Et eksempel fra STX 3.g
SRP om enzymkinetik i Matematik A og Biologi A
Brug materialet til at undersøge opbygning, metode og faglige valg.
Lær af eksemplet på 15 minutter
Læs med de tre spørgsmål herunder, og skriv et kort svar på hvert, gerne med et sidetal. Så har du noget konkret at tage med over i din egen opgave.
- 4 min
Find problemformuleringen. Hvilket spørgsmål lover opgaven at svare på, og står svaret i konklusionen?
- 4 min
Find det afsnit, hvor de to fag arbejder sammen. Hvilket resultat fra det ene fag bliver brugt i det andet?
- 4 min
Hvilken metode bruger opgaven i hvert fag, og hvor står det? Skriv metoden ned med dine egne ord.
- 3 min
Din egen opgave: Kan du pege på det sted i din SRP, hvor fagene mødes, og skrive i én sætning, hvad det ene fag giver det andet?
Skal du selv skrive SRP? Metoden står her: SRP i biologi
Om opgaven
Ophavet er ikke dokumenteret for denne post. Katalogoplysninger: STX 3.g, SRP, Biologi A, Matematik A, 44 sider. Brug materialet til at se, hvordan teksten er bygget op, og hvilke faglige valg der er truffet.
Skal du selv skrive en SRP? Læs, hvad censor lægger vægt på, og hvordan du bygger den op: SRP, set med censorblik.
Læs, hvilke metoder biologi giver dig, og hvad du kan skrive en stor opgave om: Biologi i gymnasiet.
Hele opgavens tekst
Se originaldokumentetLæs teksten direkte her på siden. Figurer og den præcise opsætning af tabeller og formler finder du i originaldokumentet.
Gå til en side
Side 1
STUDIERETNINGSPROJEKT 2016/2017
[navn fjernet] GYMNASIUM
2014/15 BI-Ma-Ke3z 14 [navn fjernet]
Fag i StudieRetningsProjektet Vejledere
Matematik A
Biologi A
Område for StudieRetningsProjektet: Enzymkinetik
Hvordan kan aktiviteten af alkalisk phosphatase beskrives?
I særlig relation til alkalisk phosphatase (AP) ønskes en beskrivelse af enzymers opbygning og funktion, og hvordan en enzymkatalyseret proces forløber - omtal herunder hvilke faktorer, der påvirker reaktionshastigheden.
Beskriv begrebet reaktionshastighed og udled Michaelis Menten modellen (MM modellen). Gør endvidere rede for parametrene i ligningen. Inddrag betydningen af substratkoncentrationer.
Udfør et forsøg hvor du undersøger enzymaktivitet. Brug de eksperimentelle resultater til at bestemme parametrene i MM modellen.
På baggrund af ovenstående skal du diskutere betydningen af et muteret ALPL-gen, herunder diagnosticerings- og behandlingsmuligheder.
Opgavens omfang: 15-25 sider.
Side 2
MAJA C. E. ANDERSEN
3Z14
BIOLOGI A, MATEMATIK A
FORSØGSDATO: D.
[navn fjernet] GYMNASIUM D.
ENZYMKINETIK
BESKRIVELSE AF ALKALISK
FOSFATASES AKTIVITET
Side 3
ABSTRACT
This project investigates the kinetic of the enzyme ’alkaline phosphatase’. Through an explanation of the enzyme catalysed process it is displayed that the activity depends on pH, temperature and substrate concentration. The process can be described by ‘Michaelis-Menten kinetics’, which is a mathematical model. In the initial steady state the rate of the enzymatic reaction can be described by the Michaelis-Menten equation. The equation contains the two parameters, v and K. They max M are measures of the enzyme’s activity.
The study analyse the results of a test examining the connection between enzyme activity and sub-strate concentration. The results show that the enzyme activity increases exponentially when the substrate concentration increases. This is in evidence up to a maximum reaction velocity. According
to the results the maximum reaction velocity for alkaline phosphatase is 951,7𝜇M/min. It is also
shown that alkaline phosphatase catalyses a fast transformation from substrate into products.
