Ekstraktion af koffein fra kaffe

Side 1

Metodevalidering af

International standard ISO 10095 :

Ekstraktion af koffein fra kaffe

Side 2

2

Indholdsfortegnelse

Side 3 Indledning

Side 4 Teori om metodevaliderings forsøget

Side 5 Teori om metodevaliderings forsøget

Side 6 Teori om prøve-, genfinding-, blindprøvefremstilling og oprensning

Side 7 Teori om detektionsgrænse og systemtest

Side 8 Fremgangsmåde ved koffein i kaffe – Serie 1 – 6

Side 9 Fremgangsmåde ved koffein i kaffe – Serie 1 – 6

Side 10 Fremgangsmåde ved koffein i kaffe – Serie 1 – 6, parameter og rækkefølge i HPLC Side 11 Fremgangsmåde ved koffein i kaffe – Serie 7

Side 12 Fremgangsmåde ved koffein i kaffe – Serie 7, parameter og rækkefølge i HPLC Side 13 Udregning

Side 14 Resultater for Prøver, Gennemsnit, Spredning, Interval og CV %:

Side 15 Resultater for Genfindinger og Systemtest

Side 16 Resultater for systemtest

Side 17 Diskussion og delkonklusion

Side 18 Konklusion af systemtest

Side 19 Samlet Konklusion af metodevalideringen

Side 3

3

Indledning

Formål

Formålet er at finde ud af om forskriften INTERNATIONAL STANDARD ISO 10095 er optimal til formålet at finde koffein i kaffe.

Af metodevalidering fortages følgende parametre :

- Robusthed

- Repeterbarhed

- Reproducerbarhed

- Nøjagtighed

- Præcision

- Stabilitet

Side 4

4

Teori om metodevaliderings forsøget

Metodevalidering

Valideringen fortages for at sikre sig at en metode virker som den skal. Om metoden er pålidelig og giver den et resultat der er i overensstemmelse med det forventet resultat.

Validerer man et system kan det være relevant at validere, når systemet tages i brug for første gang, efter en flytning af systemet, eller hvis der ikke har været benyttet længe.

Her validerer vi kun på metoden.

Når man validere en metode benytter man sig af forskellige parametre. Disse siger på hver sin måde om metoden er optimal.

Vi har valideret på følgende parameteret:

- Robusthed: Her måles om metoden resultat påvirkes når der fortages ændringer og tåler belastninger. Det kan være ændringer i flowet, kolonnetemperatur eller en ændring i den mobile fases sammensætning

- Nøjagtighed: Målet med alle analyser er som tidligere nævnt at komme så tæt som nødvendigt på de ”rigtige” analyseresultater. For at kunne vurdere dette opererer man med begrebet nøjagtighed, som fremkommer ved sammenligning af de målte analyseresultater med et anerkendt ”rigtigt” analyseresultat: den nominelle værdi.

Nøjagtighed kan kun beregnes, når de analyserede prøver har en kendt koncentration (nominel værdi) af det stof, der bestemmes. En nominel værdi kendes ikke for virkelige prøver, men begrebet er vigtigt i bedømmelsen af en analysemetodes eller et laboratoriums evne til at producere ”rigtige” værdier. I forbindelse med metodevalidering fremstiller man derfor prøver, hvor den nominelle værdi er kendt. Så vi kan kontrollere, hvor tæt analyserne kan komme på den ”rigtige” værdi. Dette kaldes kontrol af genfinding. Begrebet nøjagtighed angiver, hvor tæt det enkelte analyseresultat og den nominelle værdi ligger på hinanden. Da nøjagtighed bestemmes ud fra det enkelte analyseresultat, repræsenterer den en kombination af systematisk fejl og tilfældig fejl.

Man måler om resultatet er i overensstemmelse med den sande værdi. Har man ikke en sand værdi fra f.eks. opslagsværk eller selve metoden, kan den findes ved at lave genfindingsforsøg. Selv om vi har en opgiver værdi om hvor meget vi forventer at finde laver vi genfinding alligevel.

- Repeterbarhed: Kan man lave prøven flere gange under nøjagtig samme betingelser og stadig få samme resultat? Med samme betingelse menes samme laborant, materialer, dag, reagenser, systemer etc. Ved udregningerne laves CV%.

Derfor laver vi begge 2 serier hver som den anden intet har at gøre med. Vi laver altså det hele selv: standardrække, prøvefremstilling, oprensning og kørsel

Den bedst mulige præcision får man ved analyser foretaget inden for samme arbejdsgang. Dette medfører en analyse foretaget ved anvendelse af den samme metode, samme reagenser, samme analyseperson, samme laboratorium og samme udstyr. Som udtryk for denne præcision anvendes repeterbarhed eller standardafvigelsen inden for serien.

