Produktion og oprensning af β-galactosidase

Side 1

Produktion og oprensning af β-galactosidase

Universitet el. Videregående 1. år

08 April 2010

Side 2

Indledning

Formålet er at oprense β-galactosidase.

Princippet i oprensning og produktion af β-galactosidase:

Til hver prøve skal vi høste celler fra to fermenteringskulturer.

Princippet for cellehøst er at vi centrifugere vores fermenteringskulturer, for at rense dem for dyrkningsmiddel, før vi skal åbne cellerne.

Cellerne åbnes ved hjælp af sonikering under køling.

For udsaltning tilsættes ammoniumsulfat med 60 % mætning, for primært at fjerne vandet fra proteinerne. De fleste proteiner er opløselige i vand, men så snart der tilsættes den rette koncentration af salt, vil saltet og vandet binde sig til hinanden, og proteinerne vil udfældes.

Sekundært er udsaltning også en form for grovsortering af proteiner.

Ved Gelfiltrering adskilles molekylerne efter molekylestørrelse ved hjælp af en Bio-Rad kolonne med søjlematerialet Sephadex, som er koblet på en UV-monitor og en skriver. Når prøven påsættes kolonnen, vil de små molekyler (saltet) i søjlen trænge ind i gelmaterialet og blive forsinket.

Hvorimod proteiner er for store til at trænge ind, og vil løbe lige igennem. Dermed bliver saltet altså fjernet fra proteinopløsningen.

Ved ionbytning adskilles proteinerne efter ladning ved hjælp af en anionbytter, en UV-monitor, en

fraktionsopsamler og en skriver. β-galactosidase har en pI = 4,7, og når pH er på 6,1, vil

opløsningen blive negativt ladet. Da søjlematerialet er positivt ladet vil β-galactosidase først og fremmest sætte sig fast på kolonnen, og de positivt ladet proteiner vil løbe igennem. Så snart der tilsættes 1M NaCl, vil Cl-ionerne optage alle pladserne med positiv ladning, og β-galactosidase vil her løbe ud af kolonnen.

Princippet i SDS PAGE:

Sodiumdodecylsulfat- polyacrylamidgel- elektroforese også kaldet SDS-PAGE er den mest anvendte elektroforetiske metode til analyse af komplekse proteinblandinger.

SDS-PAGE er en relativ hurtig og nem procedure, der kun kræver få µg protein. Stort set alle proteiner er let opløselige i SDS-buffer, hvorfor metoden er generelt anvendelig.

Alle komplekser har identiske ladninger – SDS´ ladning- hvorfor vandringen i polycayrlamid-gelen vil afhænge af de enkelte proteiners størrelse. Proteiners forskelle i struktur, ladning og opløselighed bliver således af mindre betydning i SDS-PAGE, hvor molekylvægten er den væsentligste separationsfaktor.

Proteinerne farves med coomassie brilliant blue.

Princippet i Western blotting:

Efter SDS-PAGE overføres proteinerne fra gelen til en nitrocellulosemembran, vha. en semi-dry-blotting-metode, en ”sandwich”-metode. Princippet er at man kan få proteiner til at vandre vha.

strøm. Negative proteiner vil derfor vandre mod den positive elektrode. For at få strømmen til at vandre igennem proteinerne opbygges ”sandwichen” på en bestem måde.

Et Western blot er en teknik, der gør det muligt at teste tilstedeværelsen af et specifikt protein i en opløsning med mange forskellige proteiner.

Man har en flad elektrode, den er flad for at udligne spændingsforskellen. På elektroden placeres et stykke plastik (maske) med et hul i som er lidt mindre end membranen, det er for at lede strømmen igennem membranen som ligger i hullet da plastik ikke leder strøm. Man væder membranen og filterpapiret i transferbuffer, som indeholder alkohol fordi det leder strømmen bedre og giver en stærkere binding proteiner og membran imellem. Over hullet lægges et filterpapir, derefter

Side 3

nitrocellulosemembranen , så gelen og til sidst endnu et filterpapir. Til sidst lægges den anden elektrode ovenpå som toppen på en sandwich.

