SRO om fluorescens i Fysik B og Kemi B

Side 1

Forside til studieretningsopgaven (SRO)

STX 2.g

________________________________________________

Klasse: 2.A

________________________________________________

Studieretning: Mat A, Fys B, Kemi B

________________________________________________

Opgavens fagkombination: Fysik/Kemi

________________________________________________

Vejledere: Mike Vandal Auerbach og Lasse Baasch Engedal

________________________________________________

Opgavens emneområde: Fluorescens

________________________________________________

Denne forside skal du aflevere til din vejleder(e) senest d. 24/1-2015

Ved at underskrive godkender de dine valg og returnerer forsiden til dig.

Vejlederne udleverer den endelige opgaveformulering til dig med evt. ukendte bilag

senest d. 7/2-2015 (uge 7)

Denne forside og den endelige opgaveformulering, skal du efterfølgende påhæfte den færdige opgave, som du underskriver efter konklusionen, kopierer og afleverer direkte til begge dine vejledere. Opgaven afleveres desuden elektronisk i en dertil oprettet afleve-

ringsmappe i fronter. Senest mandag den 16/2 2015 kl.10.

Opgaven skal have et omfang på max. 8-10 sider, eksklusiv denne forside, opgaveformu-leringen, din egen forside, det engelske abstract, indholdsfortegnelse, noter, litteraturliste og bilag.

Opgaven fastsættes til 20 timers elevtid.

Vejlederes underskrift

___________________________

Side 2

Side 2 af 27

Fysik-kemi: Fluorescens

Nogle stoffer kan fluorescere, dvs. at de kan udsende lys af nogle bestemte bølgelængder hvis de bliver belyst med elektromagnetisk stråling af nogle andre bølgelængder. Der findes mange natur-fænomener som fluorescens er en del af, ligesom fluorescenfænomenet bl.a. udnyttes i nogle kemi-ske, fysiske og bioteknologiske metoder.

Du skal i denne opgave undersøge B2-vitaminet riboflavins fluorescens. I undersøgelsen anvendes spektrofotometri. En væsenstlig komponent i et spektrofotometer er et optisk gitter.

Det eksperimentelle arbejde udføres på skolen.

Opgaven

• Gør rede for emission og absorption af fotoner i atomer og molekyler, gør herunder rede for absorptions- og emissionsspektre. Forklar herudfra fluorescensfænomenet.

• Forklar, hvordan man vha. et optisk gitter kan opsplitte lys is det forskellige bølgelængder, udled herunder gitterligningen.

• Optag emissionsspektre af riboflavin ved forskellige excitationsbølgelængder. Vejledningen til eksperimentet ligger i Fronter.

• Perspektivér ved at redegøre for et naturfænomen som fluorescens er en del af, samt en ke-misk, fysisk, eller bioteknologisk metode som udnytter fluorescensfænomenet.

I opgavebesvarelsen skal desuden på passende steder indgå følgende

• En beskrivelse af hvordan det eksperimentelle arbejde er blevet udført.

• En gennemgang af de udført målinger og beregninger

• En vurdering af resultaterne.

Side 3

Side 3 af 27

Abstract

This paper examines and accounts for the process of fluorescence and the underlying theoretical background. This includes accounting for the processes of emission and absorption and emission and absorption spectrums for hydrogen. The process of fluorescence in molecules and the influence of the molecular structure of the molecules are also accounted for. The diffraction grating equation is deduced through thorough explanation of how diffraction grating works.

By using a spectrophotometer we were able to measure the absorption spectrum of riboflavin in our

solution with a riboflavin concentration of 60 mg/L. We also measured the emission spectrums for

the wavelengths 405 nm and 500 nm. By analyzing these measurements we concluded that the op-timal excitation of riboflavin is accomplished by illumination of wavelengths between 414 nm and

472 nm, with an maxima by 444 nm. The emission of riboflavin was concluded to primarily happen in the wavelength interval 500 nm to 600 nm. These results are also discussed and assessed against the spectrum of visible light.

The process of fluorescence is also put into perspective of nature and science. Some of the scientific processes of the fluorescent protein GFP are explained. For instance is the fluorescence in the pro-tein used for the diagnosing cancer sooner than other ordinary diagnosing processes. Fluorescence is also vital in innumerable other scientific processes.

Side 4

Side 4 af 27

Indhold

Fysik-kemi: Fluorescens ..................................................................................................................................... 2 Opgaven ......................................................................................................................................................... 2 I opgavebesvarelsen skal desuden på passende steder indgå følgende ....................................................... 2 Abstract ............................................................................................................................................................. 3 Indledning .......................................................................................................................................................... 5 Teoretisk baggrund for fluorescensfænomenet................................................................................................ 5 Emission og absorption af fotoner ................................................................................................................ 5 Emissions- og absorptionsspektre ................................................................................................................. 7 Fluorescens af molekyler ............................................................................................................................... 8 Optisk gitter ................................................................................................................................................... 9 Gitterligningen ............................................................................................................................................. 10 Fluorescens i riboflavin .................................................................................................................................... 12 Forsøgsudførelse ......................................................................................................................................... 12 Analyse af måledata .................................................................................................................................... 13 Fejlkilder og måleusikkerheder ................................................................................................................... 14 Green fluorescent protein ............................................................................................................................... 15 GFP i vandmand ........................................................................................................................................... 15 GFP og den fluorescens i videnskaben ........................................................................................................ 15 Konklusion ....................................................................................................................................................... 17 Bibliografi ......................................................................................................................................................... 18 Bilag 1 .............................................................................................................................................................. 20

Side 5

Side 5 af 27

Indledning

Fluorescens er en proces, hvor elektronerne i et stof absorberer lys, altså fotoner, og bliver hævet til et højere energiniveau, hvilket kaldes en exciteret tilstand. Hernæst falder elektronerne tilbage til deres grundniveau ved emission af fotoner. Disse fotoner har mindre energi, end de absorberede fotoner, hvorved deres bølgelængde vil være blevet forlænget sammenlignet med de absorberede fotoner, som det er forklaret af Bohrs postulater mellem energi og bølgelængde.

Denne proces, som kaldes fluorescens, bliver brugt ofte i vores hverdag, bl.a. til tekstilfarver, sik-kerhedsudstyr og belysning i form af lysstofrør.

Denne opgaves fokus vil være at påvise og forklare B2-vitaminet riboflavins fluorescens ved an-vendelse af spektrofotometri. Derudover vil det blive redegjort for emission og absorption af foto-ner i atomer og molekyler. På baggrund af denne viden, vil der blive redegjort for emissions- og absorptionsspektre og selve fluorescensfænomenet. Det optiske gitter vil også bliver forklaret, her-under hvordan dette kan opsplitte lys i dets forskellige bølgelængder. På baggrund af denne viden, vil gitterligningen blive udledt.

Som det sidste vil fluorescensfænomenet blive perspektiveret til naturen og videnskaben, hvor der tages udgangspunkt i proteinet GFP og dets opdagelse og funktion. Hernæst vil GFP og dets brug i forskellige videnskabelige sammenhænge kort blive gennemgået.

Teoretisk baggrund for fluorescensfænomenet

For at forstå fluorescensfænomenet, er der en mængde videnskabelig viden, som må forstås. Herun-der emission og absorption af fotoner.

Emission og absorption af fotoner

Emission og absorption er hinandens modsætninger og de spiller en stor rolle i forståelsen af fluore-scensfænomenet. Hvis atomer eller molekyler, som kan fluorere, bliver belyst, bliver der absorberet fotoner med en bestemt bølgelængde i dem.

Ved absorptionen af fotonen har elektronen optaget energien, som var fotonen. Den har altså fået sig en højere mængde energi.

Det modsatte sker ved en emission. Her udsender en elektron en foton og går derved fra en højere energimængde til en lavere, eftersom elektronen mister energi.

To af Bohrs postulater forklarer dette energiskifte for et hydrogenatom:

Side 6

Side 6 af 27

Det første postulat går på, at elektronen skifter bane, når den absorberer eller emit-terer en foton. Ved absorption, og derved energiforøgelse, hæves elektronen til en højere tilstand, som det er illustreret på billede 1.

Her ses det tydeligt, hvordan elektronen, som kredser om kernen absorberer en foton og derved sti-ger til et højere niveau. Denne stigning sker dog ikke lidt ad gangen, da det ikke er muligt for en elektron at bevæge sig imellem sine stationære baner. Elektronen bliver nødt til enten at være i den ene stationære bane eller den anden.

Ved en emission, hvor energimængden falder til et lavere niveau, sker det mod-satte af absorptionen. Her falder elektro-nen til et lavere energiniveau, og derved en stationær bane tættere ved kernen, ved udsendelse af en foton, som det ses af billede 2.

På billederne ses elektronernes baner som faste og de er afbilledet som cirkler omkring kernen.

selvom denne fortolkning ikke er rigtig, giver det stadig et godt indtryk af, hvordan emission og absorption fungerer.