Side 5

5

Normalt opgives den gennemsnitlige repeterbarhed målt over en længere tidsperiode. Det er denne præcision, der skal bruges, hvis man vil sammenligne to målinger foretaget i samme serie, altså typisk når man har afleveret en serie prøver fra én undersøgelse og én prøvetagning. En noget dårligere præcision får man under maksimalt varierende forhold på ét laboratorium. Det vil sige, analyserne er foretaget på den samme prøve men i forskellige analyseserier.

Desuden er analyserne foretaget med samme metode, på samme laboratorium, men eventuelt med forskellige analysepersoner, flere dage imellem analyserne og eventuelt anvendelse af forskellige analyseinstrumenter af samme type.

Reproducerbarhed: Et andet anvendt udtryk for præcisionen er reproducerbarheden, som er et mål for præcisionen, når forskellige laboratorier analyserer den samme prøve med forskelligt udstyr og eventuelt forskellige metoder. Reproducerbarheden fortæller dermed, hvilken variation man kan forvente i resultater, hvis man sender en homogen og stabil prøve til to eller flere laboratorier

Kan man lave prøven flere gange under forskellige betingelser og stadig få samme resultat? Med forskellige betingelse menes forskellige laboranter, materialer, dage, reagenser, systemer etc. Ved udregningerne laves CV%.

Derfor laves 2 serier som er lavet fælles og som laves over 2 dage. Fælles betyder at den ene f.eks. har lavet standardrækken, mens den anden har afvejet prøverne, som den anden har tilsat vand til.

- Stabilitet: Her skal findes hvor stabil prøven er. Kan den tåle at stå natten over, i direkte sollys, i fryser, ved stuetemp. etc.

- Middelværdi og præcision: Hvis en prøve bliver delt op i mange homogene delprøver, og alle delprøver bliver analyseret, vil det ikke være muligt at opnå præcis samme resultat hver gang, fordi alle analyser er forbundet med tilfældige fejl. Den tilfældige fejl medfører altså en spredning af de opnåede analyseresultater, selvom analyserne er udført på den samme prøve. Spredningen af analyseresultater kaldes normalt præcisionen og beregnes oftest som en standardafvigelse. Jo mindre spredning der er på flere analyseresultater af den samme prøve, jo mindre talværdi vil standardafvigelsen have. Tager man et gennemsnit af alle analyseresultater, opnår man et resultat, som ligger i midten af de opnåede analyseresultater, og denne værdi kaldes middelværdien. Middelværdien er altså en sammenfatning af flere resultater til ét og dermed et mere sikkert resultat. Præcisionen er normalt afhængig af koncentrationen af det stof, der skal måles.

Side 6

6

Prøvefremstilling

Kaffen ekstraheres med vand og Magnesiumoxid (MgO). Det er altid milli-q-vand der benyttes, da dette er renset for organiske forbindelser, der ellers kunne forstyrre målingerne på HPLC’en.

Magnesiumoxiden tilsættes, da dette er svagt opløseligt i vand og et ”tungt stof”.

MgO +H O → Mg^{2+} +2OH^{-}, dvs. pH bliver basisk og kaffen bundfalder. Opløsningen opvarmes til

2

90°C, da koffeinens opløselighed i vand stiger ved høje temperaturer og herved trækkes koffeinen ud af kaffen. Før og efter opvarmningen vejes opløsningen, for at se om der fordamper noget, dette kan godt påvirke resultaterne. Herefter udtages der en prøve fra overfladevæsken, som filtreres for urenheder, og sættes på SPE-kolonner).

I prøven forventer vi at finde 2 g koffein / 100 g kaffe Se forskriften s. 5

Genfinding

I genfindingen handler det om at finde en kendt tilsat mængde. Selve ideen i forsøget er at tjekke sig selv. Vi undersøger om vi er sløset, eller ”taber” noget af prøven undervejs fx ved fordampning, spild, ellers anden ukorrekt behandling af prøven. Arbejder vi optimalt må vi forvente at finde meget tæt på 100 %. I metodevalidering benyttes genfinding også til at fastslå den sande værdi.

Prøven tilsættes 50% mere end vi forventer at finde. Det er den eneste undvigelse man gør ellers behandles genfindingsprøverne som de ordinære prøver.

Vi forventer at finde 2g koffein/ 100g kaffe. Ved genfinding tilsættes der altså 10 mg/g koffein.

Blindprøver

Ved blindprøve tilsættes kun 4,0g MgO

2 og 100 ml milli-q-vand. Ellers bliver de behandlet som de ordinære prøver.

Oprensning

Da prøverne er fyldt med urenheder skal de først oprenses. Urenhederne vil forstyrrer forsøget og give toppe som vi ikke skal bruge. Vi er kun interesseret i koffein toppen.

Oprensningen forgår vha. SPE-kolonner. SPE-kolonner er opbygget af modificeret silica som indeholder en fenylgruppe, der er upolær. Desuden er silica modstandsdygtig overfor kemiske påvirkninger. Der er 4 stadier af oprensningen:

Klargøring: Kolonnen gøres klar til at modtage prøven vha. metanol og milli-q-vand.

