SRO om enzymer i vaskemidler i Biologi A og Matematik A

Side 1

Enzymer i vaskemidler

SRO i biologi og matematik

Side 2

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 2 af 21

English Abstract

This paper examines enzyme kinetics, especially enzyme activity and how it depends on tempera-ture and pH value.

In the first part of the paper that is done by using theory and touching on enzymes’ general proper-ties. Subsequently the theory is proven in an experiment with the enzyme catalase, in which the constituted oxygen per second is seen as the enzyme activity. The two factors, temperature and pH value, are changed independently of each other to find out how they influence that activity. After-wards the results are processed mathematically and discussed by comparing with the theory. To put in into a biological context the results of the theory and the experiment are used to describe en-zymes’ function in detergents.

To sum up the results of the study, it shows that there is a tremendous connection between enzyme activity and temperature as well as pH value, but in different ways: While a pH value far away from an enzyme’s optimum only makes the enzyme incompetent for a while, denaturation as a conse-quence of too high degrees is an irreversible process, which means that it puts the enzyme out of action forever. Consequently these observations are very important to the detergent industry, and while the industry can take advantage of some properties, genetic engineering is needed to avoid the problems of the enzyme activity’s dependence on temperature and pH value.

Side 3

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 3 af 21

Indholdsfortegnelse

1. Indledning og problemformulering ........................................................................................................... 4

2. Enzymer – praktiske proteiner .................................................................................................................. 5

2.1 Hvad er enzymer? ................................................................................................................................... 5

2.2 Hvordan de virker ................................................................................................................................... 5

2.2.1 Kemiske reaktioner og energibarrieren ............................................................................................ 5

2.2.2 Enzymernes evne til at sænke energibarrieren ................................................................................. 6

2.3 Indflydelsesrige faktorer ......................................................................................................................... 6

2.3.1 Temperatur ....................................................................................................................................... 6

2.3.2 pH .................................................................................................................................................... 7

3. Forsøg med enzymet katalase ..................................................................................................................... 8

3.1 Formål og hypotese ................................................................................................................................. 8

3.2 Fremgangsmåde ...................................................................................................................................... 8

3.3 Resultater................................................................................................................................................. 9

3.4 Behandling af resultaterne ....................................................................................................................... 9

3.4.1 Fratagne resultater ............................................................................................................................ 9

3.4.2 Oxygenvolumen som funktion af tiden ............................................................................................ 9

3.4.3 Initialhastigheden som udtryk for enzymaktiviteten ........................................................................ 9

3.4.4 Initialhastighed som funktion af pH-værdien ................................................................................ 10

3.4.5 Initialhastighed som funktion af temperaturen .............................................................................. 10

3.5 Fejlkilder ............................................................................................................................................... 11

3.6 Vurdering af resultaterne ....................................................................................................................... 11

3.6.1 Initialhastighed som funktion af pH-værdi .................................................................................... 11

3.6.2 Initialhastighed som funktion af temperatur .................................................................................. 12

4. Perspektivering til vaskemidler ................................................................................................................ 13

4.1 Enzymer i vaskemiddelindustrien ......................................................................................................... 13

4.2 Vigtige vaskemiddelenzymer: Proteaser, amylaser, lipaser og cellulaser ............................................. 13

4.2.1 Proteaser......................................................................................................................................... 13

4.2.2 Lipaser ........................................................................................................................................... 13

4.2.3 Amylaser ........................................................................................................................................ 14

4.2.4 Cellulaser ....................................................................................................................................... 14

4.3 Enzymaktivitetens betydning for vaskemidler ...................................................................................... 14

4.3.1 Høj enzymaktiviteten ved lavere vasktemperaturer ....................................................................... 14

4.3.2 Enzymers pH-optimum omkring 7 vs. de alkaliske opvaskemidler .............................................. 14

4.3.3 Tiltag for at optimere enzymaktiviteten ......................................................................................... 15

5. Konklusion ................................................................................................................................................. 16

6. Litteraturliste ............................................................................................................................................. 17

6.1 Bøger ..................................................................................................................................................... 17

6.2 Artikler .................................................................................................................................................. 17

6.3 Hjemmesider ......................................................................................................................................... 17

6.4 Lånte figurer .......................................................................................................................................... 17

7. Bilag ............................................................................................................................................................ 18

7.1 Tabeller – de rå data .............................................................................................................................. 18

7.1.1 Oxygenvolumen per tid ved forskellige pH-værdier ..................................................................... 18

7.1.2 Oxygenvolumen per tid ved forskellige temperaturer ................................................................... 18

7.2 Grafer .................................................................................................................................................... 19

7.2.1 Oxygenvolumen per tid ved forskellige pH-værdier ..................................................................... 19

7.2.2 Oxygenvolumen per tid ved forskellige temperaturer ................................................................... 20

7.2.3 Initialhastighed som funktion af pH-værdi .................................................................................... 20

7.2.4 Initialhastighed som funktion af temperatur .................................................................................. 21

Side 4

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 4 af 21

1. Indledning og problemformulering

Med deres katalyseevne er enzymer blandt de vigtigste bestanddele af levende celler. Men ikke kun i naturlig sammenhæng er enzymerne velkendte. Også vaskemiddelindustrien har siden 1960’erne for alvor forstået at sætte pris på enzymer, fordi de har vist sig at kunne nedbryde forskellige stoffer

(ligesom i fx fordøjelsessystemet), hvilket tensiderne i vaskemidler ikke er i stand til.

Men enzymer virker ikke lige godt under forskellige omstændigheder, og det må vaskemiddelproducenter vel også være opmærksomme på, så at nytten af de små, komplekse stoffer ikke – bogstaveligt talt – går i vasken.