Bohrs andet postulat går på, at når en elektron går fra en stationær tilstand til en anden, som når der absorberes eller emitteres en elektron, kan energien af fotonen udregnes som følgende:

𝐸_{𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛} = 𝐸_{𝑚} − 𝐸_{𝑛}

Her er 𝐸 og 𝐸 de to stationære tilstande, som elektronen bevæger sig imellem og 𝐸 er den
       𝑚    𝑛                                                       𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛

mængde energi, som fotonen vil have, når elektronen går fra den ene stationære tilstand til den an-den. For et givet stof vil den energi, som der er mellem to stationære tilstande, altid være den sam-me.

Energien af fotonen er også defineret på følgende måde på baggrund af Bohrs postulater:

Billede 2:

Absorption

Billede 1:

Emission

Side 7

Side 7 af 27

𝐸_{𝑓𝑜𝑡𝑜𝑛} = ℎ · 𝑓

I denne formel for udregning af en fotons energi er ℎ Placks konstant og 𝑓 er frekvensen for foto-nen. På baggrund af dette, giver det selvfølgelig mening at en lav bølgelængde er lig en høj energi, eftersom frekvensen bestemmes af bølgetoppe per tid og en foton altid vil bevæge sig med lysets hastighed. På samme måde er en høj bølgelængde lig med en lav energi. Dette ses af formlen for sammenhængen mellem en bølges hastighed, frekvens og bølgelængde, som henholdsvis 𝑣, 𝑓 og 𝜆:

𝑣 = 𝑓 · 𝜆

(Elvekjær & Benoni, FysikABbogen2, 2006)

Emissions- og absorptionsspektre

For at kunne redegøre for absorptions- og emissionsspektre, er det praktisk først at få bestemt det kontinuerte spektre.

Det kontinuerte spektre har i et sammenhængende bølgelængdeom-råde jævnt varierende intensitet. Det-te vil sige, at der over et interval ikke mangler noget lys ved nogen af bøl-gelængderne inde i intervallet. Et eksempel ses på billede 3.

Emissionsspektret, eller linjespektret som det også er kaldt, viser det lys, som bliver udsendt, når en exciteret elektron udsender energi. Det er bølgelængderne af den udsendte energi, der bliver emitteret. Eksem-pel kan ses på billede 4.

Absorptionsspektret viser, modsat emissionsspektret, alle de bølge-længder, som ikke bliver emitteret af det pågældende stof. Altså viser absorptionsspektret alle de bølge-

Billede 4:

Kontinuert spektrum

Billede 3:

Linje-/Emissionsspektrum

Billede 5:

Absorptionsspektrum

Side 8

Side 8 af 27 længder, som stoffet bliver belyst med, men som ikke bliver sendt videre af stoffet. På billede 5 ses absorptionsspektret, som passer til de to foregående billeder. Af disse billeder ses det, hvordan de bølgelængder af lys, som bliver emitteret ikke er i absorptionsspektret. (Elvekjær & Benoni, FysikABbogen2, 2006)

Fluorescens af molekyler

Den ovenstående forklaring af absorption, emission og deres spektre fungerer godt til at bestemme, hvad deres funktion er for hydrogen, men selve forklaringen er en forsimplet version af den, som er brugt ved fluorescens af riboflavin. Riboflavin fungerer netop ikke som hydrogen, når det kommer til energiniveauerne, som kan absorberes og som emitteres. Som det ses af billederne i det foregå-ende afsnit er det tydeligt, at absorberingen af fotoner kun kan foregå ved to specifikke bølgelæng-der. For molekylet riboflavin findes der en del flere bølgelængder, som der kan absorberes og der-ved også en del flere energiniveauer, som elektronerne i riboflavinmolekylet kan bliver hævet til.

Der er altså ikke blot en exciteret status og en grundstatus, som elektronerne bevæger sig imellem, men også en masse stationære tilstande derimellem, som elektronerne henfalder til og fra.

Derudover er det muligt for et exciteret molekyle at henfalde mod sin grundstatus af flere veje. Der-af er fluorescens, altså udsendelse af en foton, en af dem. En anden er, at noget af energien, som elektronen har, bliver afgivet til molekylet, hvorved elektronen mister noget af sin energi uden at der udsendes en foton. Når den exciterede elektron afgiver en del af sin energi uden at udsende en foton, kaldes det radiationsløst energihenfald (radiationless deexcitation). Kombinationen af disse kan medfører, at den foton, som bliver emitteret ikke har den samme energi, som den foton, der bliver absorberet. Denne energiforskel kaldes for Stokes Shift. En visualisering af dette, kan vises ved brug af et Jablonski diagram, som viser disse energiændringer.

På billede 6 ses et Jabolski diagram, som illustrerer hvordan en elektron bliver exci-teret til energitilstanden S2. Elektronen henfalder dog ikke blot til grundtilstanden ved udsendelse af en foton af samme energi, som den absorberede. Der bliver først afgivet noget Billede 6:

Jabolski diagram

Side 9

Side 9 af 27 energi ved radiationsløst energihenfald, som tager elektronen fra energitilstanden S2 til S1. Denne henfalden vil typisk være vibrationsenergi, som omdannes til termisk energi. Ved kontrol af tempe-raturen kan mængden af energi, som frafalder før fluorescensen forekommer, kontrolleres, hvis det er ønsket. Fra S1 henfalder elektronen så videre til grundtilstanden ved udsendelse af en foton. På baggrund af dette har den emitterede foton altså mindre energi, og derved længere bølgelængde, end den absorberede foton. Det er dette fænomen, som kalder for fluorescens. (Fox)

Hvis man ser kort på molekylesktrukturerne af fluorescerende molekyler, ses det at de stoffer som fluorescerer bedst, indeholder aromatiske ringe. Fluorescens forekommer også ved stoffer, som har fusionerede ringe, såsom flere benzenringe, som er fusioneret sammen. Derudover spiller pH-værdien også en rolle for fluorescensen. (Wong)

Optisk gitter

Et optisk gitter er en glasplade eller et spejl, hvori der er lavet en masse parallelle ridser med meget lille afstand mellem sig. Disse ridser fungerer som spalter for lys, som rammer glaspladen vinkelret. Hvis man bag sit optiske gitter har en væg, som er parallel med det optiske gitter, kan man udføre et forsøg med en laserstråle, som har en bestemt bølgelængde. Ved at sende laserstrålen vinkelret ind på det optiske gitter, kan man på væggen bag-ved se, at der er en række lyspletter. Udførelsen af et sådan forsøgs ses på billede 7 på makrosko-pisk plan, hvor der bruges et transmissionsgitter, altså en glasplade.

Det ses tydeligt hvordan laserstrålen, efter den rammer gitteret, bliver delt ud i flere forskellige strå-ler. Af disse stråler kaldes den, som er ud for den originale laserstråle, for den 0. orden. Hernæst kaldes de to pletter, som ligger tættest på den 0. orden, og som er placeret symmetrisk omkring den, for 1. orden. De to næste pletter kaldes 2. orden og så videre.

For at forklare, hvad der rent teknisk sker, når laserstrålen rammer gitteret, bliver man nødt til at se mikroskopisk på gitteret, som rammes af strålen. (Elvekjær & Benoni, FysikABbogen1, 2008) Billede 7:

Laserstråles makroskopiske brydning af gitter

Side 10

Side 10 af 27

Gitterligningen

Gitterligningen er en ligning, som gælder for alle slags bølger, som brydes af et gitter. Denne bryd-ning vil skabe et diffraktionsmønster, som skaber interferens. Herunder ses gitterligningen, som i resten af dette afsnit vil blive udledt og forklaret. For gitterligningen gælder det, at 𝑛 er afbøjnin-

gens orden, 𝜆 er bølgelængden, 𝑑 er gitterkonstanten og Θ_{𝑛} er afbøjningsvinklen.

𝑛 · 𝜆 = 𝑑 · sin (Θ_{n})

Når en laserstråle rammer et optisk gitter, kan fotonerne fra laserstrålen ikke længere opfattes som partikler, da de interfererer med sig selv efter passering af det optiske gitter. Dette skyldes partikel-bølge dualiteten, som i dette tilfælde tillader fotonerne at reagerer som både partikler og bølger.

Denne teori er en stor del af kvantemekanikken og forklarer fotonernes opførsel.

Når man ser på ordenerne af laserstrålen, kan det klart ses, at laserstrålens deling efter gitte-ret ikke kan forklares gennem lysets partikelna-tur, da punkterne på væggen ellers ville have samme mellemrum mellem sig, som mellem-rummet mellem gitterlinjerne. Man bliver der-for nødt til at se mikroskopisk på, hvad der sker ved gitteret.

Her ses det på billede 8, at lyset opfører sig som bølger efter det rammer gitteret. Hvis la-serstrålen beskrives som en plan bølge, kan man på baggrund af Huygens Princip beskrive bølgerne, som dannes efter gitteret, som cirku-lære elementarbølger. Disse elementarbølger interfererer på den anden side af gitteret. De steder hvor to bølgetoppe mødes, er der konstruktiv interferens, og der dannes en lysplet, som kan ses på væggen.