Prøvepåsættelse: Prøven sættes til kolonnen og suges gennem vha. vaccum. Koffeins polaritet tilbage holder den på kolonnen. Da koffein er upolær bindes den til kolonnen.

Vask: Ved vask med ammoniak/ metanol opløsning forbliver pH basisk, og koffeinen bliver i

kolonnen, mens andre stoffer vaskes ud af kolonnen.

Eluering: Ved eluering tilsættes eddikesyre og da koffein indeholder en aminogruppe (N-CH), som

3

kan optage H^{+}, optager koffein H^{+} som derved bliver til en ion og polær. Derfor bindes koffeinen

ikke længere til kolonnen og kommer ud ved elueringen.

Metanolen der benyttes er HLPC-grade dvs. at der er fjernet uv-absoberende stoffer, der ellers ville kunne forstyrre målingerne. Derefter sættes fraktionerne fra elueringen til en 10 mL målekolbe, som fyldes med milli-q-vand op til mærket. Dette overføres igen til et lille prøveglas (vails)

Side 7

7

Detektionsgrænse

Der fremstilles 4 standarder med koncentration på 0,5 mg/L. Vi skal lave en fire

dobbeltbestemmelse, så vi er meget sikre på det resultat vi får ud, da det er meget små mængder vi leder efter.

Vi skal finde den nedre grænse for hvor lidt koffein i mg/L vi kan måle på HPLC- systemet. Det

skal bruget til at kun sige at, selvom vi ikke har målt nogen top ved koffeins retentionstid, kan vi ikke påstå at der ikke er koffein i prøven, men vi kan sige at der ikke er PÅVIST noget koffein i kaffen.

Når laboratorierne skal analysere prøver med meget lave koncentrationer eller intet indhold af det målte stof, skal laboratorierne vide præcist, hvornår de kan konstatere, om stoffet er tilstede eller ej.

Derfor er der behov for at kende både sandsynligheden for at opgive et analyseresultat for påvist indhold for prøver uden indhold (falsk positive resultater), og sandsynligheden for at prøver med et lille, reelt indhold bliver angivet som uden indhold (falsk negative resultater). Dette gøres ved at beregne en koncentration kaldet detektionsgrænsen, hvorover risikoen for både falsk negative og falsk positive resultater er lav.

Systemtest

Der køres systemtest ved hver serie. Det udrenges Asymmetrifaktor, Kapacitetsfaktor, Teoretiske bunde, Selektivitet og Resolution ved hver prøve.

Vi regner med et gennemsnit af alle prøver inden for samme serie.

Dødtid:

Dødtiden er målt på KNO

3 d retentionstiden, kaliumnitrat holdes ikke tilbage på kolonnen, dvs. t

- er den tid det tager et stof der ikke tilbage holdes på kolonnen gennem HLPC-systemet.

Asymmetrifaktor:

Er et mål for en tops afvigelse fra den perfekte form. Det optimale tal er 1, er toppen stejlest foran

(tailing) T>1, er toppen stejlest bagved (leading) T<1 mål for systemets almene tilstande.

Kapacitetsfaktor - k’:

For et stof som ikke holdes tilbage på kolonnen, sættes dødtiden k’=0. k’er afstanden fra

dødtidstoppen til den aktuelle top målt i dødtider.

Teoretiske bunde:

På et HPLC- system skal tallene ligge mellem 0. Antallet af teoretiske bunde bruges primært til at måle kolonnens tilstand. Sammenligning af teoretiske bunde giver kun mening under helt ENSARTEDE betingelser.

Selektivitet:

Beskriver forholdet til to toppes retentionstider. Det afhænger udelukkende af kemien i systemet.

Dvs. arbejdet mellem faserne og stofferne.

Resolution:

Angiver graden af adskillelsen af to toppe, udtrykker toppens adskillelse på basislinien, optimal 1,5-

2. Er der stor forskel imellem størrelsen af de toppe vi måler efter, kan det være nødvendigt med en noget større resolution.

Side 8

8

Fremgangsmåde ved koffein i kaffe - Serie 1- 6

Der benyttes følgende forskrift: INTERNATIONAL STANDARD ISO 10095

Der er følgende modifikationer: 6 standarder

Der benyttes magnetomrører ved stamopl. fremstilling

Prøve rystes på vandbadet

Flow på 0,6 ml/min

Injektionsvolumen på 5 µL

Detektor på 254 nm

Genbruger stamopløsning

Genbruger SPE-kolonner

Eluerer ned i reagensglas

Understregning betyder at det er modifikationer i forhold til forskriften, se fodnoter for begrundelse herfor.

