20mM NaAcet, 150mM NaCl,
pH5.3
13,2
100/13,2=
7,6µl
2
Antistof #1
Ekstra Glukose under
fermentering
10 mg/ml
20mM NaAcet, 150mM NaCl,
pH5.3
8,11
100/8,11=
12,3µl
3
Antistof #1
Ekstra Glukose under
fermentering
16 mg/ml
20mM NaAcet, 150mM NaCl,
pH5.3
7,69
100/7,69=
13,0µl
4
Reference Antistof #2
Fermentering under
normale betingelser.
6 mg/ml glukose
20mM NaAcet, 150mM NaCl,
pH5.3
10,8
100/10,8=
9,3µl
5
Antistof #2
Ekstra Glukose under
fermentering
10 mg/ml
20mM NaAcet, 150mM NaCl,
pH5.3
7,61
100/7,61=
13,1µl
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
21
6
Antistof #2
Ekstra Glukose under
fermentering
16 mg/ml
20mM NaAcet, 150mM NaCl,
pH5.3
6,32
100/6,32=
15,8µl
Til en af hver af prøverne tilsættes 1µl enzym (N-glycanase-plus fra prozyme
59
). Nu
indeholder seks af prøverne enzym og seks af prøverne indeholder ikke enzym. Ved at
anvende seks prøver uden enzym vil jeg efter MS’en kunne sammenligne de deglycosylerede
prøver med de oprindelige prøver. Prøverne rystes i mixeren for at blande antistofferne,
bufferen, og i halvdelen af tilfældene, enzymet. Herefter sættes prøverne i inkubatoren hvor
de inkuberes og rystes stille ved 37 °C i 3 timer. Her deglycolsylerer de seks prøver, hvor der
er tilsat enzym. Efter de 3 timer centrifugeres prøverne, ved 14.500 rpm i 10 minutter
hvorefter de tilsættes til HPLC-vials for videre analyse via LC-MS.
I HPLC systemet (High-Pressure Liquid Chromatography) er der følgende solventer.
Solvent A, Acetonitrile med 0,1 % FA (Myresyre), anvendes for at eluere, ”vaske”, prøven fra
søjlen.
Solvent B, H
2
O med 0,1 % FA (Myresyre), anvendes for at prøven binder sig til søjlen.
Som rensevæske til sprøjte og nål anvendes 5 % isopropanol, C
3
H
8
O, som bruges efter hver
injektion for at mindske ”carry over” væske.
Før prøverne kan analyseres skal massespektrometeret kalibreres. Til dette anvendes ESI lav
koncentration Tuning Mix.
Prøverne analyseres via et automatisk WorkFlow. Først laves der et prøveark i Excel, hvor
information om prøvens navn, injektionens volume, de teoretiske masser, osv. skrives ind.
60
Excel-arket bliver uploadet til en CompassOpen Acess server, hvor metoden der skal
anvendes til analysen vælges. Metoder, der anvendes, består af flere dele.
1. En HPLC metode med gradient.
2. En Q-TOF (Quadrupole-Time-of-Flight) metode, som er en metode, der beskriver
indstillingen af massespektrometeret.
3. En data-, analyse- og afrapporteringsmetode, som dekonvoluterer rå data, dvs.
omregner rå data ved hjælp af en matematisk algoritmebaseret funktion, og bearbejder
en PDF rapport med resultater.
59
Bilag 1
60
Bilag 3
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
22
Når Excel-arket er uploadet og analysemetoderne er klargjorte på computeren, placeres
prøverne i HPLC’ens autosampler. Når prøverne er indsat i HPLC’en indstilles den via
computeren, så de rigtige HPLC-vials med prøverne bliver valgt. Herefter startes programmet
og dette kører automatisk. Når programmet kører prøverne igennem maskinen separerer den
de monoklonale antistoffer via højtrykssøjlekromatografi (figur 8) og analyserer ionerne via
ESI-MS (figur 9). Når analysen af prøverne er færdige får jeg et massespektrum for hvert af
antistofferne.
Figur 8 – Den anvendte HPLC er Ultimate 3000 LC System fra Dionex.
61
Figur 9 – Det anvendte MS er micrOTOF-Q II fra Bruker Daltronic.