Billede 8:

Laserstråles mikroskopiske brydning af gitter

Side 11

Side 11 af 27

Billede 9:

Laserstråles makroskopiske brydning af gitter

Hvis man igen ser på situationen makroskopisk, er det som sker egentlig, at laserstrålen bliver delt op mange gange, som det ses på billede 9. Disse mange stråler er næsten parallelle, da afstanden til punktet 𝑃, som er en af ordenerne, sammenlignet med afstanden mellem ridserne i gitteret, er så stor.

Hvis man så ser på gitteret ved mikrosko- Billede 10: pisk plan på billede 10, kan det ses, at der må være et helt antal bølgelængder mellem

𝐴𝑃 og 𝐵𝑃, da bølgetoppene ellers ikke ville skabe konstruktiv interferens i punktet 𝑃.

Dette skyldes at bølgetoppene skal have samme retning og afstand til punktet 𝑃, for at skabe konstruktiv interferens dér. Af det-te kan det afledes, at afstanden må være

| 𝐵𝐶 | = 𝜆 · 𝑛, hvor 𝑛 er et helt tal. Af bille-

det kan det også ses, at når de første to strå-ler er i fase, altså er på vej mod punktet 𝑃, må alle de andre delte stråle nødvendigvis også være i fase.

Når man ser på det makroskopiske plan på billede 7 igen, kan det ses, hvordan de forskellig orde-

ners ordensstråler danner en vinkel med den 0. ordens ordensstråle. Denne vinkel er kendt som Θ .
                                                                              𝑛

Som det ses på billede 10, findes denne vinkel også i ⊿𝐴𝐵𝐶, som afbøjningsvinklen. Dette skyldes, Laserstråles mikroskopiske brydning af gitter

Side 12

Side 12 af 27 at trekanten mellem det optiske gitter, 0. orden og n. orden, på billede 7, er ensvinklet med ⊿𝐴𝐵𝐶.

Denne ensvinkling kan begrundes i, at afstanden mellem de to bølgetoppe, som mødes i punktet 𝑃, altså 𝐴𝐶 på billede 10, er retvinklet på radiussen ud til cirklen med centrum i punktet 𝑃, alle ordens-strålerne går imod. Derudover er selve gitteret vinkelret på den 0. ordens afbøjningsvinkel. Af den-

ne grund vil vinklen Θ_{𝑛} i trekanten for 0. orden, n. orden og gitteret, som kan ses på billede 7, være

ens med ∠𝐴 i ⊿𝐴𝐵𝐶 på billede 10.

Nu har jeg altså i min ⊿𝐴𝐵𝐶 på billede 10 fået redegjort for, at hypotenusen er gitterkonstanten, at

den ene vinkel er Θ_{𝑛} og at den modstående katete til Θ_{𝑛} er 𝜆 · 𝑛.

Gitterligningen kan nu endelig udledes af disse informationer. Da sinus til en vinkel er lig den mod-

                                                                       𝜆·𝑛
stående katete delt med hypotenusen vil det for min ⊿𝐴𝐵𝐶 betyde følgende. sin ( Θ ) = . Af dette
                                                                  𝑛
                                                                       𝑑

udtryk er det intet problem at få lavet gitterligningen, som dette afsnit blev indledt med:

sin ( Θ_{𝑛}) · 𝑑 = 𝜆 · 𝑛

(Vestergaard)

Fluorescens i riboflavin

I forbindelse med arbejdet omhandlende fluorescensfænomenet udførte vi et forsøg med fluorescens i riboflavin.

Forsøgsudførelse

Først fremstillede vi en opløsning af pufferopløs-ningen med en pH-værdi på 7. Vi startede med at afmåle 100 mL pufferopløsning, som vi tilsatte

60 mg riboflavin. Dernæst tilsatte vi vand indtil vi nåede 1 liter, som det ses af billede 11. Derved havde vi vores opløsning af 60 mg riboflavin pr.

liter. Vi sørgede naturligvis for at al den tilsatte riboflavin var opløst.

Dernæst kalibrerede vi spektrofotometeret til computeren med LoggerPro med demineraliseret vand. Dernæst målte vi absorbtionsspektrummet

Billede 11:

Den endelige opløsning

Side 13

Side 13 af 27 af riboflavin. Vi målte også fluorescensspektrene for belysning af fotoner med bølgelængderne 405 nm og 500 nm.

Analyse af måledata

Af vores måledata fra LoggerPro [1] lavede vi grafer i Excel, med absorptionen og emissionen som funktion af bølgelængden af det indsendte lys. Af dette fik vi følgende grafer:

Af disse grafer ses det tydeligt, at der er forskel på de to grafer for emission. Af disse to grafer, er det for bølgelængden 405 nm tydeligt, at den er mere effektiv end bølgelængden 500 nm.

Fotonerne, som riboflavin emitterer, kan aflæses af de to grafer for relativ emission. Her ses det tydeligt, at de begge peaker mellem bølgelængderne 500 nm og 600 nm. Dette vil altså sige, at ri-boflavinmolekylet, på trods af de forskellige belysningsbølgelængder, emitterer lys i bølgelængder af samme interval.

Ved analysering af absorbansgrafen, kan det ses, at absorbansen også har et peak. For at bestemme de bølgelængder, som kan bruges til at excitere riboflavin, bliver man nødt til at bestemme, hvor

1

Se bilag 1

0 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,6 0,5 Absorption

0,6

0,7

0,8

0,9

1,2 1

0,2

0,4

0,8

1

0

Relativ emission

Absorbans

Bølgelængde (nm)

Emission 405 nm (relativ)

Emission 500 nm (relativ)

Side 14

Side 14 af 27 stor absorbansen skal være, for at riboflavin kan exciteres. Det kan argumenteres, at så længe ab-sorbansen ikke er 0, kan der exciteres, men jeg vælger her at bestemme, at absorbansen skal være over 0,7 for effektiv excitering af riboflavin. Ifølge mine målinger [2] er absorbansen for riboflavin over 0,7, når bølgelængden er i intervallet mellem 414 nm og 472 nm. Det er altså i dette bølge-længdeinterval at der kan exciteres riboflavin effektivt.

Man kan også udlede den optimale bølgelængde for excitering af riboflavin ved brug absorbansgra-fen. Her er toppunktet på absorbansgrafen den bølgelængde, som er bedst til excitering. Ved brug af vores måleresultater til absorbansgrafen [3] er toppunktet fundet til at være ved belysning med bølge-længden 444 nm.

For de to emissionsgrafer, hvor man kan se, at de begge primært emitterer i bølgelængdeintervallet mellem 500 nm og 600 nm, kan dette sammenlignes med opløsningens farve. Her ses det tydeligt på billede 11, at opløsningen er en klar og lys gul farve. Dette passer perfekt ind i spektret for det syn-lige lys, hvor det er i dette interval, at den lyse gule farve findes.

Den samme analyse kan foretages omvendt, hvor man allerede før forsøgsudførelsen, kunne have gennemskuet, at emissionen primært ville foregå i dette bølgelængdeinterval grundet opløsningens farve.

Hvis man ser på graferne en gang til, kan man for begge emissionsgraferne se, at de har to toppunk-ter. Forklaringen på dette ligger i riboflavins molekyleopbygning, hvor den er opbygget af tre fusio-nerede benzenringe, som det er omtalt i redegørelsen. Det er disse, som giver riboflavin to toppunk-ter, da der ikke blot er et sted, hvorfra fluoresceringen kan forekomme.

Fejlkilder og måleusikkerheder

Under udførslen af forsøget kunne flere ting have forekommet, som kan have påvirket vores måle-data fra de rigtige værdier. Dels kan spektrofotometeret have været kalibreret forkert, hvis f.eks. det demineraliserede vand ikke var rent nok. Det samme gælder for opløsningen, der også kan være blevet påvirket af udefrakommende stoffer, der kan have ændret fluorescensen.

Under selve udførslen af målingerne, kan de kuvetter, som vi målte fluorescens gennem, have haft stoffer fra tidligere brug. En sådan påvirkning ville naturligvis også kunne påvirke fluorescensen.

2

Se bilag 1

3

Se bilag 1

Side 15

Side 15 af 27

Green fluorescent protein

I de seneste årtier har fluorescensen i proteinet GFP (green fluorescent protein) været meget omtalt og har spillet en stor rolle inden for videnskaben, hvor man har været i stand til at bruge proteinet i mange forskningsområder.

GFP i vandmand

Indenfor naturen er der blandt dyrene også brugt fluore-^{Billede 12}

scens. Et eksempel på dette er billede 12, hvor vandman-den Aequorea victoria ses. Denne vandmand har et pro-tein, som kan foretage bioluminescens. Bioluminescens er når et levende dyr producerer lys, og er altså ikke fluo-rescens. Et protein kaldet aequorin tillader vandmanden at udsende blågrønt lys, med bølgelængden 470 nm, ved

en kemisk reaktion med et 𝐶𝑎^{++} atom. Når dette lys er

blevet produceret er det et andet protein i vandmanden, GFP, som absorberer noget af dette lys og emitterer det. GFP's emissionsmaksimum er 508 nm, som er grønt lys, som det ses af billede 12.

Fluorescensen forekommer altså, efter vandmanden har dannet lys ved en kemisk reaktion med pro-teinet aequorin og af dette lys, foretages fluorescensen ved brug af proteinet GFP. Hele denne pro-ces er illustreret på billede 13.