Alle serier behandles på samme måde

Serie 1-2: Laves fælles Se Lines journalborg nr. 11, s. 4-18 & Leas journalbog, s. 5-19 Serie 3-4: Laves af Line Se Lines journalbog nr. 11, s. 19-30

Serie 5-6: Laves af Lea, Se Leas journalbog, s. 19-30

Fremstilling af stamopløsning:

Vi laver en stamopløsning på 500 Mg koffein/L

Vi fremstiller 250 mL, vi bruger den samme stamopløsning under hele modulet [1]

Der afvejes 0,1250 g koffein som overføres til en 250 mL målekolbe, som fyldes ½ op med

                                              2
ethanol/vand ¼. Vi sætter opløsningen på magnetomrører .

Derefter tilsættes ethanol/vand op til mærket.

Fremstilling af standardrække:

Vi laver en standardrække ud fra stamopløsningen med følgende koncentrationer:

5 Mg/L, 10 Mg/L, 20Mg/L, 50 Mg/L, 100 Mg/L og 150 Mg/L

se Leas journalbog s. 5, for udregninger se Lines journalbog nr.11 s. 5 for udregninger

Prøvefremstilling:

Der afvejes på tekniskvægt 4,00 g MgO

2 direkte ned i substrat flaske.

Der afvejes på analysevægt 1,0000g kaffe i vejebåd som kommes i substrat flasken.

Der tilsættes til substrat flasken 100 ml vand, forskriften siger 100 g vand, men vi afmålt det i stedet for at afveje.

1

Da vi ved at vi får meget travlt, ser vi at på denne måde kan nå noget mere.

2

Opløsningen er meget svær at få opløst

Side 9

9

Prøverne sættes i vandbad ved 90^{o} C i 20 min. Der rystes kraftigt hvert 5 min [3].

Prøverne afvejes før og efter vandbad.

Prøverne filtreres derefter gennem et 0,45 µm filter ned i et prøveglas.

Genfinding

Der afvejes på tekniskvægt 4,00 g MgO

2 direkte ned i substrat flaske.

Der afvejes på analysevægt 1,0000g kaffe i vejebåd som overføres til substratflasken.

Der afvejes på analysevægt 0,0100 g koffein i vejebåd som overføres til substratflasken Der tilsættes til substrat flasken 100 ml vand, forskriften siger 100 g vand, men vi afmålt det i stedet for at afveje.

Prøverne sættes i vandbad ved 90^{o} C i 20 min. Der rystes kraftigt hvert 5 min [4].

Prøverne afvejes før og efter vandbad.

Prøverne filtreres derefter gennem et 0,45 µm filter ned i et prøveglas.

Blindprøve

Der afvejes på tekniskvægt 4,00 g MgO

2 direkte ned i substrat flaske.

Der tilsættes til substrat flasken 100 ml vand, forskriften siger 100 g vand, men vi afmålt det i stedet for at afveje.

Prøverne sættes i vandbad ved 90^{o} C i 20 min. Der rystes kraftigt hvert 5 min [5].

Prøverne afvejes før og efter vandbad.

Prøverne filtreres derefter gennem et 0,45 µm filter ned i et prøveglas.

Oprensning

Prøve, genfinding og blindprøve oprenses. Kolonnerne genbruges [6].

Klargøring: Kolonnen tilsættes 5ml metanol og stoppes når det er 2 mm over silica overfladen.

Bagefter tilsættes 5 ml milli-q-vand og det får også lov til at stå 2 mm over overfladen.

Prøve: 2 ml prøve påsættes og stoppes når prøven er nået lige under silicaets overflade.

Vask: 2,5 ml ammoniumsulfat/metanol tilsættes kolonnen, og stoppes når det er lige under silica

overfladen. Gentages en gang til.

Eluering: Der sættes en reagensglas under kolonnen. Forskriften siger en 10 ml målekolbe, men det virker ikke så godt da meget af eluenten løber ved siden af. 7,5 ml eluent tilsættes kolonnen. Denne gang får kolonnen lov til at løbe tør.

Indholdet i reagensglasset overføres til 10 ml målekolbe og efter skylles med LIDT milli-q-vand, som overføres til kolben. Kolben fyldes til mærket med milli-q-vand. En smule af kolbens indhold tilsættes vailsglas.

3

Forskriften siger vi ikke har mulighed for at have en magnetomrøre under prøven, mens den er på vandbad.

4

Forskriften siger vi ikke har mulighed for at have en magnetomrøre under prøven, mens den er på vandbad.

5

Forskriften siger vi ikke har mulighed for at have en magnetomrøre under prøven, mens den er på vandbad.

6

For at spare penge genbruges kolonnerne.

Side 10

10

Parameter, ifølge forskrift og Peter Larsens rettelser:

Flow: 0,5 mL/min. - 1,5mL/min.

Kolonne temp: 40 °C

Injektion: 10 µL

Standarder: 1

Kolonne: Her er mange muligheder se s. 4 i forskriften

Detektor: UV, 254-280 nm, optimal 272-280 nm.