The project discusses the influence a mutated ALPL-gene can have on the activity of alkaline phos-phatase. A mutated ALPL-gene is typically caused by a missense mutation. It leads to a changed enzyme structure, which impedes the bond between enzyme and substrate. Therefore, the activity of alkaline phosphatase is reduced. A reduction in activity can be the cause of lifelong illnesses.
The determination of v and K and the consequences of a mutated ALPL-gene are able to form max M the basis for the conclusion that the enzyme ’alkaline phosphatase’ has a high and important activ-ity.
Side 4
INDHOLDSFORTEGNELSE
INDLEDNING .................................................................................................................................................................. 2 ENZYMER – ALKALISK PHOSPHATASE ................................................................................................................... 2 ENZYMERS OPBYGNING ....................................................................................................................................................... 4 FORSKELLIGE FAKTORERS PÅVIRKNING PÅ REAKTIONSHASTIGHEDEN ........................................................ 5 INITIALHASTIGHED ....................................................................................................................................................... 6 DIFFERENTIALLIGNINGER .......................................................................................................................................... 7 MICHAELIS-MENTEN-MODELLEN ............................................................................................................................ 8 UDLEDNING AF MM-MODELLEN ....................................................................................................................................... 8 FORSØG: ENZYMKINETIK FOR ENZYMET ’ALKALISK FOSFATASE’ ............................................................... 13 INTENTIONEN MED FORSØGET ...................................................................................................................................... 13 TEORI........................................................................................................................................................................................... 13 FORSØGETS UDFØRELSE ................................................................................................................................................... 14 METODE: SPEKTROFOTOMETRI MED LAMBERT-BEERS LOV ............................................................................ 15 DATA ........................................................................................................................................................................................... 16 DATABEHANDLING ............................................................................................................................................................... 17 DISKUSSION OG VURDERING ........................................................................................................................................... 19 KONKLUSION PÅ FORSØGET ........................................................................................................................................... 21 MUTATION I ALPL-GEN ............................................................................................................................................. 21 DIAGNOSTICERING OG BEHANDLING .......................................................................................................................... 22 FEJLDIAGNOSTICERING ...................................................................................................................................................... 23 BEHANDLING ........................................................................................................................................................................... 24 KONKLUSION ............................................................................................................................................................... 25 LITTERATURLISTE ....................................................................................................................................................... 27 BILAG ............................................................................................................................................................................. 29 BILAG 1: ENZYMERS KLASSIFIKATION .................................................................................................................................... 29 BILAG 2: FAKTORERS PÅVIRKNING ......................................................................................................................................... 29
BILAG 3: K_{M} -VÆRDIER .............................................................................................................................................................. 31BILAG 4: FORSØGSVEJLEDNING TIL ”ENZYMKINETIK FOR ENZYMET ’ALKALISK FOSFATASE’”..................................... 32
Side 5
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
2
INDLEDNING
Vi mennesker har udnyttet enzymers katalyserende funktion længere, end vi har været klar over.
Den græske Dionysos fra det antikke Grækenland fremstillede vin ved gæringsprocesser, hvor gær-cellernes enzymer omdannede druernes sukker til alkohol. Enzymer findes i alle levende organis-mer. De findes i planter, dyr, bakterier – eukaryote celler såvel som prokaryote celler, hvor de kata-lyserer metaboliske processer for opretholdelsen af liv.
Da DNA’ets kodende funktion blev opdaget i 1953 af James Watson og Francis Crick, kom be-vidstgørelsen af enzymers funktion, og denne er i stigende grad blevet udnyttet siden, særligt i indu-strien. Også de forskellige enzymers funktioner i vores humane kroppe er i stigende grad blevet klarlagt. Heriblandt har man fundet ud af, at vores DNA indeholder genet ALPL, som koder for dannelsen af enzymet alkalisk phosphatase. Man har fået klarlagt, at dette enzym katalyserer fra-spaltningen af phosphatgrupper. Enzymet syntetiseres særligt i tarm, galde, nyre, livmoder, lever og knogler, men hvordan beskrives enzymkinetikken for alkalisk phosphatase egentlig? Hvilken be-tydning har dets aktivitet for kroppen? Dette handler følgende opgave om, hvor en undersøgelse af emnet ’enzymkinetik’ tjener til beskrivelse af alkalisk phosphatases aktivitet.