Denne problematik har været grundlaget for min problemformulering:

Hvordan drager man i vaskemidler nytte af enzymers egenskaber, og på hvilken måde tager man i den sammenhæng hensyn til enzymaktivitetens afhængighed af temperatur og pH?

▪ Jeg vil først redegøre for enzymer generelt, hvordan de virker, og hvad enzymaktiviteten påvirkes af.

▪ Dernæst vil jeg gennem et forsøg med enzymet katalase undersøge enzymkinetikken fra en mere induktiv vinkel, og vil, uden dog at glemme teorien, behandle resultaterne matematisk.

▪ Jeg vil herefter kort vurdere forsøgets udfald.

▪ Til sidst vil jeg perspektivere til enzymers funktion i vaskemidler og se på, hvilken betydning enzymaktiviteten har i forbindelse hermed.

Side 5

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 5 af 21

2. Enzymer – praktiske proteiner

2.1 Hvad er enzymer?

Enzymer er en bestemt type proteiner, nemlig katalysatorer, som forøger hastigheden af kemiske reaktioner. Enzymer er til stede i enhver levende celle, og det er der en god grund til, for selvom kemiske reaktioner godt ville kunne finde sted uden enzymer, så ville det i praksis foregå alt for langsomt til, at cellen ville kunne leve ret længe.

Udover at bestå af aminosyrer (som ethvert protein), indeholder de fleste enzymer også en mindre ikke-proteindel, som kaldes en cofaktor, og som også er nødvendig for at enzymet kan fungere.

Desuden er der en meget lille del af proteinandelen, som kaldes enzymets aktive center. Dette består oftest kun af 6-12 aminosyrer [1], men alligevel har det en afgørende betydning for enzymet: Det er nemlig her, substratet (dvs. det eller de molekyler, som enzymet skal ændre på) binder sig til enzymet, og hvor den egentlige katalyse finder sted ved at fremme eller bryde bindinger i eller mellem substrat(erne). Processen kan illustreres således:

EBAABEEAB ++⎯→←⎯→←+

Substratet (AB) sætter sig på enzymets aktive center, hvorefter de sidder samlet i et såkaldt aktivt kompleks. Substratet spaltes, og tilbage er produkterne (A og B) og det frie enzym. Idet at reaktionspilene vender begge veje, kan reaktionen også fungere omvendt (flere substrater som

                 2
bliver til ét produkt).

Der findes også få andre kemiske katalysatorer, som ikke er enzymer, men i modsætning til disse er enzymer meget specifikke, dvs. at de normalt kun katalyserer én proces, og at det involverede substrat, skal være et helt bestemt. Denne specificitet hænger i stor grad sammen med det aktive centers rumlige struktur, som substratet skal passe meget nøje ind i, næsten som en nøgle i et nøglehul, sådan som Emil Fischer beskrev de i 1894. Denne ”nøgle og nøglehuls-model” har dog været diskuteret og kan nu om dage måske anses som ’forsimplet’. ”Induced fit”-hypotesen, som påstår, at en det aktive center kan ændre sin form en smule, når de kommer i kontakt med substratet,

er mere anerkendt.^{3}

2.2 Hvordan de virker

2.2.1 Kemiske reaktioner og energibarrieren

For at forså princippet bag katalysen, må man først kigge på, hvordan kemiske reaktioner forløber uden enzymer. Ved exergone dvs. spontane reaktioner vil der blive frigivet energi (fx i form af varme), og det betyder, at der sker en ændring i mængden af fri energi i reaktanterne til den i produkterne, også selvom den samlede energimængde i produkterne of omgivelserne med al respekt for termodynamikkens 1. hovedsætning selvfølgelig forbliver ens. Denne ændring i fri energi betegnes ∆G, og kan som ligning udtrykkes således:

1

Hjemmeside: Biotechacademy, Enzymers specificitet

2

Bog: Biologiens Abc. Biokemi, s. 33-34

3

Hjemmeside: Wikipedia EN, Enzymes, Specificity

Side 6

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 6 af 21 terreakprodukter

−=Δ GGG_{tan}

Men på trods af, at en reaktion er spontan (dvs. ∆G < 0), betyder det i de fleste tilfælde alligevel ikke, at den vil forekomme uden ekstra energi udefra. Der er nemlig en såkaldt energibarriere (se figur 1), som er højere end den fri energi, der findes i reaktanterne – og for at komme op på et energiniveau på højde med energibarrieren (så at den endelige reaktion kan finde sted) kræver det aktiveringsenergi (E). Denne energi kan godt være i form af varme – fx når man sætter ild til papir.

a

Papiret vil ikke bryde ud i flammer af sig selv, men når man tilfører varmeenergi, passeres energibarrieren, og en reaktion (forbrænding) kan finde sted. Mange steder (fx i kroppen) er det dog ikke muligt at komme op på så høje temperaturer – cellerne ville simpelthen dø inden. [4]

2.2.2 Enzymernes evne til at sænke energibarrieren

I stedet for at skulle tilsætte aktiveringsenergi gennem varme, kan enzymerne kan på forskellig vis sænke energibarrieren, så den nødvendige aktiveringsenergi E ikke behøver at være så a høj (se figur 1) – og at der således er mange flere reaktioner, der finder sted. Og det smarte ved dette er, at enzymerne netop virker under milde omstændigheder: fx ved kropstemperaturer og i omgivelser med en pH-værdi ikke så langt fra neutral.