Vi kører:

Flow: 0,6 mL/min, da det passer bedst til vore kolonne.

Kolonne temp: 40 °C

Injektion: 5 µL, så vi ikke ødelægger kolonnen.

Standarder: 6, det er optimalt, når vi laver metodevalidering

Kolonne: C18 kolonne

Detektor: 254 nm, mindre forståelses fejl fra vores side. Vi skulle have kørt 272 nm.

Kørsel på HPLC

Prøverne sættes i følgende rækkefølge:

KNO

3

Standard 5 mg/l
Standard 10 mg/l
Standard 20 mg/l
Standard 50 mg/l
Standard 100 mg/l
Standard 150 mg/l

Prøve 1

Prøve 2

Prøve 3

Prøve 4

Prøve 5

Prøve 6

Genfinding 1

Genfinding 2

Blindprøve 1

Blindprøve 2

Serie 6B: Serie 6 køres igen dagen efter for at tjekke stabilitet ( nøjagtig samme parametre på HLPC)

Side 11

11

Fremgangsmåde ved koffein i kaffe – Serie 7

Der benyttes følgende forskrift: INTERNATIONAL STANDARD ISO 10095

Der er følgende modifikationer: 6 standarder

Der benyttes magnetomrører ved stamopl. fremstilling

Prøve rystes på vandbadet

Flow på 0,6 ml/min

Injektionsvolumen på 5 µL

Detektor på 254 nm

Genbruger stamopløsning

Genbruger SPE-kolonner

Eluerer ned i reagensglas

Understregning betyder at det er modifikationer i forhold til forskriften, se fodnoter for begrundelse herfor.

Serie 7: Prøvefremstilling laves af Line, Se Lines journalbog, nr11/2, s.4 - 9

Stamopløsning & standardrække laves af Lea, Se Leas journalbog, s . 30 -31

Fremstilling af stamopløsning

Vi laver en ny stamopløsning på 500 Mg koffein/L

Vi fremstiller 250 mL,

Der afvejes 0,1250 g koffein som overføres til en 250 mL målekolbe, som fyldes ½ op med

                                              7
ethanol/vand ¼. Vi sætter opløsningen på magnetomrører .

Derefter tilsættes ethanol/vand op til mærket.

Fremstilling af standardrække

Vi laver en standardrække ud fra stamopløsningen med følgende koncentrationer:

5 Mg/L, 10 Mg/L, 20Mg/L, 50 Mg/L, 100 Mg/L og 150 Mg/L

Se Leas journalbog s. 5 for udregninger

Fremstilling af standarder til detektionsgrænse

Der fremstilles 4 standarder med koncentration på 0,5 mg/L.

Se Leas journalbog s. 31 for udregninger

Stamopløsning fra serie 1 – 6 benyttes til standardrække til Serie 7 A

Den nye stamopløsning benyttes til standardrække til Serie 7 D

Prøve-, genfinding- og blindprøvefremstilling + oprensningen er identisk med Serie 1-6

7

Opløsningen er meget svær at få opløst

Side 12

12

Parameter, ifølge forskrift og Peter Larsens rettelser:

Flow: 0,5 mL/min. - 1,5mL/min.

Kolonne temp: 40 °C

Injektion: 10 µL

Standarder: 1

Kolonne: Her er mange muligheder se s. 4 i forskriften

Detektor: UV, 254-280 nm, optimal 272-280 nm.

Vi kører:

Flow: 0,6 mL/min, da det passer bedst til vore kolonne.

Kolonne temp: 40 °C

Injektion: 5 µL, så vi ikke ødelægger kolonnen.

Standarder: 6, det er optimalt, når vi laver metodevalidering

Kolonne: C18 kolonne

Detektor: 254 nm, mindre forståelses fejl fra vores side. Vi skulle have kørt 272 nm.

Serie 7 A: Køres som serie 1 – 6 udregnet på gamle standardrække

Serie 7 B: Køres med ændring i detektoren på 272 nm

Serie 7 C: Køres med ændring i flowet på 1,0 ml/min

Serie 7 D: Køres som serie 1 – 6 men udregnet på ny standardrække

Kørsel på HPLC

Prøverne sættes i følgende rækkefølge:

1 KNO 16 Blindprøve 1

3

2 Standard 5 mg/l 17 Blindprøve 2
3 Standard 10 mg/l 18 Standard 5 mg/l*
4 Standard 20 mg/l 19 Standard 10 mg/l*
5 Standard 50 mg/l 20 Standard 20 mg/l*
6 Standard 100 mg/l 21 Standard 50 mg/l*
7 Standard 150 mg/l 22 Standard 100 mg/l*
8 Prøve 1 23 Standard 150 mg/l*
9 Prøve 2 24 Standard 0,5 mg/l
10 Prøve 3 25 Standard 0,5 mg/l
11 Prøve 4 26 Standard 0,5 mg/l
12 Prøve 5 27 Standard 0,5 mg/l