62
61
Billede taget på Symphogen
62
Billede taget på Symphogen
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
23
7.5 RESULTATER
Figur 10 – mAb1 med 6 mg/ml glukose – uden og med enzym
Figur 11 – mAb1 med 16 mg/ml glukose – uden og med enzym
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
24
Relative inensitet (%)
Sample ID
Antibody
[glucose]
0 glycation
1 glycation
2 glycation
3 glycation
RM40
9006
6 mg/mL
100.0
16.8
4.5
0
4360
9006
10 mg/mL
100.0
25.0
6.6
0
4361
9006
16 mg/mL
100.0
35.3
10.9
2.7
RM41
9338
6 mg/mL
100.0
17.3
4.5
0
4358
9338
10 mg/mL
100.0
22.3
5.3
0
4359
9338
16 mg/mL
100.0
34.3
10.1
2.0
Relative intensitet (%)
Sample
ID
Antibod
y
[glucose
]
Man5-
Man5
A1G0F/G
0F
G0F/G0
F
G0F/G1
F
G1F/G1
F
G1F/G2
F
G2F/G2
F
RM40
9006
6 mg/mL
2.1
15.9
100.0
74.8
40.2
12.4
3.3
4360
9006
10
mg/mL
N.D.
13.5
100.0
72.8
34.1
11.0
2.3
4361
9006
16
mg/mL
1.6
15.9
100.0
70.6
32.1
10.6
2.7
RM41
9338
6 mg/mL
18.1
33.6
100.0
34.7
10.5
2.3
0
4358
9338
10
mg/mL
10.9
29.5
100.0
56.1
20.2
4.7
0
4359
9338
16
mg/mL
11.8
34.0
100.0
58.7
22.0
6.7
0.4
Figur 12 – Graf over Glykering 1 og glykering 2 for de tre mAb1 antistoffer.
Tabel 1 – Prøver med tilsat enzym
Tabel 2 – Prøver uden enzym
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
25
7.6 DATABEHANDLING
Graferne viser massespektrummerne for de testede prøver. Hver top på graferne repræsenterer
en masse, som svarer til et bestemt molekyle. Den øverste graf på figur 10 og 11, viser
henholdsvis mAb1 med 6 mg/ml uden enzym og mAb1 med 16 mg/ml uden enzym. De viser
derfor de forskellige glycoformer, som indgår i antistoffets struktur. Den nederste graf på
figur 10 og 11, viser prøverne, hvor enzymet er tilsat. Eftersom disse prøver er
deglycosylerede, viser graferne antallet af glykeringer, som er blevet dannede under forsøget.
Ved at måle intensiteten af hver top, kan man beregne deres relative intensitet. Den mest
intense top sættes derfor til at være 100 %. Tabellerne viser den relative intensitet af de
forskellige graftoppe.
I tabel 1 kan det aflæses, at glykeringen stiger når glukosekoncentrationen stiger. For
eksempel stiger intensiteten af graftoppen, svarende til en glykering, fra 16,8 % til 35,3 % for
mAb1, når der tilsættes 16 mg/ml under fermenteringen i stedet for 6 mg/ml. Figur 12 viser
procentdelen af 1. og 2. glykering, som funktion af glukosekoncentrationen. Det er her
tydeligt at både 1. og 2. glykering er mere markante for mAb1 med 16 mg/ml glukose end for
mAb1 med 10 mg/ml glukose og endnu mere markante, end for mAb1 med 6 mg/ml glukose.
I tabel 2, og i det øverste af figur 10 og 11, aflæses antistoffernes glykosyleringsprofiler. Det
er her svært at se om der er en sammenhæng mellem antistoffernes koncentration af glukose
og deres glykosyleringsprofiler. Nogle graftoppe stiger og nogle falder uden at vise noget
tydeligt mønster. I tabel 2 kan det for eksempelvis aflæses, at intensiteten for G0F/G1F falder
når koncentrationen af glukose stiger for mAb1, men stiger samtidigt med at koncentrationen
af glukose stiger for mAb2. I bilag 4 ses de resterende grafer med glykeringer og
glykosyleringsprofiler for hver af prøverne.
7.7 VURDERING AF USIKKERHEDER OG FEJLKILDER
Ved anvendelse af måleinstrumenter og apparaturer vil der altid forekomme visse
unøjagtigheder. Disse unøjagtigheder kan komme til udtryk på graferne, der udarbejdes på
computeren, efter prøverne har været igennem massespektrometeret. Unøjagtighederne er en
parameter, der ikke kan gøres noget ved.