Virkningsmåden er simpel. Enzymet gør substratets bindinger

ustabile, så det lettere spaltes eller danner nye bindinger. Det_{Figur 1.}

sker på tre overordnede måder:

▪ Enzymet kan ved hjælp af det aktive centers rumlige struktur orientere to eller flere substratet rigtigt, så de sidder præcis i det rigtige forhold til hinanden til at indgå i en reaktion.

▪ Enzymets aktive center kan også udveksle protoner, elektroner eller andre ladede partikler med substratet.

▪ Enzymet kan ændre en smule på sin form (induced fit) og vride eller hive i substratet.^{5}

Det er værd at bemærke, at enzymerne ikke deltager i den kemiske reaktion; de katalyserer den kun, og det betyder, at de heller ikke bliver brugt op. Efter at have katalyseret en reaktion, er enzymet i stand til at gøre det samme igen og igen. I grunden kan de genbruges utallige gange.

2.3 Indflydelsesrige faktorer

På trods af, at enzymer egentlig aldrig bliver brugt op, er der alligevel en række faktorer, som i en periode eller for altid kan sætte enzymerne ude af stand til at fungere, eller som bedre sagt har indflydelse på enzymernes aktivitet – både i den ene og den anden retning.

2.3.1 Temperatur

Jo højere temperatur, jo hurtigere bevæger molekyler sig, og jo flere substrater rammer de rigtige enzymer i løbet af et bestemt tidsinterval. Det er baggrunden for, at enzymers aktivitet forøges, jo

4

Bog: Biokemi og molekylærbiologi, s. 118-119

5

Hjemmeside: Biotechacademy, Enzymers virkemåde

Side 7

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 7 af 21 højere temperaturen er (se figur 2). Som det dog også kan ses af figuren, falder enzymaktiviteten ved en bestemt temperatur drastisk. Det hænger sammen med, at enzymerne som tidligere nævnt er proteiner (i hvert fald til størstedelen) og således består af en lang kæde aminosyrer, som sidder på en helt speciel måde. Når enzymet udsættes for for høj temperatur, denaturerer det: Aminosyrerne vikles ud, og det aktive center ødelægges.

Processen er irreversibel i næsten alle tilfælde, fordi intet vil kunne give enzymet dets oprindelige form og dermed også dets specifikke aktive center igen, og det betyder, at når enzymet først er denatureret,

                                 6
vil det aldrig mere være funktionsdygtigt.

Hvor høj en temperatur et enzym kan holde til, varierer fra enzym til enzym, og det samme gør optimum (hvor enzymaktiviteten er højest), men det vil ofte ligge mellem 30 °C og 60 °C – og alle enzymer er denatureret ved en temperatur på 100 °C.

2.3.2 pH pH-værdien i enzymets omgivelser har ligeledes betydning for enzymaktiviteten. Som man kan se det på figur 3, kan dette grafisk fremstilles som en klokkeformet kurve med optimum i midten. Det forklares ved, at enzymernes aminosyrer er positivt eller negativt ladede afhængt af pH-værdien, og enzymets rumlige struktur (også det aktive center) ændres således, når enzymet er i omgivelser med højere eller lavere pH-værdier end netop dets optimum-pH. Normalt er enzymet dog i stand til at fungere igen, når det udsættes for dets pH-

værdier tæt på dets optimum.^{7}

Også optimum afhænger meget af det specifikke enzym, og det kan være alt fra pH 2 til pH 12, men ofte ligger den ikke så langt fra pH 7. [8]

6

Bog: Biokemi og molekylærbiologi, s. 125-126

7

Bog: Biologiens Abc. Biokemi, s. 35

8

Bog: Enzymer – hvor bruges de, s. 5

Figur 3.

Figur 2.

Side 8

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 8 af 21

3. Forsøg med enzymet katalase

3.1 Formål og hypotese

Hensigten med forsøget bestod i at vise, hvordan enzymaktivitet afhænger af forskellige faktorer.

Ud fra teorien antog vi, at enzymaktiviteten som funktion af temperaturen ville være nogenlunde jævnt stigende indtil én bestemt temperatur (optimum) og derefter falde drastisk. Enzymaktiviteten som funktion af pH-værdien forventede vi ville stige gradvist mere og mere indtil optimum pH-værdien, den maksimale enzymaktivitet, og derefter falde – først meget og derefter mindre og mindre.

3.2 Fremgangsmåde

Ved at blande hydrogenperoxid og enzymet katalase, der katalyserer spaltningen af hydrogenperoxid til oxygen og vand, ville vi vha. mængden af det dannede oxygen afgøre katalases aktivitet ved henholdsvis forskellige temperaturer og pH-værdier. For at kunne måle, hvor meget oxygen der blev dannet, brugte vi en blanding af 1-2 mL katalase (produktnavnet er Catazyme) og 1 mL skumbad i 100 mL destilleret vand. Dermed kunne vi se det dannede skums volumen per tid som et udtryk for reaktionshastigheden.

For at kunne se på katalases aktivitet i forhold til forskellige faktorer (i vores tilfælde temperatur og pH-værdi), bestod forsøget egentlig af mange små forsøg, hvor vi hver gang ændrede på temperaturen eller pH-værdien.

1) For hver faktorændring (fx 40 °C) udtog vi omkring 30 mL af henholdsvis enzymopløsningen og substratopløsningen og kom det i hver deres 100 mL bægerglas.

2) Med to sprøjter sugede vi 5 mL af henholdsvis enzym- og substratopløsningen op og anbragte de fyldte sprøjter på to slangestykker fastsat på en 50 mL burette (se figur 4).

3) Vi sprøjtede samtidigt både begge opløsninger ind i buretten, og startede på samme tid stopuret – så at dette var tiden 0.