I det følgende vil alkalisk phosphatase blive undersøgt gennem en grundig redegørelse for AP’s samt enzymers generelle opbygning og funktion. Opgaven vil hernæst fokuserer på hvordan aktivi-teten af alkalisk phosphatase matematisk kan beskrives ud fra Michaelis-Menten-modellen, hvilket vil blive illustreret og analyseret i forsøget ”Enzymkinetik for enzymet ’alkalisk phosphatase’”.
Derudover vil opgaven diskutere og vurdere aktivitetens betydning, hvor der til sidst vil blive kon-kluderet på enzymkinetikken af alkalisk phosphatase.
ENZYMER – ALKALISK PHOSPHATASE
For at kunne undersøge enzymkinetik må vi først og fremmest forstå, hvad et enzym er. Ifølge Bio-logiens ABc Biokemi er enzymer defineret således: ”Enzymer er katalysatorer i den levende orga-
1 nisme (biokatalysatorer). En katalysator øger en reaktions hastighed uden selv at blive forbrugt”.
Reaktionerne, som enzymer katalyserer, er metaboliske reaktioner, hvor substrat omdannes til pro-dukt.
1
Larsen, Vagn J., m.fl., Biologiens ABc, Tåstrup: Niche, 2008, s. 33
Side 6
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
3
Alkalisk fosfatase fraspalter fosfatgrupper for substrater som DNA, RNA, proteiner samt små mo-lekyler indeholdende fosfat. Ofte fjernes fosfaten for at undgå selvligering af substratet. Defosfory-leringen har blandt andet betydning for dannelsen af knoglestrukturer, da pyrofosfat hæmmer dan-
nelsen.^{2} Hvordan en enzymkatalyseret proces fører til bl.a. defosforylering kan illustreres ved en3 såkaldt Induced Fit-model:
Figur 1. Induced Fit-model.
Modellen viser ved E + S, hvordan enzymet er ”designet” til at kunne binde et bestemt substrat –
man siger at det passer som nøgle i lås. Substratet bindes i enzymets aktive center. Ofte kræves der her en aktivator i form af divalente positive metalioner, da både enzymets aktive center og substra-tet er negativt ladede. Humant alkalisk fosfatases aktivatorer er fire zinkioner og to magnesiumio-ner.
Enzym-substratkomplekses ses ved ES, hvor vi også kan se, at enzymets struktur har justeret sig efter substratets rummelige struktur. I det næste led er komplekset aktiveret, hvorved substrat om-dannes til produkt. Dette giver enzym-produktkomplekset betegnet med EP, hvor produktet til slut
fraspaltes (E + P). Som det også kan ses på modellen, er enzymet atter klar til at binde et nyt sub-
strat. Enzymerne befinder sig hovedsageligt inde i cellerne.
Enzymer kan klassificeres i seks enzymgrupper alt efter virkemåde: oxidoreduktaser, transferaser, lyaser, isomeraser, ligaser og hydrolaser. Alkalisk fosfatase er en hydrolase, som katalyserer hydro-lyser af fosfatestre. Herved dannes en alkohol samt en fosfatgruppe som produkt, hvilket reaktions-
4 skemaet herunder viser.
Figur 2. Reaktionsskema for AP’s katalyse.
2
https://www.lmfk.dk/artikler/data/artikler/1104/1104_63.pdf
3
Christensen, Ulla, m.fl., Introduktion til enzymkinetik, København: Kemi Forlaget, 2005, s. 4
4
Forsøgsvejledning: Nielsen, Marianne S., m.fl., Enzymkinetik for enzymet ‘alkalisk fosfatase’
Side 7
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
4
Måden, enzymerne øger reaktionshastighederne på, er ved at nedsætte aktiveringsenergien E, som a er den energi der skal til, for at reaktionerne
5 igangsættes. Den nødvendige aktiveringsenergi
skyldes, at de metaboliske reaktioner indebærer, at bindinger brydes og etableres, hvilket er ener-
6 gikrævende. Dette er illustreret på figur 3 hvor vi
kan se, at den katalyseret reaktion ”tilbyder” en ny reaktionsvej.