En stor del af forsøget indebærer opmålinger og blanding af forskellige komponenter. Dette
gøres i åbent rum og der kan derfor ske en uforskyldt tilsætning af uønskede stoffer når
proppen er taget af eppendorfrørene, hvilket kan have en effekt på indholdet.
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
26
Derudover kan der være opstået luftbobler i eppendorfrørene, hvis ikke pipetten har været
håndteret korrekt, hvilket er svært når der arbejdes med så små mængder af væske. Dette kan
medføre, at den totale mængde væske i eppendorfrøreren ikke stemmer overens med den
ønskede. Derudover kan det påvirke LC-MS’en så uklare resultater opnås.
En anden parameter, der kan have indflydelse på resultatet af forsøget, er ændringen i
temperatur. Nogle kemiske komponenter reagerer, som følge af ændringer i temperatur. Da
prøverne er blevet flyttet mellem forskellige rum, kan de have været udsat for temperaturskift
hvilket kan have en indflydelse på resultatet.
En eventuel forbedring af forsøget, kunne dermed være at udførslen skete under endnu mere
kontrollerede forhold. Dette er dog højst sandsynligt ikke en faktor der ville ændre på
forsøgsresultaterne, eftersom Symphogens laboratorielokaler er sterile og der på forhånd er
taget forbehold for disse mulige fejlkilder.
7.8 FORSØGSKONKLUSION
Det er tydeligt at fermenteringen af antistofferne i medie med høj glukosekoncentration, har
en effekt på mængden af glykering. Dette ses tydeligt ud fra massespektrummerne som
graferne viser. Derimod kan vi ikke se en fast sammenhæng i prøvernes
glykosyleringsprofiler i tabel 2. Vi må derfor konkludere at der ikke er nogen klar korrelation
mellem koncentrationen af glukose og antistoffernes glykosyleringsprofiler.
Det næste skridt i den analytiske proces af fremstillingen af monoklonale antistoffer, ville
være at undersøge om den øgede glykering påvirker antistoffets biologiske effekt. Hvis dette
er tilfældet, så er glukose koncentrationen og dermed glykeringen, en kritisk parameter, som
skal kontrolleres nøje i produktionen af monoklonale antistoffer.
8. ANVENDELSE AF MONOKLONALE ANTISTOFFER TIL
BEKÆMPELSE AF CANCER
Monoklonale antistoffer er ideelle som medicin til behandling af en lang række
cancersygdomme. Grunden til dette er at de, som tidligere nævnt, kan binde sig til meget
specifikke strukturer og dermed være et vigtigt led i bekæmpelsen af uønskede bakterier og
celler som for eksempel cancerceller.
63
Monoklonale antistoffer produceres så de ligner de
antistoffer immunsystemet selv producerer mest muligt.
63
http://www.morphosys.com/sites/default/files/annual_reports/morphosys-2003-annualreport-04-Magazine.pdf
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
27
Et monoklonalt antistof kan være et led i bekæmpelsen af en cancercelle på flere forskellige
måder. Overordnet er monoklonale antistoffers funktion at vedhæfte sig til en cancercelle. Når
det har vedhæftet sig til cancercellen, kan det have flere forskellige effekter.
Det monoklonale antistof kan gøre cancercellen, der er dannet ud fra en af kroppens egne
celler, mere synlig til immunsystemet. De monoklonale antistoffer kan dannes så de
vedhæfter sig på en bestemt del af cancercellen. For eksempel kan det monoklonale antistof
Rituximab, vedhæfte sig til et bestemt protein kaldet CD20 der kun findes på B-celler.
Dermed gør det monoklonale antistof kroppen opmærksom på, at der er en cancercelle i
kroppen, der skal bekæmpes. Derfra tager immunsystemet over og bekæmper cancercellerne
som beskrevet i afsnit 5.2 om det specifikke immunsystem. Rituximab vil dermed sænke
antallet af B-celler i kroppen, men kroppen vil producere nye raske B-celler og der vil være
mindre sandsynlighed for, at cancer B-cellerne vil forekomme.