På trods af, at denne vandmand er blevet utrolig populær indenfor fluo-rescens-videnskaben, er årsagen til dens brug af bioluminescens endnu ikke blevet klargjort, da man endnu ikke ved hvilken reel funktion den har for vandmanden. (Pregnolato &

Barbero, 2008/2009)

GFP og den fluorescens i videnskaben

Det tilsyneladende simple og umiddelbart uanvendelig protein GFP fra vandmanden Aequorea vic-toria har i de seneste år haft en stor indvirkning i videnskaben, hvor den har givet os muligheden for at følge og observerer processer, som tidligere ikke kunne undersøges. Dette skyldes proteinets ev-ne til at fluorescere. Proteinet kan nemlig fungere som en markør i organismer, som muliggør det, at Billede 13

Aequorea victoria bioluminescens og fluorescens proces

Aequorea victoria

Side 16

Side 16 af 27 følge specifikke celler. Ved at fastgøre GFP proteinet til f.eks. insulindannende celler i bugspytkirt-len, har det været muligt for forskere at udlede nye behandlingsmuligheder for diabetes.

(MacLachlan, 2011)

GFP havde dog været undervejs i et stykke tid i videnskaben, før det for alvor fik sit gennembrud.

Da videnskabsmanden Osamu Shimomura i 1960'erne opdagede mekanismen bag fluorescensen i Aequorea victoria, og derved proteinet GFP, troede man ikke, at proteinet kunne fluorescerer uden enzymerne fra vandmanden.

Det var først i 1992 at proteinets gen blev identificeret, hvilket gjorde det muligt, at indsætte det i andre organismer. Til manges overraskelse lyste proteinet grønt efter indsættelsen i en bakterie. I den følgende periode blev der gjort store fremskridt inden for GFP og dets fluorescens, hvor man fandt ud af at ændre proteinet, så det kunne absorbere og emittere lys ved andre bølgelængder.

(ScienceInSchool, 2009)

Opdagelsen og arbejdet med GFP bliver i dag brugt indenfor mange af videnskabens genre. Blandt andet er en proces under udvikling, hvor proteinets fluorescens bruges til kræftundersøgelser, ved indsættelse af proteinet på virus i kroppen. Hernæst finder denne virus frem til små kræfttumorer.

Ved at belyse virussen, vil det tilknyttede GFP fluorescere og lyse op. Derved skabes en kædereak-tion, som gør det muligt at identificere tumorerne, mens de stadig er for små til at blive fundet ved konventionelle scanninger.

Denne proces kaldes "virimaging" og blev udviklet i 2010. Forskerne bag projektet tror, at denne proces, med det fluorescerende protein GFP, vil revolutionere måden, hvorpå man diagnosticerer kræft i fremtiden. (ScienceDaily, 2010)

Eksemplet med virimaging er blot en proces, hvor det fluorescerende protein GFP bliver udnyttet inden for videnskaben. Dets evne til at fungere som markør på organismer, ved fluorescering, er blevet meget udbredt og bliver i dag brugt inden for rigtig mange forskellige grene af naturviden-skaben. Der er sågar udført eksperimenter, hvor hele organer bliver mærket med GFP, hvorved det vil lyse op, når det bliver belyst med de rigtige bølgelængder. Det samme er blevet gjort med mus, hvilket har hjulpet forskere med forskning i kræft.

GFP har altså gennem de sidste år haft en enorm betydning for mange forskellige videnskabsgrene og med udgangspunkt i proteinet har det været muligt at finde andre lignende fluorescerende stof-fer, som man også har kunnet udforske og udnytte.

Side 17

Side 17 af 27

Konklusion

I denne opgave er der blevet redegjort for, hvordan emission og absorption fungerer og hvilket funktion de spiller i fluorescens. Dette er gjort med udgangspunkt i Bohrs postulater. Emissions- og absorptionsspektrene er også blevet forklaret med udgangspunkt i emissionen og absorptionen af atomet hydrogen. Herunder er der også blevet redegjort for det kontinuerte spektrum.

Selve fluorescensfænomenet for molekyler er blevet redegjort for med afsæt i riboflavin molekylet.

Herunder er Jabolski diagrammet blevet forklaret og der er kort forklaret, hvordan molekylets op-bygning påvirker dets absorption og emission sammen med pH og temperatur.

Det optiske gitter, dets funktion og teorien bag er blevet forklaret med grundlag i laserlys. For ud-ledning af gitterligningen, er det blevet set mikroskopisk på det optiske gitter, hvorved der er blevet argumenteret for at gitterligningen ser ud, som den gør.

Af riboflavinforsøget, er der blevet analyseret frem til, at riboflavin, i en pH-opløsning på 7 ved stuetemperatur, primært emitterer fotoner i bølgelængdeintervallet 500 nm til 600 nm. Dette interval passer med riboflavins farve, hvilket bekræfter resultaterne.

For absorptionen er det blevet analyseret, at effektiv excitering af vores riboflavinopløsning forgår ved en belysning af bølgelængdeintervallet 414 nm og 472 nm. Derudover er der af måledataene for absorbansen og blevet analyseret frem til, at vores opløsning af riboflavin exciteres optimalt ved belysning af bølgelængden 444 nm. På baggrund af redegørelsen af fluorescensfænomenet for ri-boflavin, er det også blevet udledt, at det er riboflavins fusionerede benzenringe, som giver den sine fluorescerende egenskaber.

Fluorescensfænomenet indenfor naturen er blevet gennemgået. Herunder specifikt for det fluoresce-rende protein GFP, som blev fundet i en vandmand. Fluoresceringsprocessen som GFP foretager er også blevet redegjort for.

Det fluorescerende protein GFP bliver også brugt intensivt indenfor videnskaben, hvor dets evne til at fungere som markør på organismer bliver anvendt ved utallige videnskabelige forsøg. Der er ble-vet redegjort for en af disse forsøg, hvor proteinets fluorescens bliver brugt til at finde frem til kræfttumorer i en proces kaldet "virimaging".

Det er altså blevet konkluderet, at fluorescens er en meget vigtig proces, som er brugt vidt omkring i videnskaben og i naturen.

Side 18

Side 18 af 27

Bibliografi

Elvekjær, F., & Benoni, T. (2006). FysikABbogen2. Århus: Systime.

Elvekjær, F., & Benoni, T. (2008). FysikABbogen1. Århus: Systime.

Fox, M. A. (u.d.). Photochemistry. Hentede 5. Februar 2015 fra Access Science:

http://portal.fynbib.dk:2124/content/photochemistry/509100

MacLachlan, A. (27. Oktober 2011). How a Jellyfish Protein Transformed Science. Hentede 6. Februar 2015

fra LiveScience: http://www.livescience.com/16752-gfp-protein-fluorescent-nih-nigms.html

Pregnolato, A., & Barbero, A. (2008/2009). Aequorea victoria jellyfish. Hentede 5. Februar 2015 fra
Lem.ch.unito.it: http://lem.ch.unito.it/didattica/infochimica/2008_GFP/estrazione.html

ScienceDaily. (6. November 2010). Luminous cells from jellyfish could diagnose cancers deep within human body. Hentede 6. Februar 2015 fra ScienceDaily:

http://www.sciencedaily.com/releases/2010/11/3906.htm

ScienceInSchool. (17. August 2009). Painting life green: GFP. Hentede 6. Februar 2015 fra Scienceinschool:

http://www.scienceinschool.org/2009/issue12/gfp

Vestergaard, E. (u.d.). MatematikFysik. Hentede 5. Februar 2015 fra MatematikFysik:

http://www.matematikfysik.dk/

Wong, D. (u.d.). Electronic Spectroscopy: Theory. Hentede 6. Februar 2015 fra Chemwiki:

http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Electronic_Spectroscopy/Electronic

_Spectroscopy%3A_Theory#Variables_that_affect_Fluorescence

Billede 1, 2:

Elvekjær, F., & Benoni, T. (2006). FysikABbogen2, S. 67. Århus: Systime.

Billede 3, 4, 5:

Elvekjær, F., & Benoni, T. (2006). FysikABbogen2, S. 74. Århus: Systime.