Substratet indeholder en større mængde energi end produktet, og der afgives derfor også en vis mængde energi til omgivelserne ved omdannel-sen. Denne energiafgivelse ∆G påvirkes ikke af enzymer, hvilken på figur 3 kan ses ved, at den ikke-katalyseret og den katalyseret proces starter og slutter ved samme energiniveau.
ENZYMERS OPBYGNING
For at enzymet passer til substratet, har en-zymet en særlig struktur. Hele enzymkom-plekset kaldet holoenzymet består af en pro-teindel kaldet apoenzymet og såkaldte co-faktorer. Apoenzymets primærstruktur er aminosyrerrækkefølgen bestemt af genet og
bundet sammen af peptidbindinger. Figur 4^{7}viser strukturen af alkalisk fosfatase for hu-mant tarmepitel, hvor strukturens henholds-vis røde og blå del er to ens peptidkæder, som humant alkalisk phosphatase er opbygget af. Enzymets sekundærstruktur opstår når polypeptidet foldes. Sekundærstrukturen kan enten være en stavformet 𝛼-helixstruktur med radikalerne pegende udad eller en pladeformet 𝛽-foldeblads-struktur med parallelle polypeptider, hvor radikalerne skiftevis vender til hver sin side af ”pladen”.
5
Wolsing, Martin, m.fl., Biolex, Århus: Nucleus, 2002, s. 16
6
http://www.biotechacademy.dk/Undervisningsprojekter/Gymnasiale- projekter/enzymer/teori/enzymer
7
https://www.lmfk.dk/artikler/data/artikler/1104/1104_63.pdf
Figur 3 Energiniveauet for en ikke-katalyseret reaktiong og en katalyseret reaktion.
Figur 4. Alkalisk fosfatase fra humant tarmepitel.
Side 8
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
5
Sekundærstrukturen holdes sammen af hydrogenbindinger, som gør strukturen stabil. På figuren kan vi se, at alkalisk phosphatases opbygning består af begge typer sekundærstrukturer. Længst ude til begge sider kan vi se parallelle linjer som danner plader. Dette er 𝛽-foldebladsstrukturer. Spira-lerne på figuren er 𝛼-helixstrukturer.
Enzymet har derudover en tertiærstruktur, som danner enzymets typiske kugleform. Dette kan på figuren ses ved, at strukturen er en ”klump”. Tertiærstrukturen holdes sammen af disulfidbindinger, svovlbroer, ionbindinger, saltbroer mellem syre og base, hydrogenbindinger og direkte bindinger
mellem hydrofobe aminosyrer.^{8} En del af enzymets tredimensionelle struktur har netop den form og9 det aktive center, som skal til for at binde substraterne.
Cofaktorerne udgør kun en lille del af holoenzymet, men de er typisk nødvendige substratbindin-gen. Aktivatorer går under ’cofaktorer’, men cofaktorer kan også være såkaldte coenzymer i form af
10 lavmolekylære organiske stoffer. På figuren til højre sidder der et kulhydrat, som er en oligosak-
11 karid, og med dette indlejret i enzymets struktur er alkalisk phosphatase altså et glykoprotein.
Strontium, Sr^{2+}, er ikke en naturlig del af alkalisk phosphatases struktur og vi ser derfor bort fradenne, mens zink- og magnesiumionerne sammen med kulhydratet sidder placeret i og udgør en-zymets aktive center. Ligeledes ser det ud for det røde peptid, hvilket giver enzymet to aktive centre.
FORSKELLIGE FAKTORERS PÅVIRKNING PÅ REAKTIONSHASTIGHEDEN
Reaktionshastigheden afhænger af enzymers effektivitet som påvirkes af faktorer som temperatur, pH, inhibitorer, substrat- og enzymkoncentration (se bilag 2). Med temperaturen stiger enzymakti-viteten, indtil enzymet når dets såkaldte temperaturoptimum. Et temperaturoptimum er den tempe-ratur, hvor enzymet arbejder mest effektivt. Når temperaturen over dette optimum, denaturerer en-zymet, hvorved enzymaktiviteten falder til nul og reaktionshastigheden mindskes. For de fleste en-zymer i kroppen gælder, at temperaturoptimummet et lig med kropstemperaturen, og alkalisk
12 phosphatase har derfor et temperaturoptimum på ca. 37℃. 11F pH-værdien påvirker enzymaktivite-
ten, da aminosyrernes ladninger ændres ved ændring i pH. Dette har indflydelse på bindingerne og derved på tertiærstrukturen, hvilket besværliggør bindingen mellem enzym og substrat eller gør
8
Hydrofobe aminosyrer binder sig direkte til hinanden, og enzymet får herved et hydrofobt indre og en hydrofil overflade.