Et andet eksempel på et monoklonalt antistof, der kan være et led i bekæmpelsen af cancer er
Cetuximab. Cancercellen har mistet evnen til kontrolleret celledeling, som nævnt i afsnit 3 om
cancercellen. Dette skyldes, udover ændringen i DNA’et, at celler har nogle
vækstfaktorreceptorer der fortæller cellen hvornår den skal dele sig. Nogle cancerceller laver
ekstra kopier af vækstfaktorreceptorerne, hvilket er med til at forårsage at cancercellen deler
sig ukontrolleret. Cetuximab er i stand til at blokere vækstfaktorreceptorerne hvilket gør at
signalet om celledeling ikke når ind til cancercellens cellekerne. Dette kan medføre at
cancercellen ikke fortsætter sin celledeling, og det kan derfor stoppe cancer fra at sprede sig
til resten af kroppen.
Som tidligere nævnt behøver en malign tumor næringsstoffer og oxygen for at overleve og
vokse, kaldet angiogenese. For at få de nødvendige næringsstoffer og den nødvendige ilt,
udsender cancercellerne signaler om at den skal vokse, hvilket tiltrækker blodkar. Det
monoklonale antistof Bevacizumab kan blokere de voksesignaler, cancercellen sender ud.
Dermed kan tumoren ikke få de nødvendige næringsstoffer og den nødvendige ilt, og dette
resulterer i at tumoren stopper med at vokse og i nogle tilfælde begynder den at skrumpe.
Som et sidste eksempel på hvordan monoklonale antistoffer kan virke som et led i
bekæmpelsen af cancer, nævnes de to typer monoklonale antistoftyper, Ibritumomab og Ado-
trastuzumab emtansine. Disse to typer af monoklonale antistoffer kan transportere
henholdsvis stråling og kemoterapi, direkte til cancercellen. Dette sker ved, at de
monoklonale antistoffer, som indeholder henholdsvis stråling og kemoterapi, vedhæfter sig på
cancercellens receptorer. Cancercellen optager antistoffet og antistoffet udskiller derefter
enten den kemoterapeutiske medicin eller stråling, hvilket slår cancercellen ihjel. Ved at
behandle cancerpatienter med kemoterapi og stråling på denne måde, skades de
omkringliggende celler ikke, som de ellers ville blive, hvis den typiske form for kemoterapi
og strålingsbehandling anvendtes.
64
64
http://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/cancer/in-depth/monoclonal-antibody/art-
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
28
Dette er blot nogle af de monoklonale antistoffer, der er på markedet i dag og anvendes til
bekæmpelse af cancer. Der forskes hele tiden i hvordan bivirkningerne kan mindskes og
effektiviteten af behandlingen kan forbedres. Ved antistofbehandling indsprøjtes disse i
kroppen. Når en cancerpatient behandles med monoklonale antistoffer, kan der opstå en
allergisk reaktion som kan forårsage feber, kvalme, opkast, kløe, udslæt osv. Disse
bivirkninger kan forsvinde forholdsvist hurtigt, men hvis kroppen reagerer kraftigere på det
ukendte stof, kan det forårsage astmaanfald, hævelse i ansigt og hals og fald i blodtrykket.
Risikoen for disse bivirkninger kan mindskes, ved at man før injektionen med det
monoklonale antistof, indsprøjter antihistamin og i visse tilfælde også binyrebarkhormon i
den cancerramte patient.
65
Bivirkningerne opstår når kroppen reagerer på at den modtager et
stof som den ikke kender til eller som den er overfølsom over for.
66
Generelt er de
bivirkninger, som de monoklonale antistoffer forårsager, forholdsvis milde i forhold til andre
behandlingsformer, som dem nævnt i kapitel 4.
Et overordnet problem, med mange af disse nuværende anvendte behandlingsformer med
monoklonale antistoffer, er at tumoren hurtigt udvikler resistens mod et enkelt antistof. Derfor
er en enkel behandling ikke nok, og cancerpatienter skal derfor ofte være i behandling i lange
perioder. Desuden er en stor del af de kemisk fremstillede antistoffer, meget forskellige i
deres struktur, i forhold til de antistoffer, der findes naturligt i kroppen og dette kan medføre
adskillelige bivirkninger.