13 Prøve 6

14 Genfinding 1 *Ny standardrække

15 Genfinding 2

Side 13

13

Udregning

Der regnes efter formlen:

Mg/L x (10 ml x 0,1 L x g/100g) / (2 ml x afvejet prøvemængde x 1000 mg/g)

Mg/L findes på bilagene

10 ml er kolbens størrelse

0,1 L er den mængde prøven er fortyndet i

2 ml er oprenset prøvemængde

Afvejet prøvemængde findes i journalbøgerne eks. Prøve

Serie 5 Prøve 1 Bilag P1 – S5

15,5356 mg/l x (10 ml x 0,1 L x g/100g) / (2 ml x 1,0000 g x 1000 mg/g) =

0,77686 g koffein/100 g kaffe

Gennemsnit af prøverne: 0,752 g koffein / 100g kaffe

eks. Genfinding

Serie 5 Genfinding 1 Bilag GF1 – S5

24,7404 mg/l x (10 ml x 0,1 L x g/100g) / (2 ml x 1,0000 g x 1000 mg/g) =

1,2236 g koffein / 100 g kaffe

(0,752 g/100 g ) x 0,9999 g = 7,52 mg

(1,2236 g/100 g) x 0,9999 g = 12, 237mg

GF%: ((12, 237mg - 7,52 mg ) / 10,6 mg) x 100% = 44,50%

Se alle udregninger i bilagsmappen under seriens nr.

CV% = S / gennemsnit af prøverne

Serie 5: (0,04/ 0,75)x 100% = 4,8 %

Side 14

14

Resultater

Her henvises til bilagene: prøvens nr. – seriens nr.

Eks: P1-S1

Prøver: prøve 1 prøve 2 Prøve 3 Prøve 4 prøve 5 prøve 6 serie 1 0,82 0,50 0,74 0,81 0,56 0,15*

serie 2 0,89 0,84 1,02* 0,78 0,82 0,84

serie 3 | 0,94 | 0,90 | 0,87 | 0,88 | 0,84 | 0,90
serie 4 | 1,09 | 0,92 | 0,92 | 0,87 | 1,01 | 0,87
serie 5 | 0,78 | 0,78 | 0,78 | 0,70 | 0,76 | 0,71

serie 6 A | 0,79 | 0,92 | 0,89 | 0,83 | 0,75 | 0,85
serie 6 B | 0,79 | 0,92 | 0,89 | 0,83 | 0,75 | 0,85

serie 7 A 0,82 0,81 0,78 1,72* 0,81 0,78

serie 7 B | 0,81 | 0,82 | 0,75 | 0,87 | 0,80 | 0,72
serie 7 C | 0,81 | 0,82 | 0,76 | 0,87 | 0,79 | 0,72

serie 7 D 1,57 1,57 1,51 3,19* 1,55 1,50

Resultaterne har enhederne g Koffein/ 100 g Kaffe
*Er ikke regnet med i gennemsnittet, da de afviger for meget i forhold til de andre.

Gennemsnit, Spredning, Interval og CV %: gennemsnit

g Koffein/ 100 g

Kaffe Spredning interval CV%

Serie 1 0,70 0,16 [ 0,45-0,68] 23%

Serie 2 | 0,83 | 0,04 | [0,79–0,87] | 4,8%
Serie 3 | 0,88 | 0,03 | [0,85–0,91] | 3,9%
Serie 4 | 0,95 | 0,09 | [0,86–1,04] | 9,5%

Serie 5 0,75 0,04 [ 0,72-0,79] 4,8%

Serie 6 A 0,84 0,06 [0,78-0,90] 7,3%

Serie 6 B 0,84 0,06 [0,78-0,90] 7,3%

Serie 7 A 0,80 0,02 [0,82−0,87] 2,4%

Serie 7 B | 0,80 | 0,05 | [0,75–0,85] | 6,7%
Serie 7 C | 0,79 | 0,05 | [0,74–0,84] | 6,3%
Serie 7 D | 1,54 | 0,03 | [1,51–1,60] | 2,2%

Side 15

15

Genfindinger:

Genfinding 1 i % Genfinding 2 i %

serie 1 | 31 | 33
serie 2 | 39 | 46
serie 3 | 43 | 42
serie 4 | 49 | 39
serie 5 | 45 | 29

serie 6 A Kan ikke udregnes 71 serie 6 B Kan ikke udregnes 71

serie 7 A | 34 | 42
serie 7 B | 25 | 36
serie 7 C | 24 | 32
serie 7 D | 60 | 76

Se alle udregninger i bilagsmappen under seriens nr. og prøvernes nr.