4) Mens der dannedes skum og ’skumsøjlen’ voksede, aflæste og

noterede vi søjlens højde for hvert 5. sekund efter tiden 0._{Figur 4.}

Herefter skyllede vi buretten, slangestykkerne og sprøjterne, og var således klar til endnu et forsøg

– nu med en faktorændring. Vi var dog opmærksomme på at bruge den samme sprøjte til samme type opløsning, da de jo ikke var renset nok til nødvendigvis at være fuldstændig rene.

Når pH-værdien af enzymopløsningen skulle ændres, tilsatte vi 10 mL af en bestemt pufferopløsning til 10 mL enzymopløsning. Puffere er opløsninger, som ikke ændrer sin pH-værdi synderligt, selvom der tilsættes en syre eller base, hvilket vil sige, at ved at tilsætte en puffer til en opløsning, vil opløsningen næsten uanset tidligere pH-værdi nu have nogenlunde den, som pufferen

Side 9

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 9 af 21 havde, før den blev tilsat. Således kunne vi være temmelig sikre på, at enzymopløsningen havde netop den pH-værdi, som vi ønskede at måle enzymets aktivitet ved.

For at ændre temperaturen, satte vi enzym- og substratopløsningerne i et vandbad, som enten var opvarmet (med halvvarmt vand fra en elkedel – dog ikke kogende!) eller afkølet (med isterninger).

3.3 Resultater

Buretten i forsøget vendte ’forkert’, dvs. at når skumsøjlen voksede, blev det aflæste volumen mindre og mindre (se figur 5). Det betød, at vi blev nødt til først at omregne de noterede tal til det rigtige rumfang, før vi kunne bearbejde resultaterne. Eftersom at opløsningen i buretten til tiden 0 var omtrent 4 cm under stregen for 50 mL, blev

udregningen af volumen følgende: talaflæstV −+= )450(

Resultaterne, hvor denne beregning allerede er udført, kan ses i bilag 7.1.1 og 7.1.2.

3.4 Behandling af resultaterne

3.4.1 Fratagne resultater

Ved temperaturforsøget med gennemsnitstemperaturen 24,6 °C kom vi desværre til ikke at tømme sprøjterne samtidigt, og resultatet var, at omdannelsen af oxygen skete med en så lav hastighed, at jeg besluttede mig for ikke at bruge dette resultat i beregningerne. Det er dog stadig medtaget i bilaget sammen med de andre resultater for en god ordens skyld.

3.4.2 Oxygenvolumen som funktion af tiden

For at kunne udlede noget af resultaterne, indsatte jeg tallene i et koordinatsystem (med

programmet Graph), altså oxygenvolumen som funktion af tiden (mL O /sek) for hver forskellig

2 temperatur og pH-værdi. Herefter forsøgte jeg vha. Graph at finde passende regressionslinjer til hver temperatur- og pH-værdimåling, som kunne tyde på en sammenhæng mellem den observerede

                                                                     2
volumen og tiden. Det viste sig (se bilag 7.2.1 og 7.2.2), at de regressionslinjer, hvis R -værdi var

meget tæt – og tættest – på 1 (altså sandsynlighed for at sammenhængen er netop en som denne regressionslinje), alle var polynomier og således grafer til 2.-gradsfunktioner.

3.4.3 Initialhastigheden som udtryk for enzymaktiviteten

Reelt var der nu to mulige måder at finde enzymaktiviteten på. Jeg valgte at finde tangenten til hver graf til tiden 0, og så bruge tangentens hældningskoefficient (matematisk set a) som initialhastighed. Havde jeg differentieret forskriften til den bedste regressionslinje, ville konstanten

(b) også have været initialhastigheden (da at alle led med x ville forsvinde, fordi x=0).

Man kunne fejlagtigt tro, at arealet under kurven, ville være et udtryk for enzymets aktivitet, men dette kan afvises med følgende forklaring: Selvom temperaturen ikke er så høj, vil der teoretisk set ske lige så mange reaktioner – det vil bare tage længere tid: Molekylerne bevæger sig langsommere i kolde omgivelser, og der går derfor længere, inden et enzym og substrat støder sammen. Er pH forholdsvis lav (eller for den sags skyld høj), vil der godt nok være færre enzymer, der virker optimalt, men hvis bare der går nok tid, vil alle substrater også her være indgået i en reaktion.

Figur 5.

Side 10

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 10 af 21

Derfor ser man i stedet starthastigheden (initialhastigheden) som et udtryk for enzymaktivitet, da differentialkvotienten jo netop fortæller, hvor meget der ville blive omdannet pr. sekund, hvis bare der ville blive tilsat nyt substrat hele tiden.

Efter at have fundet starthastighederne, indsatte jeg disse ind i to nye koordinatsystemer som funktion af henholdsvis temperatur og pH-værdi og forsøgte at finde passende regressionslinjer.

3.4.4 Initialhastighed som funktion af pH-værdien

I forbindelse med pH prøvede jeg ud fra hypotesen (baseret på teorien) at finde en regressionslinje, som var symmetrisk om maksimumsstedet, sådan som grafen for enzymaktiviteten burde se ud. Én

mulighed var her polynomisk vækst, og selvom R^{2} -værdien ved en sådan regression kun var på

omkring de 0,32, så var det dog den højest opnåelige.

Eftersom at jeg havde så få punkter (fire), var det ikke muligt at ’dele dem op’ og altså lave to forskellige regressionslinjer (fx potensvækst, som ville minde mere om de professionelle grafer end

                                                      2
polynomisk) – at lave regression på to punkter vil jo altid give et R

på 1, og det vil altså ikke kunne fortælle noget om sandsynligheden for, at punkterne virkelig hænger sammen sådan.