Efter man har overført proteinerne fra gelen til membranen, bruger man en antigen-antistof-metode til at detektere, den indirekte metode.

Fremgangsmåde

Forskrifter vi arbejder efter: ”Produktion og oprensning af β-galactosidase”, ”SDS PAGE + farvning af geler” og ”SDS PAGE og Western blotting”.

Vi udtager prøve til renhedstest, efter vi har forfermenteret, for at sikre os at vores prøve kun indeholder E-coli og ikke andre bakterier.

Vi udtager 5 analyser, samt måler volumen af vores oprensningprøver, hhv efter vi har åbnet cellerne, efter vi har udsaltet og centrifugeret 1. gang (supernantanten der ellers hældes fra), efter

2. centrifugering i saltfældningen, efter gelfiltreringen og efter ionbytningen. Disse analyser skal fortælle os om vi får oprenset vores enzymer, og om vi får fældet det rigtige ud ved saltfældningen.

Vi måler enzymaktivitet og proteinindhold samt bruger disse prøveudtagninger til SDS PAGE og Western blotting.

• Forfermentering: Vi tilsætter 200 ul E-coli kultur til 100 ml grundsubstrat, og inkuberet på rystebord v. 37 grader natten over.

• Fermentering: 5 ml fra forkulturen tilsættes 150 ml grundsubstrat. Vi laver 4 fermenteringskolber, 2 til hver prøve. Disse inkuberes natten over på rystebord ved 37 grader.

• Cellehøst: Kulturerne fordeles i 80 ml centrifugeglas, som centrifugeres ved 3000 g i 15 min. Supernatanten bortkastes og pellet vaskes i 0,05 M L-histidin pH 6,1. Der centrifugeres

igen på samme måde, og herefter opslemmes pellet i 2*5 ml 0,05 M L-histidin.

Opslemningerne hældes sammen i et bægerglas.

• Åbning af celler: Bægerglasset placeres i et isbad i sonikator, og der sonikeres i 5*2 min: 2

minutters sonikering og 1 min. Afkøling osv.

• Klaring af råekstrakt: Efter åbning af celler, centrifugeres opløsningen i kølecentrifuge ved 4ºC i 45 min. Ved 15.000g. Herefter udtages 0,5 ml til 1. analyse.

• Udsaltning: Først beregnes hvor meget ammoniumsulfat der skal tilsættes til 60 % mætning ved formlen:

.

Når saltet er opløst anbringes bægerglasset i køleskab på magnetomrører natten over.

Dagen efter centrifugeres proteinopløsningen i 30 min. ved 10.000g ved 4ºC. Herefter frahældes supernatanten, og der udtages 0,5 ml til 2. analyse.

Pellet opløses i ca 2,5 ml 0,05M L-histidin, som centrifugeres i 20 min. Ved 10.000g ved

4ºC. Derefter udtages 0,5 ml til 3. analyse.

• Gelfiltrering: Først degasses L-histidin i ultrabad i 20 min. Herefter fremstilles søjlematerialet ved at afveje 20 g Sephadex i 200 ml L-histidin som koges i 1 time i en

gryde for at udbløde og afgasse det. Når søjlematerialet er afkølet, hældes det på en 2,5*20

cm Bio-Rad kolonne. Kolonnen kobles til en UV-monitor (280nm) og en skriver. Vi ækvilibrerer kolonnen med 0,05M L-histidin, inden prøven tilsættes. Når prøven er tilsat elueres igen med 0,05M L-histidin. Proteintoppen kan nu følges på skriveren, og så snart proteinerne løber ud af kolonnen, opsamles de i et bægerglas. Herefter udtages 0,5 ml til 4 analyse.

• Ionbytning: Vi genbruger søjlematerialet fra et andet hold. Så derfor starter vi med at skylle saltet ud med 80 ml degasset 0,05M L-histidin. Kolonnen kobles til en UV-monitor, en fraktionsopsamler og en skriver. Prøven påsættes kolonnen og efterfølgende elueres med

Side 4

0,05M L-histidin, indtil den først proteintop er løbet ud af kolonnen. Dernæst tilsættes det fremstillede 1M NaCl som også elueres med 0,05M L-histidin indtil den næste proteintop er løbet igennem. Samtidig noterer vi hvilke rør der bliver opsamlet i, ved netop denne top.