Billede 6:

Smith, Z., & Roman, C. (u.d.). Fluorescence. Hentede 5. Februar 2015 fra Chemwiki:

http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Electronic_Spectroscopy/Fluoresce

nce

Billede 7, 8, 9, 10:

Vestergaard, E. (u.d.). MatematikFysik. Hentede 5. Februar 2015 fra MatematikFysik:

http://www.matematikfysik.dk/

Billede 11:

Taget i laboratoriet under udførelse

Side 19

Side 19 af 27

Billede 12:

Pregnolato, A., & Barbero, A. (2008/2009). Aequorea victoria jellyfish. Hentede 5. Februar 2015 fra
Lem.ch.unito.it: http://lem.ch.unito.it/didattica/infochimica/2008_GFP/estrazione.html

Billede 13:

Jonda, S. (28. November 1996). The in vivo role of GFP. Hentede 5. Februar 2015 fra Principles of

protein structure: http://www.cryst.bbk.ac.uk/PPS2/projects/jonda/intro.htm

Side 20

Side 20 af 27

Bilag 1

Bølgelængde | Absorption | F 405 (relativ) | F 500 (relativ) | 417,8 | 0,6 | 0, | 0,9
380,6 | 0, | 0,5 | 0,1 | 418,7 | 0,1 | 0,7 | 0,8
381,5 | 0,8 | 0, | 0,2 | 419,6 | 0,4 | 0,8 | 0,6
382,3 | 0,1 | 0,7 | 0,5 | 420,4 | 0,6 | 0, | 0,2
383,2 | 0,3 | 0, | 0,4 | 421,3 | 0,3 | 0,5 | 0,6
384,1 | 0,5 | 0,4 | 0,9 | 422,2 | 0,7 | 0, | 0,7
385 | 0,4 | 0,5 | 0, | 423,1 | 0,7 | 0,4 | 0,9
385,9 | 0,7 | 0,4 | 0,1 | 424 | 0,8 | 0,2 | 0,7
386,8 | 0,7 | 0,1 | 0,7 | 424,9 | 0,4 | 0,4 | 0,1
387,7 | 0,2 | 0,6 | 0,7 | 425,8 | 0,5 | 0,1 | 0,3
388,5 | 0,9 | 0,8 | 0,5 | 426,6 | 0,7 | 0,6 | 0,4
389,4 | 0,7 | 0, | 0, | 427,5 | 0,2 | 0,3 | 0,
390,3 | 0,2 | 0,8 | 0,6 | 428,4 | 0,4 | 0,4 | 0,5
391,2 | 0, | 0,8 | 0,7 | 429,3 | 0,3 | 0,7 | 0,6
392,1 | 0,6 | 0,4 | 0,3 | 430,2 | 0,7 | 0,1 | 0,2
393 | 0,4 | 0, | 0,2 | 431,1 | 0,7 | 0,2 | 0,5
393,9 | 0,7 | 0,8 | 0,3 | 432 | 0,6 | 0,6 | 0,5
394,7 | 0,6 | 0,8 | 0,8 | 432,8 | 0,8 | 0,4 | 0,3
395,6 | 0,5 | 0,1 | 0,9 | 433,7 | 0,3 | 0,6 | 0,2
396,5 | 0,4 | 0,1 | 0,1 | 434,6 | 0,6 | 0,6 | 0,
397,4 | 0,5 | 0,5 | 0,7 | 435,5 | 0,5 | 0,4 | 0,
398,3 | 0,4 | 0,2 | 0,3 | 436,4 | 0,4 | 0,2 | 0,2
399,2 | 0, | 0,8 | 0,3 | 437,3 | 0,7 | 0,3 | 0,7
400,1 | 0,5 | 0,2 | 0, | 438,2 | 0, | 0,2 | 0,
400,9 | 0,8 | 0,1 | 0,8 | 439 | 0,1 | 0,1 | 0,9
401,8 | 0,6 | 0,7 | 0,9 | 439,9 | 0,6 | 0,6 | 0,5
402,7 | 0,9 | 0,7 | 0,7 | 440,8 | 0,4 | 0,4 | 0,9
403,6 | 0, | 0,7 | 0,8 | 441,7 | 0,3 | 0,9 | 0,9
404,5 | 0,1 | 0,4 | 0,5 | 442,6 | 0,9 | 0,1 | 0,9
405,4 | 0,2 | 0,5 | 0,7 | 443,5 | 0,8 | 0,9 | 0,
406,3 | 0,1 | 0,2 | 0,4 | 444,4 | 0,2 | 0,7 | 0,9
407,2 | 0,7 | 0,8 | 0,1 | 445,2 | 0,5 | 0, | 0,3
408 | 0,3 | 0,7 | 0,8 | 446,1 | 0,1 | 0,1 | 0,8
408,9 | 0,1 | 0,1 | 0,7 | 447 | 0,3 | 0,4 | 0,
409,8 | 0,3 | 0, | 0,2 | 447,9 | 0,3 | 0,4 | 0,3
410,7 | 0,7 | 0,9 | 0,4 | 448,8 | 0,8 | 0,6 | 0,3
411,6 | 0,7 | 0,9 | 0,9 | 449,7 | 0,2 | 0,4 | 0,6
412,5 | 0,8 | 0,4 | 0,3 | 450,6 | 0,5 | 0,5 | 0,9
413,4 | 0,4 | 0,3 | 0,7 | 451,5 | 0,3 | 0,5 | 0,8
414,2 | 0,9 | 0,9 | 0,9 | 452,3 | 0,6 | 0,3 | 0,7
415,1 | 0,9 | 0,1 | 0,6 | 453,2 | 0,3 | 0,2 | 0,9
416 | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 454,1 | 0,8 | 0,5 | 0,5
416,9 | 0,7 | 0,1 | 0,3 | 455 | 0,1 | 0, | 0,3

Side 21

Side 21 af 27

455,9 | 0,7 | 0,6 | 0,2 | 494,9 | 0,3 | 0,6 | 0,9
456,8 | 0,3 | 0,7 | 0,8 | 495,8 | 0, | 0,6 | 0,
457,7 | 0,7 | 0,7 | 0,5 | 496,6 | 0,1 | 0,2 | 0,1
458,5 | 0,6 | 0,8 | 0,1 | 497,5 | 0,4 | 0,3 | 0,3
459,4 | 0,8 | 0,4 | 0,8 | 498,4 | 0,9 | 0,7 | 0,6
460,3 | 0,4 | 0,3 | 0,9 | 499,3 | 0,4 | 0,5 | 0,7
461,2 | 0,3 | 0,5 | 0,8 | 500,2 | 0,6 | 0,8 | 0,8
462,1 | 0,3 | 0,1 | 0,6 | 501,1 | 0,5 | 0,7 | 0,7
463 | 0,5 | 0,5 | 0,8 | 502 | 0,4 | 0,4 | 0,9
463,9 | 0,1 | 0,9 | 0, | 502,8 | 0,8 | 0,8 | 0,9
464,7 | 0,3 | 0,6 | 0,8 | 503,7 | 0,9 | 0,9 | 0,4
465,6 | 0,4 | 0,1 | 0, | 504,6 | 0,2 | 0,8 | 0,9
466,5 | 0, | 0,3 | 0,5 | 505,5 | 0,6 | 0,7 | 0,
467,4 | 0,2 | 0,1 | 0, | 506,4 | 0, | 0,3 | 0,4
468,3 | 0,3 | 0,5 | 0,2 | 507,3 | 0,9 | 0,1 | 0,3
469,2 | 0,8 | 0,7 | 0,1 | 508,2 | 0, | 0,5 | 0,8
470,1 | 0,7 | 0,9 | 0,6 | 509 | 0,6 | 0,4 | 0,1
470,9 | 0, | 0,2 | 0,7 | 509,9 | 0,8 | 0, | 0,2
471,8 | 0,1 | 0,2 | 0,8 | 510,8 | 0,2 | 0, | 0,4
472,7 | 0,6 | 0,5 | 0,4 | 511,7 | 0, | 0, | 0,1
473,6 | 0,7 | 0,3 | 0, | 512,6 | 0,063457 | 0,4 | 0,4
474,5 | 0,6 | 0,6 | 0, | 513,4 | 0,2 | 0,1 | 0,
475,4 | 0, | 0,9 | 0, | 514,2 | 0,8 | 0,7 | 0,4
476,3 | 0,3 | 0,4 | 0,3 | 515 | 0,2 | 0,1 | 0,6
477,1 | 0,8 | 0,0470646 | 0,8 | 515,9 | 0,7 | 0,1 | 0,5
478 | 0,5 | 0, | 0,3 | 516,7 | 0,2 | 0,9 | 0,4
478,9 | 0,9 | 0,9 | 0,1 | 517,5 | 0,7 | 0,1 | 0,
479,8 | 0, | 0,9 | 0,4 | 518,3 | 0,2 | 0,8278177 | 0,6
480,7 | 0, | 0,4 | 0,9 | 519,2 | 0,4 | 0,5 | 0,4
481,6 | 0,6 | 0,9 | 0,4 | 520 | 0,2 | 0,8 | 0,7
482,5 | 0,1 | 0,5 | 0,4 | 520,8 | 0,9 | 0,2 | 0,1
483,3 | 0,2 | 0,8 | 0,7 | 521,6 | 0,3 | 0,6 | 0,2
484,2 | 0,7 | 0,5 | 0,5 | 522,5 | 0,2 | 0,3 | 0,8
485,1 | 0,4 | 0,7 | 0,4 | 523,3 | 0,3 | 0,4 | 0,5
486 | 0,6 | 0, | 0,7 | 524,1 | 0,2 | 0, | 0,9
486,9 | 0,9 | 0,1 | 0,5 | 525 | 0,1 | 0,8 | 0,2
487,8 | 0,1 | 0,2 | 0,7 | 525,8 | 0,7 | 0,3 | 0,8
488,7 | 0,8 | 0,4 | 0, | 526,6 | 0,3 | 0,1 | 0,7
489,5 | 0, | 0,2 | 0,5 | 527,4 | 0,7 | 0,9 | 0,3
490,4 | 0,2 | 0,6 | 0,6 | 528,3 | 0,7 | 0,9 | 0,6
491,3 | 0,9 | 0,7 | 0,3 | 529,1 | 0,4 | 0,2 | 0,9
492,2 | 0,5 | 0, | 0,8 | 529,9 | 0,3 | 0,5 | 0,1
493,1 | 0,3 | 0,2 | 0,2 | 530,7 | 0,6 | 0,1 | 0,2
494 | 0,9 | 0,1 | 0,2 | 531,6 | 0,7 | 0,6 | 0,2