Regressionslinjen for initialhastigheden som funktion af pH-værdien blev altså polynomisk med

forskriften = 0,0,4492081x+19x-0,0355074f(x). Grafen findes i bilag 7.2.3.

2

3.4.5 Initialhastighed som funktion af temperaturen

Temperaturpunkterne var det noget sværere at lave regression på, idet grafen ifølge teorien og hypotesen burde bestå af to forskellige funktioner [9]

– den ene indtil toppunktet (optimum) er nået; den anden derefter. Først forsøgte jeg netop at gøre det på denne måde – at dele punkterne op:

Punkterne (5,95;1,4969), (9,95;153514) og (23,35;2,12531) kunne godt minde om den første del af grafen; om den gradvise stigning mod optimum. Punkterne med højere x-værdier adskilte sig dog meget fra de ’første’ tre, idet de havde meget lavere 2. koordinater.

Regressionslinjen på de 3 første punkter passede nogenlunde til hypotesen, både ved lineær og ved

                        2
eksponentiel regression, og R var på et meget acceptabelt niveau (0,9724 for lineær og 0,9819 for

eksponentiel). Den anden del af grafen viste sig dog at være meget sværere at lave en blot til dels forsvarlig regressionslinje til. Heller ikke ved at fjerne visse punkter (som evt. var opstået pga.

fejlkilder) var det muligt at lave regressionslinjer, der passede bare en lille smule på det forventede

udseende af grafen og samtidig også have en acceptabel R^{2} -værdi.

I stedet for en matematisk model så jeg mig nødsaget til at betragte grafen lidt mere selvstændigt

(uden regression). Det viste sig, at hvis jeg fjernede to punkter ((28,85;0,748581) og

(31,2;0,699711)), kunne jeg tegne min egen tendenslinje (se bilag 7.2.4), der godt nok ikke kunne baseres på matematiske formler, men som får vores resultater til faktisk at passe rigtig godt på hypotesen – hvis bare en eller flere fejlkilder har været årsagen til de to (evt. tre, da (34;0,745158) måske også kan have været et ’forkert’ punkt, se afsnittet Fejlkilder) misvisende punkter.

9

Hjemmeside: Aarhus akademi, Enzymer og katalysatorer

Side 11

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 11 af 21

3.5 Fejlkilder

Som det viste sig i sidste afsnit, hvor jeg forsøgte at behandle resultaterne matematisk, må der have været en del fejlkilder i vores forsøg – eller hypotesen må kunne forkastes. I det tilfælde at sidstnævnte ville være sandt, skulle der argumenteres for, hvordan det kan være, at denne teori, som er alment anerkendt, pludselig ikke passer mere. Da jeg vælger ikke at forkaste hypotesen i afsnittet

Vurdering af resultaterne, vil det nu være væsentlig at tage sig af førstnævnte; nemlig at finde de fejl, vi kan have lavet i vores forsøg, og som har givet os (delvist) forkerte resultater.

Den fundamentale fejl i temperaturforsøget ligger uden tvivl i vores måde at opvarme og efterfølgende nedkøle enzymopløsningen. Vi har uden tvivl mere end én gang ’genbrugt’ den opvarmede enzymopløsning ved blot at nedkøle den igen. Det måtte vi selvfølgelig ikke have gjort, idet vi jo fra teorien ved, at enzymer denaturerer, hvis temperaturen bliver blot en smule højere end optimum, og at de ikke er i stand til at fungere igen, selvom de nedkøles. Ved således at nedkøle den allerede opvarmede enzymopløsning, opnåede vi kun, at de få enzymer, som måske endnu ikke var denaturerede, ikke kunne ’leve op til’ vores forventninger om enzymaktiviteten ved den bestemte temperatur. Det kan meget vel være, at de initialhastigheder, vi observerede ved 28,85 °C,

31,2 °C og 34,0 °C af den grund passede så ringe til de forventede.

En anden fejlkilde må både være de lidt forskellige temperaturer, som enzymopløsningen og substratopløsningen havde, men især også det, at de målte temperaturer nok ikke svarede præcis til de temperaturer, opløsningerne havde, da vi endelig fik dem blandet – flere sekunder efter målingen.

Endnu en mulig fejl, som jeg dog allerede tidligere har nævnt og delvist har taget hensyn til, er den situation, hvor de to sprøjter ikke er blevet tømt samtidigt. I det ene allerede omtalte tilfælde var det helt tydeligt at se, hvor store konsekvenser det havde: Enzymopløsningen kom næsten ikke i kontakt med substratopløsningen, og reaktionerne foregik ekstremt langsomt. Man kan forestille sig, hvor let det kan være ikke at trykke på sprøjterne præcis samtidigt og med samme vægt, og variationer heraf kan som vist have stor indflydelse på den målte initialhastighed.

3.6 Vurdering af resultaterne

3.6.1 Initialhastighed som funktion af pH-værdi

I afsnittet Fejlkilder er der ikke blevet fundet virkelig betydningsfulde fejlkilder i forhold til

                                           2
forsøget med forskellige pH-værdier. Alligevel var R

ved den bedst passende regressionslinje

(polynomisk) ikke særlig høj (0,32). Man kunne selvfølgelig vove at påstå, at der ingen sammenhæng er mellem pH-værdi og initialhastighed, men noget tyder på, at den faktisk er der: Jeg kiggede nemlig lidt nærmere på regressionen, og det viste sig, at hvis jeg satte to ’kunstige’ punkter

ind, fx (1,0) og (14,0), som var nogenlunde i overensstemmelse med hypotesen, blev R^{2} meget

højere. På den måde er det sandsynligt, at vi med flere forskellige pH-værdi-forsøg end vores fire,

ville have opnået en meget større R^{2} -værdi. Det retfærdiggør ikke den dårlige sammenhæng, men

det betyder i al fald, at det ville være forkert at forkaste hypotesen i forhold til pH-værdien.