Der udtages nu en dråbe fra hvert af disse rør, og tilsætter 1 dråbe assayblanding, de rør der giver den kraftigste gule farve hældes sammen i et måleglas. Og vi udtager nu 0,5 ml til 5.

analyse.

SDS PAGE

Prøverne skal have passende koncentration svarende til 1 mg/ml protein. Hvis prøverne har
koncentration på > 2 mg/ml fortyndes prøven med ultrarent vand(mili-Q vand). Hvis prøverne har
en koncentration på < 1 mg/ml skal man tilsætte forholdsvis mere prøve og mindre ultrarent vand

under forberedelsen til SDS. Se Islims journalbog s. 14 og 15 for fremstilling samt fortyndinger.Vi har to geler, den ene til SDS PAGE den anden til Western blotting. Og vi er to hold.

• Elektroforesen.

• PAGE-gel (SDS-gel 4-12% TEO-CL SDS 12-well Lotnr: 0) udtages fra posen med handsker og skylles med vand og derefter med Running buffer to gange og brøndene fyldes med Running buffer.

• Prøverne fremstilles i eppendorfrør. For derefter at opvarme dem i 70 ºC på varmblok i 10 min.

• Gelkassetterne sættes i elektroforeseapparatet.

• Der fyldes op med buffer.

• Det er vigtig, at der ikke er nogen bobler i brøndene.

• Gelen placeres i cellen så udskæringen til brøndene vender ind mod centrum af cellen. Indre bufferkammer fyldes til kanten med runningbuffer.

• Prøverne påsættes gelen, se neden under for placering af prøverne.

• Bufferkammers ydre side fyldes med runningbuffer.

• Gelen køres ved 150 volt konstant indtil farven i samplebufferen når bunden af kassetten..

• Når farven er nået bunden afbrydes strømmen og kassetten fjernes med handsker fra elektroforesecellen.

• Gelen skylles med vand og den er nu klar til at blotte samt farvning.

Placeringen af prøverne:

Brøn 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 d

Prøve To 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 Markø 2:1 2:2 2:3 2:4 Tom m r

• Farvning af gelen

• Gelen behandles i 20% ethanolopløsning i 5 min som er opvarmet i vandbad ved 60 grader.

• Derefter kommer vi gelen i ca. 100 ml Coomassie R-250 farveopløsning i 15 min. På et rystebord.

• Gelen vaskes 4 x 5 min i 20 % ethanol 5 % eddike.

• Til sidst udskiftes affarveren og der hældes ca. 300 ml oven på gelen og denne stå natten over.

• Western blotting:

• Gelen tages ud af kassetten og brøndene skæres af.

• Imens fugtes membranfilteret; PAGE-gel, sandwich 8,5 x 9, 00 cm, batch; 1 i transferbuffer.

• Det første lag fra sandwichen lægges på Semi- dry blotteren, luftbobler trykkes ud, ved at

Side 5

rulle et reagensglas hen over.

• Nitrocellulosemembranen lægges oven på det første filterpapir i semi- dry blotteren

• Gelen lægges oven på nitrocellulosemembranen

• Til sidst lægges det sidste papir lag fra sandwichen oven på gelen, og der glattes ud med et reagensglas for at undgå luftbobler.

• Den negative elektrode placeres oven på, og fastgøres til semi- dry blotteren

• Strøm tilsluttes 100 mA anvendes ved 5-25 V i en time .

• Membranen tages ud og pakkes ind i vitawrap og opbevares i køleskabet til næste dag til detektion.

• Detektion:

• blokering; Membranen blokeres i 2x5 min i 20 ml PBS+ 0, 05 % Tween under omrystning.

• Primært antistof; Vi fortyndede det primære antistof, mus-anti-β-galactosidase 1000 gange i

PBS+Tween. Denne hældes over membranen og henstår/ inkuberes i en time under svag

omrystning.

• Vask; Membranen vaskes 4x5min i PBS + Tween . efter sidste vask hældes væsken ud.