Resultater for systemtest

Serie 1 Interval Serie 4 Interval

Asymmetri 0,713- 0,765 Asymmetri 0,704-0,724 k’ 0,880- 0,882 k’ 1,571-1,572

Teoretiske bunde Regnes ikke her Teoretiske bunde

Selektivitet | 5,179-5,202 | Selektivitet | 2,605-2,616

Resolution | 8,101-8,479 | Resolution | 8,015-8,493

Serie 2 Interval Serie 5 Interval

Asymmetri | 0,713-0,742 | Asymmetri | 0,704-0,740

k’ 1,568-1,571 k’ 1,578-1,581

Teoretiske bunde Regnes ikke her Teoretiske bunde

Selektivitet | 2,384-2,611 | Selektivitet | 2,613-2,625

Resolution | 8,262-8,758 | Resolution | 8,379-8,607

Serie 3 Interval Serie 6 A Interval

Asymmetri | 0,708-0,733 | Asymmetri | 0,704-0,738

k’ 1,571-1,575 k’ 1,571-1,575

Teoretiske bunde Teoretiske bunde

Selektivitet | 2,609-2,621 | Selektivitet | 2,608-2,620

Resolution | 8,314-8,610 | Resolution | 8,416-8,631

Side 16

16

Serie 6 B Interval Serie 7 C Interval

Asymmetri | 0,704-0,738 | Asymmetri | 0,774-0,786

k’ 1,571-1,575 k’ 0,119-0,121

Teoretiske bunde Teoretiske bunde Regnes ikke her

Selektivitet 2,608-2,620 Selektivitet Blev ikke målt*

Resolution 8,416-8,631 Resolution 3,319-11,621

Serie 7 A Interval Serie 7 D Interval

Asymmetri | 0,706-0,754 | Asymmetri | 0,706-0,754

k’ 0,883-0,887 k’ 0,883-0,887

Teoretiske bunde Teoretiske bunde

Selektivitet | 5,207-5,154 | Selektivitet | 5,207-5,154

Resolution 8,386-8,729 Resolution 8,386-8,729

Serie 7 B Interval

Asymmetri 0,707-0,721 k’ 0,875-0,881

Teoretiske bunde Regnes ikke her

Selektivitet Blev ikke målt*

Resolution 14,635-15,348

*Vi fik ikke sat computeren til at regne det.

Se alle udregninger i bilagsmappen under seriens nr. og prøvernes nr.

Side 17

17

Diskussion & konklusion

Serie 1 & Serie 2: Vores Serie 1 er ikke rigtigt god! Gennemsnittet af prøverne er meget lavt i forhold til de andre serier. Men genfindingerne er dog ikke de laveste. CV% er

MEGET højt, og det er ikke ret godt. Det viser hvor dårlig en serie det er. Serien er lavet som reproducer, hvilket vil sige at vi begge har lavet serien, og det må konkluderes som værende en dårlig ide.

Serie2 viser heller ikke et godt gennemsnit! Det er stadigvæk langt under det

forventet som er 2 g/100g. Genfindingerne er forholdsvis lave. Standardrækken
er først optimal efter 100 mg/l og 150 mg/L er fjernet. Og prøverne varierer

meget. Serie 2 er dog bedre end serie 1. Gennemsnittet er større og genfindingerne er også større.

Vi kan konkluderer at reproducerbarheden er meget dårlig mellem serie 1 og 2.

Serie 3 & Serie 4: Prøvernes gennemsnit ligger tæt på hinanden og det gør genfindingerne også. De er dog ikke optimale og langt fra de forventet 2 g. CV% kunne godt for serie 4’s vedkommende være bedre. Repeterbarheden er ikke videre god i serie 3 og 4.

Serie 3’s kalibrering er først optimal efter 150 mg/l er fjernet fra kurven. Men

serie 4’s kalibrering er god med alle 6 standarder.

Vi kan konkluderer at Repeterbarheden ikke er god mellem serie 3 og 4.

Serie 5 & Serie 6 A: Kalibreringerne er gode. Alle standarder er med. Det er stadigvæk

langt under det forventet som er 2 g/100g. CV% er heller ikke særlig god, den

skulle helst være en del lavere end 3 %. Dvs. at der ikke er en særlig god repeterbarhed i mellem Leas to serier. Genfindingerne er rigtig dårlige i begge serier. Ved serie 5 er især genfinding 2 meget lav. Til serie 6 kan vi konkludere her at Lea med megen stor sandsynlighed har tilsat 0 mg koffein i genfinding 1 og 20 mg koffein i genfinding 2.

Serie 6 A & B: Serierne er kørt med en dags mellemrum, og det tager serien ikke skade af. Alle resultaterne er fuldstændig ens. Prøvens stabilitet er meget god!

Vi kan konkludere her at der ikke er forskel på at køre serierne én dag senere, så længe at de er i vails. Vi kan ikke konkludere om der er forskel, hvis de ikke er oprenset eller om de kun er lavet dvs. at de stadig står i substratflaskerne.