Side 12

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 12 af 21

Omvendt, hvis jeg havde haft flere punkter, kunne jeg måske også have delt dem op og på den måde

(som foreslået i afsnit Behandling af resultaterne) have lavet to regressionslinjer, fx eksponentiale.

Disse kunne jo så godt vise sig at have endnu større R^{2} -værdi, fordi de minder mere om teorikurven.

3.6.2 Initialhastighed som funktion af temperatur

Min selvtegnede graf hænger selvfølgelig meget godt sammen med det, man ville forvente, men den er naturligvis også mere forsøgt at passe ind på teorien end den viser forsøgets udfald. Dog må man være opmærksom på, at den overvældende fejlkilde, som helt sikkert er skyld i flere målingers ukorrekthed, gør det næsten uforsvarligt at kommentere på en graf, som ville have været fremkommet uden fjernelse af et par punkter.

Ud fra den så at sige eneste sandsynlige graf (min egen), skulle temperaturoptimum ligge omkring

30 °C, og det virker jo ikke så urealistisk igen. I den menneskelige krop må katalases optimum være på de 37 °C (kropstemperatur), men da Catazyme sagtens kan have et andet optimum, er 30 °C ikke usandsynligt. Ifølge teorien ligger det i hvert fald i intervallet for enzymers normale temperaturoptimum.

Side 13

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 13 af 21

4. Perspektivering til vaskemidler

4.1 Enzymer i vaskemiddelindustrien

I starten af det 20. århundrede fik Dr. Otto Röhm en genial idé: Hvis kroppens fordøjelsessystem brugte enzymer til at nedbryde mad bl.a. i form af proteiner, så måtte man da også kunne tilsætte sådanne enzymer til vaskemidler, hvis opgave det nu engang var at fjerne snavs – deriblandt proteinpletter såsom mælk, æg, sved og blod. Selvom Röhms forsøg på at føre dette ud i livet ikke var særlig succesrige, fordi de enzymer, han brugte, har pH optimum lavere end de basiske vaskemidler, forsatte man med at forske i emnet, og siden gennembruddet i 1960’erne har enzymer

                                  10
været en vigtig bestanddel af vaskemidler.

Med tiden har man fundet andre enzymer, så man ikke kun kan få nedbrudt proteiner men også fedt og stivelse, og så kan cellulase-enzymer endda gøre tøj blødere.

4.2 Vigtige vaskemiddelenzymer: Proteaser, amylaser, lipaser og cellulaser

4.2.1 Proteaser

Proteaser (også kaldet peptidaser) er enzymer, der forekommer naturligt især i mavesækken og bugspytkirtlen, og som alle de fire vaskemidler katalyserer de hydrolyse, der spalter proteiner. Ved

hydrolyse reagerer et protein med vand (H O), ved at vandet afgiver en H^{+} -ion til den ene

2

                                  -
fraspaltede del, mens hydroxid-ionen (OH

) forbliver på den anden del af proteinet. [11]

Sammen med tensiderne i vaskemidlerne giver de nærmest en dobbelteffekt, da de så at sige ’tager den første del’, og tensiderne fjerner resten. Det hænger sammen med, at en plet fra fx kakao ofte vil sidde oven på andet snavs, og derfor hindre tensiderne i at fjerne dette. Idet at proteaserne nedbryder kakaoresterne, kan tensiderne også gøre rent ’under pletten’.

I modsætning til de fleste enzymer er proteaser faktisk forholdsvis uspecifikke, og det er et problem i flydende vaskemidler, som selvfølgelig til dels indeholder vand: Her kan proteaserne nemlig komme til at nedbryde hinanden eller andre enzymer i vaskemidlet. En sådan autoproteolyse, som det kaldes, prøver man at forhindre ved at tilføje såkaldte reversible proteaseinhibitorer til flydende vaskemidler, altså molekyler der sætter enzymet ud af funktion i en periode, men som ved bestemte påvirkninger (fx højere temperaturer) fjernes og gør enzymet katalysedygtigt igen. [12]

4.2.2 Lipaser

Også lipaser er en vigtig del af vaskemidler, for ligesom de i tolvfingertarmen er i stand til at spalte fedt (lipider) til fedtsyrer og glycerol, så kan de i vaskemaskinen nedbryde pletter fra fedt og olie.

Selvom denne effekt ikke altid er så stor som ønsket, er lipaserne ikke unødvendige: De har nemlig også en evne til i nogen grad at forhindre en redeposition, dvs. at hydrofob (vandafvisende) snavs fra et stykke tøj ikke sætter sig på andre tøjstykker, hvis vasketøjet er meget beskidt og tensiderne

’har travlt’.

10

Artikel: Enzymer til vaskemidler – fra bugspytkirtler til gensplejsede mikroorganismer, s. 25

11

Hjemmeside: Wikipedia DE, Hydrolyse

12

Artikel: Enzymer til vaskemidler – fra bugspytkirtler til gensplejsede mikroorganismer, s. 26-27

Side 14

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 14 af 21

4.2.3 Amylaser

Amylaser findes naturligt bl.a. i munden (i form af spytamylase) og i bugspytkirtlen, og deres funktion er det at spalte stivelse. Selvom kartoffelpletter nok ikke er så hyppigt forekomne, så er amylaser med tiden alligevel blevet en del af de fleste vaskemidler, eftersom at fx ketchup, sovse og babymad oftere og oftere indeholder stivelse for få den efterspurgte konsistens. Også amylaser har

                                13
som lipaser en anti-redepositionseffekt.