9
Torp, Kresten C., Biokemibogen, Århus: Nucleus, 2012
10
Larsen, s. 34
11
https://www.lmfk.dk/artikler/data/artikler/1104/1104_63.pdf
12
https://www.lmfk.dk/artikler/data/artikler/1104/1104_63.pdf
Side 9
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
6 enzymet dysfunktionelt. Alkalisk phosphatases pH-optimum ligger på pH 9,8 – enzymet virker altså
13 bedst i basiske miljøer, hvilket ’alkalisk’ også antyder.
Inhibitorer hæmmer enzymet ved at binde sig til enzymets aktive centrum, så enzymet blokeres eller dets aktivitet nedsættes. Enzymaktiviteten forøges med substratmængden, såfremt enzymkon-centrationen er højere end substratkoncentrationen. Er substratkoncentrationen derimod højere end enzymkoncentrationen, vil enzymaktiviteten og dermed reaktionshastigheden forøges ved tilsætning
af enzym.^{14}INITIALHASTIGHED
For at undersøge enzymkinetikken for alkalisk fosfatase må vi kende til begrebet ’initialhastig-hed’. For beskrivelse af dette kigger vi tilbage på den enzymkatalyserede proces. En enzymkataly-serede proces kan med en forsimplet model be-
15 skrives ved blot to trin, som vist på figur 5.
Enzymet binder substratet i sit aktive center, således at der dannes et aktivt enzym-substratkom-pleks. Dette er illustreret i modellens substratbindingstrin, hvor E er enzymet, S er substratet, og ES er det aktive kompleks. I det katalytiske trin ser vi, hvordan enzym-substratkomplekset omdannes, således at vi får dannet og fraspaltet produktet P og gendannet enzymet E. Enzymet spalter altså substrat til produkt, uden at enzymet selv bliver ”forbrugt”.
Af reaktionsskemaet fremgår k og k, som er hastighedskonstanterne for henholdsvis substratbin-
1 2 dingstrinnet og det katalytiske trin. For reaktionen der løber den modsatrettede vej, således at pro-
dukt og enzym ”genskaber” det aktive kompleks, er k hastighedskonstanten for 𝐸 + 𝑃 → 𝐸𝑆, og k
-2 -
1
er hastighedskonstanten for 𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑆.^{16}I perioden lige efter at enzym og substrat er kommet i samme opløsning, vil substrat og enzym rea-gere og danne ES. På dette tidspunkt er produktdannelsen så godt som lig med nul, og vi ser derfor
13
https://www.lmfk.dk/artikler/data/artikler/1104/1104_63.pdf
14
Larsen, s. 34
15
Nielsen, Ole V., m.fl., BASISKEMI A, København: Haase & søns forlag, 2011, s. 181
16
Nielsen, s. 181
Figur 5. To-trins-model som beskriver den enzymkatalyserede proces.
Side 10
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
7 bort fra muligheden om ES’ ”gendannelse”. Modellen kan derfor skrives endnu simplere, som vist
på figur 6.^{17}Med en antagelse af at substratkoncentrationen er væsentlig højere end enzymkoncentrationen, vil enzym-substratkoncentrationen holdes nærmest konstant, da enzymet hele tiden har substrat at bin-de. Situation, hvor der endnu ikke er ret meget produkt og ES holdes konstant, kaldes for den initia-le stationære tilstand. Den hastighed produktet dannes med kaldes reaktionshastigheden. I starten af reaktionen, hvor reaktionen samtidig befinder sig i en stationær tilstand, kaldes reaktionshastighe-den for initialhastigheden. Måler man initialhastigheden, måler man altså hastigheden for dannelse
18 af produkt i begyndelsen af reaktionen mellem enzym og substrat. Denne metode for bestemmelse
af enzymaktivitet, hvor produktkoncentrationen næsten er lig nul, kaldes initialhastighedsmetoden.