• Sekundært antistof; Vi fortyndede det sekundære antistof, Rabbit-anti-mus-Ig HRP 1000 gange på samme måde som det primære antistof. Denne hældes over membranen og inkuberes i en time under svag omrystning

• Vask; Membranen vaskes som ovenover 4x5min i PBS + Tween

• Detektion; AEC- opløsningen 10x fortyndes i 0, 05M Na- acetatbuffer pH 5. Lige inden brug tilsætte vi 20 µl Hydrogenperoxid (30%) for derefter at hælde det oven på membranen.

Vi lod membranen ryste svagt med opløsningen i ca. 5 og afventede farvereaktion.

Båndende ses tydeligt på membranen se bilag 29.

Afvigelser fra forskrift:

Ved SDS farvningen, er farven ikke opvarmet, som det står i vejledningen.

Vi har ved Western blotting ikke klippet hul i gelen og den er ikke lagt på et stykke plastik, da dette ikke behøves med det apparat vi har benyttet.

Resultatbehandling:

Vi indsætter vores enzym og proteinmålinger i oprensningsskema, for at danne os et overblik over oprensningsforløbet.

Vi vurdere SDS gelen visuelt og beregner molvægten ud fra en molvægtsgraf.

Til sidst bestemmer vi oprensningen ved at se på membranen fra Western blotting, som er specifik.

Resultater

Vi kan ud fra vores enzymmålinger i rapportbilag 1 se at vi får oprenset vores enzym i prøve 1, da vi kan se at den specifikke aktivitet stiger, i prøve 2 falder den specifikke aktivitet lidt.

Ved SDS PAGE oprensningen, kan det ses at der ved udsaltningen, brønd 3 og 9 forsvinder noget ad det vi ikke leder efter, se rapportbilag 2. Vi kan ikke se at vores protein bliver mere koncentreret, alle båndene forbliver lige kraftigt i løbet af oprensningen. Vi har ved aflæsning af molvægtsgrafen og beregning ud fra linjens ligning bestemt at det øverste bånd på vores gel er β-galactosidase, jvf.

bilag 3.

På Western blotting, kan der aflæses bånd ved brønd 2, 4, 5, 6 samt 8, 10 og 11, hvilket betyder at der er β-galactosidase i disse brønde, se rapportbilag 3.

Diskussion

Det kan diskuteres hvor godt vores prøve er oprenset. Det ser ikke ud til vores metode har været optimal på visse punkter, da vi på vores SDS gel (rapportbilag 2) ikke kan se nogen større forskel på de forskellige bånd. Det kan dog siges at vores saltfældning bestemt ser til at have fungeret som den

Side 6

skulle, da vi kan se at der ikke er noget β-galactosidase i vores supernatant efter saltfældningen (se rapportbilag 3).

Vi har ud fra SDS PAGE forsøgt at regne os frem til molvægten af β-galactosidase (se rapportbilag

4), denne beregning viser dog ikke med sikkerhed, at det er det vi har oprenset, dog kan man diskutere hvor nøjagtigt man kan beregne molvægten ved at måle afstande mellem båndene på et billede.

For at få en bedre oprensning kunne man lave flere saltfældninger.

Vores total enzymaktivitet burde have været mere stabil, ikke falde så meget (se rapportbilag 1).

Vi kan se at vores specifikke aktivitet i prøve 1 stiger som den også skal, dog er der et fald ved 3.

udtagning, som kan skyldes at vi får hældt noget af vores enzym ud sammen med de uønskede proteiner.

Ved prøve 2 sker faldet ved 4 udtag.

Det kan dog være en fejlkilde af vi har genbrugt en ionbyttersøjle. Vi har også i flere tilfælde haft vores prøver stående ved stuetemperatur i længere perioder, mens vi ventede på at lave det næste trin i forsøget.

Konklusion

Vi kan konkludere ud fra Western blotting at vi har β-galactosidase med i hele oprensningsprocessen jvf rapportbilag 3, dog ser det ikke oprenset ud, og i prøve 2 se det ud til at vi har mistet en del af det undervejs.

På baggrund af vores oprensningskema (rapportbilag 1) kan vi konkludere at der sker en oprensning i prøve 1, som ikke kan aflæses på SDS gelen eller Western blotting.