Symphogen har udviklet en blanding af monoklonale antistoffer. Her indgår flere forskellige
antistoffer, der kan binde sig på flere forskellige steder på cancercellens receptorer og dermed
forstærke virkningen af alle antistofferne, så tumoren med mindre sandsynlighed udvikler
resistens. Antistofferne, kan ved at samarbejde, danne tværbindinger, der fjerner receptorerne
fra cancercellens overflade. Dette medfører at cancercellen ikke er i stand til at dele sig eller
vokse, hvilket resulterer i at tumoren skrumper og i sidste ende forsvinder. Udviklingen af
denne blanding af antistoffer, har været et stort skridt i retningen af bekæmpelsen af
cancersygdomme, og Symphogen forsker fortsat i hvordan de kan optimere deres produkt og
dermed komme nærmere en endnu mere effektiv behandling.
67
9. KONKLUSION
En af grundene til, at cirka 30 % af al den medicin der lanceres gennem det næste århundrede
vil være baseret på antistoffer, er at indsprøjtning med monoklonale antistoffer, er blevet en
65
http://www.cancer.dk/non-hodgkin-lymfom-lymfekraeft/behandling-nonhodgkin-lymfom/antistof-non-
hodgkin/
66
http://www.apoteket.dk/Laegemidler/Bivirkninger/Generelt%20om%20bivirkninger/Hvorfor%20har%20medic
in%20bivirkninger.aspx
67
http://www.symphogen.com/da/frontpage
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
29
velanset behandlingsmetode. Dette skyldes antistoffernes specificitet, effektivitet og de
forholdsvis få bivirkninger de kan medføre, i forhold til andre behandlingsmetoder.
Det at fremstille monoklonale antistoffer er en lang og kompliceret proces. Monoklonale
antistoffer stammer fra en levende cellelinje og der er dermed stor risiko for at de varier i
deres opbygning og struktur. Når antistofferne er forskellige i deres struktur, har de også
forskellige virkninger. De monoklonale antistoffers struktur er derfor en af de kritiske
parametre, eftersom strukturen er altafgørende for antistoffernes virkning og dermed for
behandlingsresultatet.
En af de faktorer der spiller ind på det monoklonale antistofs struktur, er hvordan det
produceres. I forbindelse med produktionen af monoklonale antistoffer, er
glukosekoncentrationen en vigtig parameter. Koncentrationen af glukose under fermentering
af antistoffer, har stor indflydelse på antistoffets mængde af glykering. Det er derfor vigtigt, at
produktionen af monoklonale antistoffer sker under kontrollerede forhold.
Symphogen er en medicinalvirksomhed, der med deres mAb blanding, har fremstillet et
produkt, der ligger utroligt tæt på den naturlige antistofrespons, som sker i kroppen. Et
produkt bestående af flere antistoffer, der dermed har evnen til at behandle flere steder i
kroppen på en gang, gør det muligt at behandle komplekse sygdomme som for eksempel
cancer.
Selvom monoklonale antistoffer har været en anvendt behandlingsform i mange år, er en stor
del af udviklingen stadig i startfasen. Der er et utal af muligheder med monoklonale
antistoffer og medicinalvirksomheder forsker aktivt i, at finde det bedst egnede produkt til
bekæmpelsen af cancer. Der går højst sandsynligt mange år endnu, før et endeligt medicinsk
produkt, der med garanti kan helbrede alle cancersygdomme, er på markedet. Men hvis det er
en mulighed, at en sygdom som cancer, med garanti, kan helbredes i fremtiden, ved at
indsprøjte små, specifikke, Y-formede proteiner i kroppen, så er den aktive og intense
forskning nået langt.
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
30
10. LITTERATURLISTE
Videnskabelige artikler:
Chung, Shan, Valerie Quarmby, Xiaoying Gao, Yong Ying, Linda Lin, Chae Reed, Chris Fong, Wendy Lau,
Zhihua J. Qiu, Amy Shen, Martin Vanderlaan and An Song, 2012, Quantitative evaluation of fucose reducing
effects in a humanized antibody on Fcγ receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
activities, San Francisco.
Goetze, Andrew M, Y Diana Liu, Thomas Arroll, Lily Chu, and Gregory C Flynn, 2011, Rates and impact of
human antibody glycation in vivo.
Jefferis, Roy, 2005, Glycosylation of Recombinant Antibody Therapeutics, Birmingham.