Hastigheden fungerer som et mål for enzymets effektivitet, og enzymkinetikken handler derfor om reaktionshastigheden for dannelsen af produkt. Derfor kan reaktionshastigheden v defineres ved
19 differentialkvotienten til P, hvilket opskrives matematisk på følgende måde:
DIFFERENTIALLIGNINGER
En differentialligning er defineret ved, at der indgår en eller flere differentialkvotienter, hvis funkti-
oner er ubekendte.^{20} Det betyder, at løsning af differentialligninger overordnet set handler om, atfinde den funktion som opfylder ligningen. Da differentialkvotienten også kaldes for væksthastig-hed, indgår differentialligninger ofte i naturvidenskabelige vækstmodeller.
17
http://www.biotechacademy.dk/Undervisningsprojekter/Gymnasiale- projekter/enzymer/teori/enzymer/enzymkinetik
18
Nielsen, s. 67
19
Nielsen, s. 181
20
Clausen, Flemming, m.fl., Gyldendals gymnasiematematik A, København: Gyldendal, 2012, s. 33 Figur 6. To-trins-model for den initiale stationære tilstand.
𝑣 = (1)
𝑑[𝑃] 𝑑𝑡
Side 11
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
8
En differentialligningsmodel indeholder parametre og variable, og modellen tager højde for de lov-
21 mæssigheder, som gør sig gældende for den proces, som differentialligningsmodellen beskriver.
Et eksempel på en vækstmodel kigger vi nærmere på i afsnittet om Michaelis-Menten-modellen.
MICHAELIS-MENTEN-MODELLEN
To-trins-modellen for substratomdannelse beskrevet i afsnittet Initialhastighed kaldes også for ’Mi-chaelis-Menten-modellen’. Det er en vækstmodel opstillet af tyskeren Leonor Michaelis og canadi-eren Maud Menten, og den er udledt til Michaelis-Menten-ligningen i 1913 af modellens opfindere.
Ved antagelse af at der i den initiale stationære tilstand, som man måler på, ikke bliver dannet en-zym-substratkompleks fra produktet, kan modellen udledes på følgende måde ud fra definitionen af reaktionshastighed og ved opstilling af differentialligninger for [P]’ og [ES]’.
Parametrene, der indgår i vækstmodellens ligning, er beskrevet undervejs i udledningen.
UDLEDNING AF MM-MODELLEN
Da Michaelis-Menten-modellen beskriver reaktionshastigheden som funktion er substratkoncentra-tionen, og vi ved at reaktionshastigheden er defineret ved differentialkvotienten for P, da starter vi med at kigge på, hvad der ud fra den enzymkatalyseret proces kendetegner P’. Ud fra processens katalyseret trin kan vi se, at P bliver dannet i takt med, at ES spaltes. Dette sker med hastighedskon-stanten k, og vi kan derfor opstille følgende differentialligning for hastigheden af produktdannelsen
2 i den initiale fase:
𝑃^{′} = = 𝑘_{2} ∙ [𝐸𝑆]𝑑[𝑃] 𝑑𝑡
Da reaktionshastigheden v er defineret ved hastigheden for dannelsen af P (udtryk (1)), må v være lig med P’:
𝑣 = 𝑃^{′} = = 𝑘_{2} ∙ [𝐸𝑆]𝑑[𝑃] 𝑑𝑡
𝑣 = 𝑘_{2} ∙ [𝐸𝑆] (2)21
Clausen, s. 65
Side 12
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
9
For at komme nærmede udledningen af MM-modellen, kigger vi nu på, hvad vi kan udlede om
[ES]. Jeg opstiller igen en differentialligning ud fra den enzymkatalyserede reaktion – her betegner differentialligningen hastigheden for dannelsen af enzym-substratkomplekset.