Serie 7 A, B, C & D: Kalibreringerne er gode. Alle standarder er med. Det er dog stadigvæk langt

under det forventet som er 2 g/100g i serie 7 A, B og C. I serie 7 D, hvor vi

kører med en ny stamopløsning og standarder kan vi dog se en væsentlig stor forskel af koncentrationerne, de er meget højere, næsten dobbelt så høje, men stadig mindre end hvad vi forventede at finde. Vi kan her godt konkludere at vores første stamopløsning ikke har været helt optimal. Men til gengæld kan vi påvise at der ikke sker nogen forandring af koncentrationen af stamopløsningen, selvom den står i laboratoriet i 14 dage. Prøve 4 i serie 7

A ser meget mærkelig ud. Vi kan dog ikke sige hvad der er galt med den. Vi har kørt den tre gange mere i serie 7 B, C & D, hvor der ikke er noget galt med den.

Side 18

18

Der er ikke nogen væsentlig forskel mellem koncentrationerne ved den tre andre serier. Her kan vi så konkludere at det ikke gør noget at køre ved et højere flow og anden bølgelænge. Det kan vi selvfølgelig kun sige om dem vi har undersøgt for. Så der er god robusthed her. CV% er god ved serie 7 A og D. Den ikke er særlig god ved serie 7 B og C, hvilket er lidt underligt når det er de samme prøver. Her kan signalændringen og flowændringen spille en rolle.

Genfindingerne er igen meget lave ved serierne 7 A-C, men serie 7 D ser meget bedre ud. Der er dog ved alle serierne stor variation mellem genfinding 1 og 2.

Detektionsgrænse: Her fandt vi ikke den nedre grænse for hvor lidt prøve vi kan måle. Vi ved dog

at vi ikke kan måle under 0,5 mg koffein/ L kaffe.

Konklusion på systemtest:

Asymetrik: Vores til ligger mellem 0,704-0,765. Selvom vores tal ligger under 1 har vi tailing på vores toppe, Dette kan godt lyde lidt mærkeligt, da det ikke passer helt med teorien, men der er 5 forskellige måder at udregne Asymetrikfaktoren på, så derfor tager vi ikke tallene så højt. tailing kan betyde at der muligvis kan være et dødsrumfang, kolonnen er tilstoppet, dårlig eller slidt.

Kapacitetsfaktor - k’: vores tal ved serie 1 og 7 ligger vores tal meget lavt, hvor ved vores andre serier (2-6) ligger de en del højere, næsten dobbelt så højt.

Teoretiske bunde: Vi regner kun for serie 3,4,5,6 A / B, og 7 A / D. da de er lavet under samme

betingelser. Her ligger vores tal fint, inden for det optimale område. Variere dog en smule.

Selektivitet: Vores toppe er meget langt fra hinanden. Vores tal ligger mellem 2,605 og 5,207. Ved serie 1 og 7 ligger vores tal meget højt, hvor ved vores andre serier (2-6) ligger de en del lavere. Her kan vi godt konkludere at vi godt kunne køre ved et højere flow, så toppene kommer ud tættere på hinanden.

Resolution: Vores tal ligger meget højt, men der er også en meget stor afstand mellem toppene. Vi skulle faktisk ikke have beregnet disse, men gjorde alligevel.

Side 19

19

Samlet konklusion på metodevalideringen:

- Robusthed: Det ser ikke ud til at hverken ændring i flow eller bølgelængde gør nogen forskel på serierne. Selv om bølgelængden faktisk blev ændret til det optimale ser der ikke ud til at havde ændret resultatet i positivretning.

- Repeterbarhed: Sammenligner man serie 3 & 4 (lavet af Line) ser repeterbarheden dårlig ud.

I serierne 5 & 6 (lavet af Lea) er repeterbarheden heller ikke god.

Vi konkluderer i henhold til vores resultater at repeterbarheden ikke er god.

- Reproducerbarhed: Serie 1 og 2 er klart bevis på at reproducerbarhed heller ikke er metodens stærke side. Men sammenligner man serie 1 og 2 med de andre serier kan man se at disse er langt bedre. Serie 1 kan være offer for ”første gangs sjusk”. Vi konkludere at der ikke er særlig god reproducerbarhed.

- Nøjagtighed: Prøverne når ikke den sande værdi 2 g, de ligger en del under og er ikke helt ens.

- Præcision: Vi rammer nogenlunde de samme værdier hver gang. Serie 1 er dog lidt udenfor.

Konklusionen må derfor være at præcisionen er god.

- Stabilitet: Prøven kan sagtens holde til at blive lavet en dag og kørt dagen efter. Ser man på Serie 6 A & B kan man se at de er helt ens. Serie 6 A er lavet og kørt samme dag.

Serie 6 B er den samme serie, den er bare kørt igen dagen efter.

Så vi konkludere at prøven har en god stabilitet!