Jefferis, Roy, 2009, Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Bilag 2)
Putnam, Wendy S., Saileta Prabhu, Yanan Zheng, Meena Subramanyam and Yow-Ming C. Wang,
Pharmacokinetic, pharmacodynamics and immunogenicity comparability assessment strategies for monoclonal
antibodies
Shade, Kai-Ting C. and Robert M. Anthony, 2013, Antibody Glycosylation and Inflammation, Charlestown.
Bøger:
Bidstrup, B. B. & Schou, B., 2011. Bioteknologi 4. 1. red. Århus: nucleus.
Bruun, K., Geertsen, P. B. & Helmig, K., 2011. Grundbog i Bioteknologi 2. 1. red. Århus: Gyldendal.
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
31
Falkenberg, H., Gasbjerg, P. K. & Nielsen, L. H., 2008. Fysiologi Fra molekyle til individ. 2. red. Århus:
Systime.
Ferrer, I. & Thurman, E. M., 2009. Liquid chromatography-Time of Flight Mass Spectrometry: Principles, Tools
and Applications for Accurate Mass Analysis.. 1. red. New York: Wiley.
Grau, C., 2006. Strålebehandling af kræft. Månedsskrift for Praktisk Lægegerning, Februar, pp. 2-3.
Kristjansen, P., 2001. Kræft -Hvad er det?. 1. red. Viborg: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck A/S.
Moldoveanu, S. C. & David, V., 2013. Essentials in modern HPLC Separations. 1. red. s.l.:Elsevier.
Skadhede, T., Selschau, K. & Abildgaard, K., 2008. Biologiens FG. 1. red. Knebel: Forlaget KATS.
Spengler, B., Kirsch, D., Kaufmann, R. & Cottor, R., 1991. Rapid Comunications in MassSpectrometry. 5. red.
Düsseldorf: Wiley.
Sørensen, A. B., Falkenberg, H., Gasbjerg, P. K. & Jensen, G. S., 2005. Genetik Grundbog. 1. red. Århus:
Systime.
Hjemmesider:
Agilent Technologies, u.d. Agilent Technologies. [Online]
Available at: http://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Instruments-Systems/Mass-
Spectrometry/6500-Series-Accurate-Mass-Quadrupole-Time-of-Flight-(Q-TOF)-LC-MS/Pages/gp57723.aspx
[Senest hentet eller vist den 11. december 2014].
American Cancer Society, 2014. American Cancer Society. [Online]
Available at: http://www.cancer.org/cancer/cancerbasics/what-is-cancer
[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].
Ammundsen, I. N., 2012. Kræftens Bekæmpelse. [Online]
Available at: http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/bivirkninger-senfolger/gode-raad-ved-
haartab/aarsager-til-haartab/
[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].
Ammundsen, I. N. & Pedersen, J. O. B., 2014. Kræftens Bekæmpelse. [Online]
Available at: http://www.cancer.dk/non-hodgkin-lymfom-lymfekraeft/behandling-nonhodgkin-lymfom/antistof-
non-hodgkin/
[Senest hentet eller vist den 10. december 2014].
Brown, D. P., u.d. Doch Brown's Chemistry. [Online]
Available at: http://www.docbrown.info/page04/4_71atomMSintro.htm
[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].
Cancer Treatment Centers of America, 2014. Cancer Treatment Centers of America. [Online]
Available at: http://www.cancercenter.com/what-is-cancer/
[Senest hentet eller vist den 8. december 2014].
cancer.net, 2014. cancer.net. [Online]
Available at: http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/surgery/side-effects-surgery
[Senest hentet eller vist den 14. december 2014].
Cancer.net, 2014. cancer.net. [Online]
Available at: http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/surgery/what-cancer-surgery
[Senest hentet eller vist den 8. december 2014].
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
32
Genengnews, 2014. genengnews.com [Online]
Available at:
http://www.genengnews.com/media/images/AnalysisAndInsight/UGENWebsitepicturesTopStoriesAnalysisInsig
ht2011Jan31_2011_3398153_AntibodiesRWBCs_BiosimilarAntibodies54.jpg
[Senest hentet eller vist den 17. december 2014]
Hansen, M. T. & Kjems, E., 2011. Kræftens Bekæmpelse. [Online]
Available at: http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/behandlingsformer/kemoterapi/bivirkninger-
kemoterapi/
[Senest hentet eller vist den 14 december 2014].