𝐸𝑆^{′} = = 𝑘_{1} ∙ [ 𝐸] ∙ [ 𝑆] − 𝑘_{−1} ∙ [ 𝐸𝑆] − 𝑘_{2} ∙ [𝐸𝑆]𝑑[𝐸𝑆] 𝑑𝑡
Ud fra substratbindingstrinnet kan det ses, at ES dannes ved reaktion mellem E og S med hastighe-den k. Dette viser første led i ovenstående differentialligning. Ligningen indeholder flere led i
1 modsætning til differentialligningen for produktdannelsen, da ES ikke kun dannes men også ned-brydes. Da substratbindingstrinnet kan forløbe begge veje, kan ES altså spaltes til E og S. Dette sker med hastigheden k, hvilket ses i differentialligningen som andet led. Det tredje og sidste led be-
-1 tegner spaltningen af ES til E og P, som forløber med hastigheden k
2
. Da der ved differentiallignin-gens to sidste led er tale om nedbrydning, er fortegnene negative. [ES] kan her sættes udenfor pa-rentes:
𝐸𝑆^{′} = = 𝑘_{1} ∙ [ 𝐸] ∙ [ 𝑆] − [ 𝐸𝑆] ∙ (𝑘_{−1} + 𝑘_{2})𝑑[𝐸𝑆] 𝑑𝑡
I Michaelis-Menten-modellen antager vi, at substratkoncentrationen er langt større end enzymkon-
centrationen: [S]>>[E].^{22} Under denne antagelse opnår vi hurtigt en tilstand, hvor enzym og sub-0 strat bindes med samme hastighed, som enzym-substratkomplekset spaltes, og vi kan derfor sætte
23 hastighederne for dannelse og nedbrydning af ES lig med hinanden:
𝑘_{1} ∙ [ 𝐸] ∙ [ 𝑆] = [ 𝐸𝑆] ∙ (𝑘_{−1} + 𝑘_{2})Det betyder med andre ord, at ES’ er lig med nul, og at [ES] er konstant, hvilket karakteriserer den
24 såkaldte stationære tilstand.
Dividerer vi nu med k
1
(fra ligningens venstre side) og [ES] på begge sider af lighedstegnet, får vi forholdet mellem koncentrationerne E, S og ES på venstre side af lig-hedstegnet og forholdet mellem hastighedskonstanterne på højre side af lighedstegnet:
[ 𝐸] ∙ [𝑆] 𝑘_{−1} + 𝑘_{2}
[𝐸𝑆] 𝑘_{1}=
22
Christensen, s. 22
23
Nielsen, s. 182
24
Christensen, s. 8
Side 13
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
10
Forholdet mellem hastighedskonstanterne kaldes for Michaelis-konstanten, som er betegnet K M med enheden molær. Konstanten gælder i den initiale stationære tilstand, og den beskriver effektivi-teten af substratbinding for det pågældende enzym.
Er værdien af K høj, er effektiviteten lav, da der her er en stor enzymkoncentration i forhold til en M lav enzym-substratkoncentration. En lav K
M
-værdi indikerer dermed en effektiv substratbinding, da
25 enzym-substratkoncentrationen her er høj.