4.2.4 Cellulaser

Mens proteaser, lipaser og amylaser er indeholdt i vaskemidler for at fjerne snavs, så er cellulaser der for nærmest at ’bearbejde’ bomuldet – for at gøre det blødere og forhindre farvemathed.

Cellulaser nedbryder nemlig cellulose, som bomuld til størstedelen består af, og når tøjet efter mange ganges vask har dannet såkaldte mikrofibriller, som giver det en ufin overflade, kan cellulaserne fjerne disse. På den måde gøres stoffet både blødere og farveklarere, fordi det uden

                                 14
mikrofibriller ikke reflekteres så kraftigt.

4.3 Enzymaktivitetens betydning for vaskemidler

Ligesom alle enzymer er også de fire her omtalte afhængige af både temperatur og pH, og det har selvfølgelig stor betydning for vaskemidlerne, da især pH-værdien af disse normalt ligger over enzymernes optimum.

4.3.1 Høj enzymaktiviteten ved lavere vasktemperaturer

Enzymers effekt til at virke godt under milde eller moderate betingelser er et plus til vaskemidlerne, fordi man kan undgå at vaske ved så høje temperaturer, som det er nødvendigt ved vaskemidler uden enzymer. Det giver både energibesparelser, og så skåner det tøjet.

Omvendt er det også vigtigt, at enzymerne i nogle tilfælde kan fungere ved højere temperaturer, fx hvis der er tale om hvidvask. På varedeklarationen vil det angivne temperaturinterval således ikke variere med mere end 30-40 °C – og det passer jo fint sammen med vores forsøg, der ved den

’improviserede’ tendenslinje også viste, at enzymerne var effektive i et lignende interval. I forsøget var optimum godt nok omkring 30 °C, og selvom nogle enzymer godt kan klare høje temperaturer, så er stadig ikke mange, som kan holde til de 90 °C, som nogle vaskemidler er egnede til.

4.3.2 Enzymers pH-optimum omkring 7 vs. de alkaliske opvaskemidler

Et meget større problem har været at holde enzymernes aktivitet høj på trods af de basiske pH-værdier i vaskemidlerne. Da de fleste enzymer har et pH-optimum omkring neutral, er det et naturligt problem at få at få både enzymer og vaskemidlets øvrige indholdsstoffer, hvis evne forringes ved for lave pH-værdier [15], til at være i én blanding.

13

Artikel: Enzymer til vaskemidler – fra bugspytkirtler til gensplejsede mikroorganismer, s. 27-28

14

Bog: Enzymer – hvor bruges de, s. 10

15

Science in the box – Buffering Agents

Side 15

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 15 af 21

4.3.3 Tiltag for at optimere enzymaktiviteten

For at opnå de bedste resultater, fremstiller man nu om dage enzymerne genteknologisk. I stedet for at benytte sig af naturligt forekomne enzymer, udvinder man dem i kulturer og genmodificerer dem ved helt konkret at indsætte eller udskifte bestemte aminosyrer – med henblik på at skabe enzymer med præcis de ønskede egenskaber.

Det mest effektive har været så at sige at forstørre pH- og temperaturoptimumsbredden, men da dette selvfølgelig kun kan gøres til en vis grad, har man også så vidt muligt hævet og sænket disse optimum med henblik på at skabe forskellige enzymer til forskellige formål: Alt afhængigt af ønsket vasktemperatur og andre egenskaber (fx blegemiddel), indeholder vaskemidlet netop de

enzymer, der dér er mest optimale.^{16}

16

Artikel: Enzymer til vaskemidler, s. 31

Side 16

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 16 af 21

5. Konklusion

I planter og dyr er hovedformålet med enzymer at katalysere processer; at ’skubbe på’, så diverse substrater bryder eller danner bindinger og bliver nye produkter, som på en eller anden vis skal bruges efterfølgende. Men i vaskemidler er det ikke den effekt, man er interesseret i. Det vigtigste i vaskemiddelsammenhæng er, at uønskede proteiner, stivelse og fedt (kort sagt snavs) nedbrydes til mindre dele, som tensider så kan tage sig af.

Selvom forsøget med katalase havde en del fejlkilder, som formodentlig er i hvert fald delvist skyld i resultater, der afviger fra teorien, kunne jeg påvise tendenser til stor afhængighed af temperatur og pH-værdi. De to faktorer har altså en aldeles stor påvirkning på enzymaktivitet men dermed også på vaskemidlernes effekt. Det, at enzymer har en ’maksimaltemperatur’, som ikke må overskrides, hvis man vil undgå enzymdenaturering, og pH-optima, der ikke kan forenes med de alkaliske vaskepulverstoffer, har krævet meget forskning.

Alligevel formår man nu at udnytte de små proteiner fuldt ud, for med genmodificering er man efterhånden begyndt at udvikle enzymer med lige netop den effekt, som skal bruges til fx koldtvandsvaskepulver med blegningsmiddel. Temperatur- og pH-optimumsbredden forstørres, og vaskemidler specificeres til bestemte temperaturer. Selv enzymer med en blødgørende effekt på vasketøj er fundet, og man kan vel efterhånden godt sige, at nytten af disse katalysatorer er meget større end den anstrengelse, som det trods alt stadig er at tilpasse dem de forskellige vaskeomgivelser.