Hansen, M. T. & Kjems, E., 2013. Kræftens Bekæmpelse. [Online]
Available at: http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/behandlingsformer/operation/
[Senest hentet eller vist den 7. december 2014].
Ho, C. et al., 2003. The Clinical Biochemist Reviews. [Online]
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1853331/
[Senest hentet eller vist den 10. december 2014].
Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W.-S. & Yap, M. G. S., u.d. CHO Consortium. [Online]
Available at: http://www.aiche.org/sites/default/files/docs/pages/CHO.pdf
[Senest hentet eller vist den 15. december 2014].
Kore Technology, 2005. Kore Technology. [Online]
Available at: http://www.kore.co.uk/ms-200_principles.htm
[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].
Luttrell, D. B., 2013. Oklahoma City University. [Online]
Available at: https://www.youtube.com/watch?v=VJtd76BI6w8
[Senest hentet eller vist den 14. december 2014].
Mayo Clinic Staff, 2007. Monoclonal Antibody drugs for cancer: How they work. [Online]
Available at: http://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/cancer/in-depth/monoclonal-antibody/art-
[Senest hentet eller vist den 12. decmeber 2014].
MCQ Biology, u.d. MCQ Biology. [Online]
Available at: http://www.mcqbiology.com/2013/01/mcq-on-immunology-antibodies-or.html
[Senest hentet eller vist den 15. december 2014].
Morphosys, u.d. Morphosys. [Online]
Available at: http://www.morphosys.com/sites/default/files/annual_reports/morphosys-2003-annualreport-04-
Magazine.pdf
[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].
National Cancer Institute, 2013. National Cancer Institute. [Online]
Available at: http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/Therapy/biological
[Senest hentet eller vist den 11. december 2014].
Pharma Celsus, u.d. Pharma Celsus. [Online]
Available at: http://www.pharmacelsus.de/uploads/pics/hplc.jpg
[Senest hentet eller vist den 10. december 2014].
Sanofi, 2014. Sanofi. [Online]
Available at: http://en.sanofi.com/event/Sanofi_TV_Cancer.aspx
[Senest hentet eller vist den 10. december 2014].
SciGuru, 2010. SciGuru. [Online]
Available at: http://www.sciguru.org/newsitem/5082/Daring-Tumors-Tumor-Cells-Make-Their-Own-Blood-
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
33
Vessels
[Senest hentet eller vist den 9. december 2014].
Smed, H., 2013. Apoteket.dk. [Online]
Available at:
http://www.apoteket.dk/Laegemidler/Bivirkninger/Generelt%20om%20bivirkninger/Hvorfor%20har%20medici
n%20bivirkninger.aspx
[Senest hentet eller vist den 16. decemeber 2014].
Statens Serum Institut, 2013. Statens Serum Institut - Cancerregisteret. [Online]
Available at: http://www.ssi.dk/~/media/Indhold/DK%20-
%20dansk/Sundhedsdata%20og%20it/NSF/Registre%20og%20kliniske%20databaser/Registre/Cancerregisteret
%202013.ashx
[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].
Symphogen, 2014, symphogen.com [Online]
Available at: http://www.symphogen.com/da/frontpage
[Senest hentet eller vist den 17. december]
Symphogen, 2014, symphogen.com [Online]
Available at: http://www.symphogen.com/da/why-mab-mixtures
[Senest hentet eller vist den 17. december]
Thorsted, C. K., 2014. Pharma Danmark. [Online]
Available at: https://www.pharmadanmark.dk/aktuelt/pharma/Documents/2014-april/Pharma04-2014_s22-
25.pdf
[Senest hentet eller vist den 14. december 2014].
Zaidan, G., u.d. TEDEd. [Online]
Available at: http://ed.ted.com/lessons/how-do-cancer-cells-behave-differently-from-healthy-ones-george-zaidan
[Senest hentet eller vist den 10. december 2014].
11. BILAG
Bilag 1:
Bilag 3: Samplesheet
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
34
Bilag 4:
mAb1 med 10 mg/ml glukose – uden og med enzym
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
35
mAb2 med 6 mg/ml glukose – uden og med enzym
mAb2 med 10 mg/ml glukose – uden og med enzym
Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]
36
mAb2 med 16 mg/ml glukose – uden og med enzym