Side 22

Side 22 af 27

532,4 | 0,2 | 0,3 | 0,5 | 568,7 | 0,7 | 0,6 | 0,4
533,2 | 0, | 0, | 0,6 | 569,6 | 0,5 | 0, | 0,
534 | 0,1 | 0,8 | 0,6 | 570,4 | 0,3 | 0,6 | 0,2
534,9 | 0,7 | 0,6 | 0,2 | 571,2 | 0,1 | 0,7 | 0,9
535,7 | 0,6 | 0,4 | 0,6 | 572 | 0,8 | 0,7 | 0,6
536,5 | 0,9 | 0,4 | 0,5 | 572,9 | 0,5 | 0, | 0,
537,3 | 0,3 | 0, | 0,8 | 573,7 | 0, | 0,3 | 0,3
538,2 | 0,9 | 0,5 | 0,5 | 574,5 | 0,8 | 0,1 | 0,1
539 | 0,8 | 0,4 | 0,5 | 575,3 | 0,5 | 0,5 | 0,7
539,8 | 0,3 | 0,5 | 0,3 | 576,2 | 0,5 | 0,1 | 0,1
540,6 | 0,8 | 0,1 | 0, | 577 | 0,1 | 0,6 | 0,9
541,5 | 0,2 | 0,8 | 0,7 | 577,8 | 0,8 | 0,4 | 0,1
542,3 | 0,4 | 0,3 | 0,3 | 578,6 | 0,4 | 0,4 | 0,8
543,1 | 0,9 | 0,2 | 0,2 | 579,5 | 0,8 | 0,8 | 0,7
544 | 0,2 | 0,1 | 0,2 | 580,3 | 0, | 0,6 | 0,6
544,8 | 0,1 | 0,8 | 0,4 | 581,1 | 0,7 | 0,1 | 0,9
545,6 | 0,7 | 0,2 | 0,9 | 581,9 | 0,9 | 0,9 | 0,6
546,4 | 0,5 | 0,1 | 0,5 | 582,8 | 0,7 | 0,7 | 0,8
547,3 | 0,6 | 0,1 | 0,1 | 583,6 | 0,4 | 0,1 | 0,4
548,1 | 0,7 | 0,7 | 0, | 584,4 | 0,8 | 0,2 | 0,7
548,9 | 0,9 | 0,4 | 0,6 | 585,3 | 0,5 | 0,7 | 0,4
549,7 | 0,6 | 0,7 | 0, | 586,1 | 0,8 | 0,4 | 0,5
550,6 | 0,6 | 0,5 | 0, | 586,9 | 0,6 | 0,3 | 0,2
551,4 | 0,2 | 0, | 0, | 587,7 | 0,5 | 0,7 | 0,4
552,2 | 0,9 | 0,9 | 0,2 | 588,5 | 0,3 | 0,3696943 | 0,8
553 | 0,8 | 0,2 | 0,2 | 589,2 | 0,1 | 0,2 | 0,7
553,9 | 0,1 | 0,9 | 0, | 590 | 0,2 | 0,2 | 0,1
554,7 | 0,9 | 0,6 | 0,7 | 590,7 | 0,2 | 0, | 0,1
555,5 | 0,6 | 0,5 | 0,3 | 591,4 | 0,7 | 0,1 | 0,3
556,3 | 0,4 | 0,9 | 0,4 | 592,2 | 0,7 | 0,4 | 0,9
557,2 | 0,1 | 0,6 | 0,2 | 592,9 | 0,5 | 0,2 | 0,5
558 | 0,7 | 0,6 | 0,6 | 593,6 | 0,2 | 0,8 | 0,5
558,8 | 0,6 | 0,2 | 0,1 | 594,4 | 0,1 | 0,7 | 0,7
559,6 | 0,5 | 0,2 | 0,3 | 595,1 | 0,4 | 0,4 | 0,9
560,5 | 0,2 | 0,7 | 0,2 | 595,8 | 0,7 | 0,1 | 0,
561,3 | 0,4 | 0,5 | 0,3 | 596,6 | 0, | 0,2 | 0,9
562,1 | 0,5 | 0,1 | 0,1 | 597,3 | 0,6 | 0,4 | 0,6
562,9 | 0,9 | 0,5 | 0,7 | 598 | 0,8 | 0,9 | 0,8
563,8 | 0,4 | 0,8 | 0,1 | 598,8 | 0, | 0,3 | 0,9
564,6 | 0,3 | 0,2 | 0,1 | 599,5 | 0, | 0,9 | 0,6
565,4 | 0,8 | 0,8 | 0,3 | 600,2 | 0,005446 | 0,5 | 0,9
566,3 | 0,2 | 0,2 | 0,7 | 601 | 0,2 | 0,7 | 0,8
567,1 | 0,3 | 0,3 | 0,7 | 601,7 | 0,2 | 0,1 | 0,1
567,9 | 0,6 | 0,4 | 0,9 | 602,4 | 0,5 | 0,3 | 0,6

Side 23

Side 23 af 27

603,2 | 0,1 | 0,6 | 0,1 | 635,4 | 0,5 | 0,5 | 0,9
603,9 | 0,2 | 0,7 | 0,5 | 636,2 | 0, | 0,7 | 0,2
604,6 | 0,8 | 0, | 0,6 | 636,9 | 0,9 | 0,3 | 0,3
605,4 | 0,1 | 0, | 0,3 | 637,6 | 0,9 | 0,6 | 0,8
606,1 | 0,8 | 0,3 | 0,4 | 638,4 | 0,4 | 0,6 | 0,8
606,8 | 0,4 | 0,4 | 0,1 | 639,1 | 0,3 | 0,5 | 0,5
607,6 | 0,5 | 0,4 | 0,2 | 639,8 | 0,0039038 | 0, | 0,4
608,3 | 0,6 | 0,1 | 0,6 | 640,6 | 0,5 | 0,7 | 0,
609 | 0,9 | 0,2 | 0,2 | 641,3 | 0,7 | 0,7 | 0,8
609,8 | 0,5 | 0,4 | 0,8 | 642,1 | 0,6 | 0,8 | 0,1
610,5 | 0,6 | 0,2 | 0,2 | 642,8 | 0,3 | 0,8 | 0,6
611,2 | 0,5 | 0,7 | 0,3 | 643,5 | 0,1 | 0,5 | 0,3
612 | 0,6 | 0,2 | 0, | 644,3 | 0,5 | 0,9 | 0,3
612,7 | 0,3 | 0,2 | 0,9 | 645 | 0,7 | 0,5 | 0,7
613,4 | 0,3 | 0,2 | 0,6 | 645,7 | 0,4 | 0,4 | 0,8
614,2 | 0,3 | 0, | 0,2 | 646,5 | 0,3 | 0,2 | 0,2
614,9 | 0,5 | 0,8 | 0,5 | 647,2 | 0,4 | 0,1 | 0,2
615,6 | 0,8 | 0,7 | 0, | 647,9 | 0,2 | 0,3 | 0,6
616,4 | 0,4 | 0,6 | 0,8 | 648,7 | 0,9 | 0,3 | 0,3
617,1 | 0,8 | 0, | 0,4 | 649,4 | 0,2 | 0,8 | 0,6
617,8 | 0,2 | 0,1 | 0,4 | 650,1 | 0,5 | 0,7 | 0,2
618,6 | 0,6 | 0,9 | 0,9 | 650,9 | 0,9 | 0,3 | 0,2
619,3 | 0, | 0,1 | 0, | 651,6 | 0,9 | 0,1 | 0,7
620 | 0,9 | 0,9 | 0,4 | 652,3 | 0,7 | 0,8 | 0,
620,8 | 0,6 | 0,1 | 0,2 | 653,1 | 0, | 0,4 | 0,4
621,5 | 0,9 | 0,5 | 0, | 653,8 | 0,1 | 0,2 | 0,8
622,2 | 0,1 | 0,9 | 0,4 | 654,5 | 0,6 | 0,9 | 0,6
623 | 0,9 | 0,1186779 | 0,7 | 655,3 | 0,5 | 0,4 | 0,3
623,7 | 0,6 | 0,5 | 0, | 656 | 0,0093651 | 0,3 | 0,4
624,4 | 0,7 | 0,6 | 0,8 | 656,7 | 0,4 | 0,2 | 0,5
625,2 | 0,8 | 0,1 | 0,7 | 657,5 | 0,5 | 0,7 | 0,4
625,9 | 0,4 | 0,1 | 0,9 | 658,2 | 0,2 | 0,3 | 0,1
626,6 | 0,4 | 0,4 | 0,3 | 658,9 | 0,2 | 0,7 | 0,0304195
627,4 | 0, | 0,4 | 0,7 | 659,7 | 0,8 | 0,7 | 0,6
628,1 | 0,8 | 0, | 0, | 660,4 | 0,8 | 0,8 | 0,7
628,8 | 0,5 | 0,5 | 0,9 | 661,1 | 0,6 | 0,1 | 0,1
629,6 | 0,4 | 0,9 | 0,6 | 661,9 | 0,6 | 0,3 | 0,2
630,3 | 0,2 | 0,9 | 0,7 | 662,6 | 0, | 0,9 | 0,
631 | 0,3 | 0,6 | 0,4 | 663,3 | 0,1 | 0,9 | 0,8
631,8 | 0,4 | 0,7 | 0,5 | 664,1 | 0,3 | 0,3 | 0,3
632,5 | 0,2 | 0,8 | 0,3 | 664,8 | 0,5 | 0,3 | 0,5
633,2 | 0,3 | 0,4 | 0,8 | 665,5 | 0,9 | 0,2 | 0,6
634 | 0,8 | 0, | 0,2 | 666,3 | 0,3 | 0,5 | 0,2
634,7 | 0,9 | 0,8 | 0,1 | 667 | 0,5 | 0,2 | 0,9