Side 17

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 17 af 21

6. Litteraturliste

6.1 Bøger

▪ Bremer, Jens: Biokemi og molekylærbiologi, Nucleus Forlag ApS, 2005 (s.117-126)

▪ Novo Nordisk: Enzymer – hvor bruges de, Novo Nordisk, 1995 (s. 5, 9-11, 44-45)

▪ Skadhede, Thomas m.fl.: Biologiens Abc. Biokemi, Forlaget NICHE, 2007 (s. 33-38)

▪ Wolf, Troels m.fl.: Biologi C+B, Systime, 2008, (s. 42-45, 86-89)

6.2 Artikler

▪ Enzymer til vaskemidler, Dansk Kemi nr. 5, 2006 (Artikel nr. 8)

▪ Enzymer til vaskemidler – fra bugspytkirtler til gensplejsede mikroorganismer, Dansk

Kemi nr. 3, 2006 (Artikel nr. 7)

6.3 Hjemmesider

▪ Aarhus akademi – Enzymer og katalysatorer,

http://fag.aarhusakademi.dk/biologi/Tema/Biokemi/enzymer.html
▪ Bioweb – Enzymernes ABC, http://www.bioweb.dk/bioemner/enzymer/enzym_abc.html

▪ Biotechacademy – Enzymer,

http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/enzymer/teori/enzymer.aspx
▪ Den Store Danske – Katalase, http://de.wikipedia.org/wiki/Katalase
▪ Marselisborg Gymnasium – Enzymer, http://www.marselisborg-gym.dk/typo3_src-
4.0.1/index.php?id=480

▪ Science in the box – Buffering Agents,

http://www.scienceinthebox.com/en_UK/glossary/bufferingagents_en.html
▪ Wikipedia DE – Enzym, http://de.wikipedia.org/wiki/Enzym
▪ Wikipedia EN – Enzymes, http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme
▪ Wikipedia DE – Hydrolyse, http://de.wikipedia.org/wiki/Hydrolyse
▪ Wikipedia DE – Peptidase, http://de.wikipedia.org/wiki/Peptidase

6.4 Lånte figurer

▪ Figur 1:

http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/enzymer/teori/enzymer.aspx
▪ Figur 2, figur 3: http://www.marselisborg-gym.dk/typo3_src-4.0.1/index.php?id=480

Side 18

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 18 af 21

7. Bilag

7.1 Tabeller – de rå data

7.1.1 Oxygenvolumen per tid ved forskellige pH-værdier

4,8 6 7,2 7,8

5 3 3 4 4

10 6,5 6,5 8 7,5

15 9 10 12 10

20 13 13 16 13,5

25 16 16 19 16

30 19 19 22,5 18

35 22 22,5 25 21,5

40 25 25 28,5 24

45 27,5 28 31,5 26,5

50 30 30,5 34,5 29,5

55 32 32,5 37 32

60 34,5 34,5 38,5 34

65 37 37 41 36

70 38,5 38,5 43 38

75 40 40,5 45 40

80 42 42 46 41

85 43,5 43 47,5 42,5

90 45 44,5 49 44

95 46 46 50 45

100 47,5 47 50,5 46

NB: Da det var svært at få enzymopløsningen og substratopløsningen til at have præcis samme temperatur, valgte vi at bruge gennemsnittet af de to opløsningers målte temperaturer.

7.1.2 Oxygenvolumen per tid ved forskellige temperaturer

5,95 9,95 23,35 24,55 24,65 28,85 31,2 34 35,15 40,15 52,5

5 5,5 4,5 10 0,5 3 4 4 4 7 1 0

10 11 11 19 0,5 6 7,5 7 7,5 13 1,5 0

15 17 17,5 28 1 8 10,5 10,5 11 18,5 2 0

20 22,5 23 35 1 11 13 14 14,5 23,5 2,5 0

25 28 28,5 41 1,5 14 15,5 16 18 28 3 0

30 33,5 33,5 45 2 16 18,5 18 21 32 3,5 0

35 38 38,5 48 2 19 21,5 21 23 36 3,5 0

40 42 42 49,5 2 21 24,5 23,5 26 38,5 4 0

45 46 45,5 51 2,5 24 27,5 27 28 41 4 0

50 48 48 52 2,5 25,5 30,5 29 30,5 43,5 4,2 0

Side 19

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 19 af 21

55 50 50,5 53 2,5 28 33 31,5 33 45,5 4,5 0

60 51,5 52 2,5 30 35 34 34,5 47,5 4,6 0

65 | 2,5 | 32 | 37 | 36 | 36,5 | 49 | 5 | 0
70 | 2,75 | 34 | 39 | 38 | 38 | 50,5 | 5 | 0
75 | 3 | 35 | 41 | 39,5 | 39,5 | 51,5 | 5 | 0
80 | 3 | 36,5 | 42,5 | 41 | 41 | 52,5 | 5 | 0
85 | 3 | 38 | 43,5 | 42,5 | 42 | 53 | 5 | 0

90 | 3,5 | 39 | 45 | 44 | 43,5 | 5 | 0
95 | 3,6 | 41 | 46 | 45 | 44,5 | 5 | 0
100 | 3,8 | 42 | 47 | 46 | 45,5 | 5 | 0
105 | 3,8 | 43 | 48 | 47 | 46 | 5 | 0
110 | 3,9 | 44 | 48,5 | 48 | 47 | 5 | 0

NB: I de kolonner, hvor de resterende tal tilsyneladende mangler, er det sidste tal blot den sidst noterede volumen inden skumsøjlen blev højere end buretten og flød over.

7.2 Grafer

7.2.1 Oxygenvolumen per tid ved forskellige pH-værdier

Side 20

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 20 af 21

7.2.2 Oxygenvolumen per tid ved forskellige temperaturer

7.2.3 Initialhastighed som funktion af pH-værdi

Side 21

Enzymer i vaskemidler | SRO i biologi og matematik side 21 af 21

7.2.4 Initialhastighed som funktion af temperatur