Side 24

Side 24 af 27

667,8 | 0,1 | 0,6 | 0,7 | 700,4 | 0,6 | 0,7 | 0,5
668,5 | 0,2 | 0,7 | 0,6 | 701,2 | 0,2 | 0,7 | 0,1
669,2 | 0,2 | 0,1 | 0,3 | 701,9 | 0,8 | 0,4 | 0,9
670 | 0,5 | 0,8 | 0,9 | 702,7 | 0,3 | 0,6 | 0,
670,7 | 0,6 | 0,7 | 0,3 | 703,4 | 0,2 | 0,8 | 0,4
671,5 | 0,1 | 0,4 | 0, | 704,1 | 0,1 | 0,3 | 0,2
672,2 | 0,3 | 0,5 | 0,8 | 704,9 | 0,7 | 0,6 | 0,7
672,9 | 0,9 | 0,8 | 0,3 | 705,6 | 0,8 | 0,1 | 0,2
673,7 | 0,2 | 0, | 0,5 | 706,4 | 0,8 | 0,4 | 0,4
674,4 | 0,9 | 0, | 0, | 707,1 | 0,5 | 0,7 | 0,4
675,2 | 0,4 | 0,9 | 0,4 | 707,9 | 0,8 | 0,6 | 0,4
675,9 | 0,4 | 0,4 | 0,2 | 708,6 | 0,4 | 0, | 0,3
676,7 | 0,4 | 0,6 | 0,9 | 709,4 | 0,6 | 0,3 | 0,
677,4 | 0,5 | 0,8 | 0,4 | 710,1 | 0,1 | 0,1 | 0,
678,1 | 0,4 | 0,7 | 0,7 | 710,9 | 0,3 | 0,9 | 0,2
678,9 | 0, | 0,1 | 0, | 711,7 | 0,9 | 0,3 | 0,3
679,6 | 0, | 0,2 | 0,9 | 712,4 | 0,9 | 0,9 | 0,2
680,4 | 0,4 | 0,2 | 0,2 | 713,2 | 0,8 | 0,8 | 0,6
681,1 | 0,1 | 0,5 | 0,2 | 713,9 | 0,6 | 0,5 | 0,1
681,9 | 0,8 | 0,9 | 0,5 | 714,7 | 0,7 | 0,8 | 0,9
682,6 | 0,5 | 0,6 | 0,8 | 715,4 | 0,1 | 0,6 | 0,2
683,3 | 0,7 | 0,2 | 0,9 | 716,2 | 0,5 | 0,2 | 0,4
684,1 | 0,6 | 0,1 | 0,5 | 716,9 | 0,1 | 0,5 | 0,3
684,8 | 0,2 | 0,1 | 0,5 | 717,7 | 0,8 | 0,1 | 0,9
685,6 | 0, | 0,6 | 0,2 | 718,5 | 0, | 0,2 | 0,6
686,3 | 0, | 0,2 | 0, | 719,2 | 0,2 | 0, | 0,9
687,1 | 0,2 | 0,6 | 0,7 | 720 | 0,6 | 0,9 | 0,8
687,8 | 0,1 | 0,1 | 0,9 | 720,7 | 0, | 0,7 | 0,5
688,5 | 0,3 | 0,7 | 0,7 | 721,5 | 0,2 | 0,2 | 0,
689,3 | 0, | 0,2 | 0,1 | 722,2 | 0, | 0,6 | 0,
690 | 0,1 | 0,6 | 0,1 | 723 | 0,7 | 0,1 | 0,
690,8 | 0,9 | 0,8 | 0,5 | 723,7 | 0,7 | 0,6 | 0,4
691,5 | 0, | 0, | 0,6 | 724,5 | 0,9 | 0,8 | 0,6
692,3 | 0,1 | 0,8 | 0,4 | 725,3 | 0,1 | 0,4 | 0,9
693 | 0,4 | 0,2 | 0,1 | 726 | 0,5 | 0,4 | 0,5
693,7 | 0,7 | 0,7 | 0,1 | 726,8 | 0,4 | 0,5 | 0,1
694,5 | 0,7 | 0,8 | 0,8 | 727,5 | 0,4 | 0,2 | 0,9
695,2 | 0,5 | 0,5 | 0,2 | 728,3 | 0,6 | 0,6 | 0,2
696 | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 729 | 0,4 | 0,5 | 0,6
696,7 | 0,6 | 0,6 | 0,1 | 729,8 | 0,1 | 0,7 | 0,2
697,5 | 0,3 | 0,5 | 0,6 | 730,5 | 0, | 0,3 | 0,3
698,2 | 0,9 | 0,7 | 0,1 | 731,3 | 0, | 0,6 | 0,6
698,9 | 0,5 | 0,2 | 0,6 | 732 | 0,2 | 0,9 | 0,1
699,7 | 0,3 | 0,2 | 0,2 | 732,8 | 0,2 | 0,3 | 0,1

Side 25

Side 25 af 27

733,6 | 0, | 0,8 | 0,1 | 766,8 | 0, | 0, | 0,7
734,3 | 0,5 | 0, | 0,7 | 767,5 | 0,8 | 0,9 | 0,3
735,1 | 0,2 | 0,3 | 0,7 | 768,3 | 0,7 | 0,1 | 0,5
735,8 | 0,3 | 0,8 | 0,6 | 769,1 | 0,2 | 0, | 0,5
736,6 | 0, | 0,1 | 0,4 | 769,8 | 0,7 | 0,9 | 0,1
737,3 | 0,4 | 0,1 | 0,6 | 770,6 | 0,3 | 0, | 0,8
738,1 | 0,2 | 0,1 | 0,2 | 771,3 | 0,4 | 0,1 | 0,8
738,8 | 0,8 | 0,8 | 0, | 772,1 | 0,4 | 0,4 | 0,9
739,6 | 0,8 | 0,3 | 0,7 | 772,8 | 0,5 | 0, | 0,2
740,4 | 0,6 | 0,8 | 0,7 | 773,6 | 0,5 | 0,8 | 0,7
741,1 | 0,3 | 0,2 | 0,2 | 774,3 | 0,7 | 0,8 | 0,6
741,9 | 0,1 | 0,4 | 0,2 | 775,1 | 0,5 | 0,3 | 0,7
742,6 | 0,3 | 0,9 | 0,6 | 775,9 | 0,2 | 0,6 | 0,1
743,4 | 0,8 | 0,1 | 0,2 | 776,6 | 0,4 | 0,6 | 0,2
744,1 | 0,4 | 0,5 | 0,1 | 777,4 | 0, | 0,7 | 0,6
744,9 | 0,6 | 0,5 | 0,5 | 778,1 | 0,8 | 0,7 | 0,
745,6 | 0, | 0,1 | 0,4 | 778,9 | 0,7 | 0,8 | 0,6
746,4 | 0,8 | 0, | 0,7 | 779,6 | 0,1 | 0, | 0,
747,2 | 0,2 | 0,2 | 0, | 780,4 | 0,0159345 | 0,9 | 0,6
747,9 | 0,1 | 0,7 | 0,9 | 781,1 | 0,9 | 0,4 | 0,1
748,7 | 0,8 | 0,2 | 0,5 | 781,9 | 0, | 0,7 | 0,4
749,4 | 0,6 | 0,3 | 0, | 782,6 | 0,6 | 0,7 | 0,6
750,2 | 0,5 | 0,8 | 0,7 | 783,4 | 0,7 | 0,9 | 0,
750,9 | 0,1 | 0,7 | 0,2 | 784,2 | 0,8 | 0,2 | 0,8
751,7 | 0,2 | 0,2 | 0,9 | 784,9 | 0,2 | 0,6 | 0,3
752,4 | 0,4 | 0,9 | 0,3 | 785,7 | 0,3 | 0,5 | 0,4
753,2 | 0,3 | 0,2 | 0,2 | 786,4 | 0, | 0,9 | 0,1
754 | 0,3 | 0,1 | 0,8 | 787,2 | 0,2 | 0,8 | 0,7
754,7 | 0,9 | 0,6 | 0,9 | 787,9 | 0,1 | 0,8 | 0,7
755,5 | 0,2 | 0, | 0,4 | 788,7 | 0,9 | 0,2 | 0,6
756,2 | 0,8 | 0, | 0,3 | 789,4 | 0,9 | 0,6 | 0,9
757 | 0,1 | 0, | 0,2 | 790,2 | 0,9 | 0,1 | 0,2
757,7 | 0,8 | 0,7 | 0,6 | 791 | 0,5 | 0,4 | 0,2
758,5 | 0,3 | 0,9 | 0,1 | 791,7 | 0,5 | 0, | 0,4
759,2 | 0,3 | 0,4 | 0,9 | 792,5 | 0,4 | 0,0221745 | 0,9
760 | 0,1 | 0,7 | 0,2 | 793,2 | 0,7 | 0,8 | 0,3
760,7 | 0,2 | 0,2 | 0,4 | 794 | 0,5 | 0,6 | 0,
761,5 | 0,3 | 0,3 | 0,4 | 794,7 | 0,2 | 0,3 | 0,4
762,3 | 0,9 | 0,1 | 0,6 | 795,5 | 0, | 0,2 | 0,8
763 | 0,4 | 0,3 | 0,8 | 796,2 | 0,6 | 0,1 | 0,6
763,8 | 0,5 | 0,1 | 0,4 | 797 | 0,6 | 0,6 | 0,5
764,5 | 0,6 | 0,2 | 0,2 | 797,8 | 0,1 | 0,4 | 0,1
765,3 | 0,3 | 0,8 | 0,9 | 798,5 | 0,4 | 0,7 | 0,5
766 | 0,7 | 0,8 | 0,1 | 799,3 | 0,6 | 0,3 | 0,6

Side 26

Side 26 af 27

800 | 0,2 | 0, | 0,2 | 833,2 | 0, | 0,8 | 0,7
800,8 | 0,2 | 0,7 | 0,8 | 834 | 0,1 | 0,3 | 0,4
801,5 | 0,8 | 0,7 | 0, | 834,7 | 0,8 | 0,3 | 0,5
802,3 | 0,6 | 0,3 | 0,5 | 835,4 | 0,2 | 0,8 | 0,4
803 | 0,6 | 0,2 | 0,9 | 836,2 | 0,2 | 0,4 | 0,5
803,8 | 0,5 | 0,8 | 0,5 | 836,9 | 0,4 | 0,7 | 0,9
804,5 | 0,4 | 0,5 | 0,7 | 837,7 | 0,6 | 0,2 | 0,5
805,3 | 0, | 0,2 | 0,2 | 838,4 | 0,1 | 0,9 | 0,3
806,1 | 0,1 | 0,4 | 0,2 | 839,1 | 0,3 | 0,2 | 0,4
806,8 | 0, | 0,5 | 0,1 | 839,9 | 0,5 | 0,3 | 0,5
807,6 | 0,9 | 0,1 | 0,1 | 840,6 | 0,7 | 0,7 | 0,7
808,3 | 0,9 | 0,2 | 0,8 | 841,4 | 0,6 | 0,3 | 0,3
809,1 | 0,4 | 0, | 0,6 | 842,1 | 0,4 | 0, | 0,3
809,8 | 0,3 | 0,2 | 0,7 | 842,8 | 0,2 | 0,5 | 0,3
810,6 | 0,2 | 0,2 | 0,4 | 843,6 | 0,9 | 0,2 | 0,1
811,3 | 0,8 | 0,7 | 0,7 | 844,3 | 0,4 | 0,4 | 0,5
812,1 | 0,3 | 0,5 | 0,9 | 845,1 | 0,4 | 0,1 | 0,1
812,9 | 0,9 | 0,3 | 0,4 | 845,8 | 0,9 | 0,8 | 0,4
813,6 | 0,1 | 0,3 | 0,8 | 846,5 | 0,5 | 0, | 0,
814,4 | 0,9 | 0,8 | 0,4 | 847,3 | 0,6 | 0,1 | 0,6
815,1 | 0,4 | 0,3 | 0,9 | 848 | 0,9 | 0,1 | 0,6
815,9 | 0,1 | 0,6 | 0,2 | 848,8 | 0,9 | 0,6 | 0,2
816,6 | 0,1 | 0,9 | 0,3 | 849,5 | 0,8 | 0,4 | 0,
817,4 | 0,5 | 0,7 | 0,3 | 850,2 | 0,3 | 0,1 | 0,2
818,1 | 0,9 | 0,5 | 0,9 | 851 | 0,7 | 0, | 0,9
818,9 | 0,3 | 0,7 | 0,4 | 851,7 | 0,3 | 0,8 | 0,5
819,7 | 0,7 | 0,5 | 0,4 | 852,5 | 0,4 | 0,6 | 0,8
820,4 | 0,8 | 0,7 | 0,3 | 853,2 | 0,1 | 0, | 0,1
821,2 | 0,7 | 0,7 | 0,9 | 853,9 | 0,0165468 | 0,2 | 0,4
821,9 | 0, | 0,3 | 0,2 | 854,7 | 0,3 | 0,9 | 0,7
822,7 | 0,8 | 0, | 0,5 | 855,4 | 0,9 | 0, | 0,8
823,4 | 0,7 | 0,8 | 0,4 | 856,2 | 0,6 | 0,8 | 0,3
824,2 | 0,8 | 0,9 | 0,7 | 856,9 | 0,9 | 0,5 | 0,2
824,9 | 0,7 | 0,9 | 0,5 | 857,6 | 0, | 0,7 | 0,3
825,7 | 0,2 | 0,9 | 0,5 | 858,4 | 0,5 | 0,9 | 0,3
826,4 | 0,5 | 0,9 | 0,2 | 859,1 | 0,1 | 0,7 | 0,3
827,2 | 0,2 | 0,6 | 0,5 | 859,9 | 0,8 | 0,8 | 0,3
828 | 0,9 | 0,2 | 0, | 860,6 | 0,8 | 0,5 | 0,4
828,7 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 861,3 | 0,0181328 | 0,6 | 0,1
829,5 | 0,6 | 0, | 0,9 | 862,1 | 0,7 | 0,8 | 0,
830,2 | 0,9 | 0,5 | 0,4 | 862,8 | 0,9 | 0,7 | 0,5
831 | 0,8 | 0,8 | 0, | 863,6 | 0,6 | 0,6 | 0,3
831,8 | 0,4 | 0,2 | 0,4 | 864,3 | 0,7 | 0,7 | 0,6
832,5 | 0,2 | 0,4 | 0,7 | 865 | 0,7 | 0,6 | 0,7

Side 27

Side 27 af 27

865,8 | 0, | 0,5 | 0,5 | 898,3 | 0,9 | 0,9 | 0,3
866,5 | 0,4 | 0,3 | 0,8 | 899,1 | 0,6 | 0,1 | 0,2
867,3 | 0,6 | 0,8 | 0,8 | 899,8 | 0,1 | 0,7 | 0,2

868 | 0,2 | 0,9 | 0,
868,7 | 0,3 | 0,4 | 0,7
869,5 | 0,4 | 0,1 | 0,1
870,2 | 0,0169314 | 0,5 | 0,5
870,9 | 0,4 | 0,8 | 0,3
871,7 | 0,5 | 0,8 | 0,8
872,4 | 0, | 0,7 | 0,4
873,2 | 0,1 | 0,9 | 0,1
873,9 | 0,7 | 0,2 | 0,9
874,6 | 0, | 0,7 | 0,1
875,4 | 0,2 | 0,6 | 0,5
876,1 | 0,5 | 0,6 | 0,9
876,9 | 0, | 0,3 | 0,5
877,6 | 0, | 0,7 | 0,
878,3 | 0,7 | 0, | 0,4
879,1 | 0,2 | 0, | 0,1
879,8 | 0,3 | 0,9 | 0,2
880,6 | 0,8 | 0,2 | 0,9
881,3 | 0,3 | 0,5 | 0,9
882 | 0,1 | 0, | 0,1
882,8 | 0, | 0,6 | 0,7
883,5 | 0,8 | 0,8 | 0,8
884,3 | 0, | 0,5 | 0,5
885 | 0,2 | 0, | 0,4
885,7 | 0,7 | 0,6 | 0,2
886,5 | 0,6 | 0,4 | 0,8
887,2 | 0,4 | 0,9 | 0,7
888 | 0,3 | 0,6 | 0,1
888,7 | 0,2 | 0,4 | 0,1
889,4 | 0,5 | 0, | 0,4
890,2 | 0,3 | 0,2 | 0,5
890,9 | 0,2 | 0,4 | 0,4
891,7 | 0, | 0,2 | 0,9
892,4 | 0,7 | 0,9 | 0,3
893,1 | 0,2 | 0,9 | 0,2
893,9 | 0,3 | 0,3 | 0,5
894,6 | 0,8 | 0,9 | 0,7
895,4 | 0,6 | 0,7 | 0,9
896,1 | 0,1 | 0,4 | 0,1
896,8 | 0,1 | 0,1 | 0,6
897,6 | 0,8 | 0,3 | 0,4