Enzymer er som sagt katalysatorer, og de forbruges derfor ikke. Enzymmængden er derfor konstant
– hvad enten enzymet findes frit eller på bundet form som i enzym-substratkomplekset. Enzymets
26 startkoncentration er derfor givet ved summen er frit og bundet enzym:
[ 𝐸]_{0} = [ 𝐸] + [𝐸𝑆]Dette kan omskrives, så vi i stedet får enzymkoncentrationen til et givent tidspunkt:
[ 𝐸] = [𝐸]_{0} − [𝐸𝑆]Indsættes dette udtryk i udtryk (3), hvor K
M
27 er lig med koncentrationsforholdet, får vi følgende:
([𝐸]_{0} − [𝐸𝑆]) ∙ [𝑆][𝐸𝑆]
= 𝐾_{𝑀}Vi kigger nu tilbage på udtrykket for reaktionshastigheden v (udtryk (2)), hvor vi kan se, at [ES] indgår. Ved at omskrive ovenstående ligning, får vi udtrykket for [ES]:
[ 𝐸𝑆] =
([𝐸]_{0} − [𝐸𝑆]) ∙ [𝑆]
𝐾_{𝑀}25
Christensen, s. 9
26
Christensen, s. 7
27
Nielsen, s. 184
𝐾_{𝑀} = 𝑒𝑙𝑙𝑒𝑟 𝐾_{𝑀} = (3)𝑘_{−1} + 𝑘_{2} [ 𝐸] ∙ [𝑆]
𝑘_{1} [𝐸𝑆]Side 14
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
11
Ved at gange [S] ind i parentesen og herefter lægge det ene led til på begge sider af lighedstegnet kan ovenstående ligning omskrives til følgende udtryk:
[ 𝐸𝑆] = − ⟺ [ 𝐸𝑆] + =
[𝐸]_{0} ∙ [𝑆] [ 𝐸𝑆] ∙ [ 𝑆] [ 𝐸𝑆] ∙ [ 𝑆] [𝐸]_{0} ∙ [𝑆]
𝐾_{𝑀} 𝐾_{𝑀} 𝐾_{𝑀} 𝐾_{𝑀}For at få fælles nævner på ligningens venstre side forlænges [ES] med^{𝐾_{𝑀}}_{𝐾_{𝑀}}. Herefter sættes [ES]udenfor parentes på venstre side af lighedstegnet:
[ 𝐸𝑆] ∙ 𝐾_{𝑀} + [ 𝐸𝑆] ∙ [ 𝑆] [𝐸]_{0} ∙ [𝑆] [ 𝐸𝑆] ∙ (𝐾_{𝑀} + [ 𝑆]) [𝐸]_{0} ∙ [𝑆]
𝐾_{𝑀} 𝐾_{𝑀} 𝐾_{𝑀} 𝐾_{𝑀}= ⟺ =
For at isolere [ES] på venstre side af ligningen ganges med den reciprokke på begge sider af lig-hedstegnet, hvorved følgende udtryk fås:
[ 𝐸𝑆] = [𝐸]_{0} ∙[𝑆]
[ 𝑆] + 𝐾_{𝑀}28 Dette udtryk kan nu indsættes i udtrykket for v (udtryk (2)):
𝑣 = 𝑘_{2} ∙ [𝐸]_{0} ∙[𝑆]
[ 𝑆] + 𝐾_{𝑀}Da k, [E] og K alle er konstanter, afhænger reaktionshastigheden altså af substratkoncentratio-
2 0 M nen. Jo større [S] er, desto højere bliver v. Da [E]
0 som sagt er konstant, og da enzym og substrat ækvivalerer i forholdet 1:1, er der en naturlig barre for hvor hurtig reaktionen kan forløbe. Ved
[S]>>[E] bliver [ES] konstant, når alle enzymer ved den teoretiske situation er bundet til substrat.
0
Der opnås her den maksimale reaktionshastighed betegnet v.^{29}max
Vi husker på, at v er defineret som P’, hvor dannelsen af P sker med hastigheden k. Da [S]>>[E]
2 0 ved v, har hverken [S] eller [ES] betydning for den maksimale reaktionshastighed, og v kan max max derfor udtrykkes som følgende:
𝑣_{𝑚𝑎𝑥} = 𝑘_{2} ∙ [𝐸]_{0}28
Nielsen, s. 184
29
Nielsen, s. 182
Side 15
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
12
Ved at kombinere ligningen for v max med ligningen for v får vi Michaelis-Menten-ligningen:
Ud fra ligningen kan vi se, at den eneste koncentration reaktionshastigheden v umiddelbart afhæn-ger af, er substratkoncentrationen [S]. Dog ligger der også gemt i v og K at enzymkoncentrati-max M onen har afgørende betydning for dannelsen af produkt.
Endvidere viser ligningen sammenhængen mellem [S] og K
M M
. Har K den samme værdi som [S], får vi for v:
𝐾_{𝑀} = [ 𝑆] ⟹ 𝑣 = 𝑣_{𝑚𝑎𝑥} ∙1
2
Omvendt betyder det, at K er lig med sub-
M stratkoncentrationen, når den gældende re-aktionshastighed er halv så stor som den maksimale reaktionshastighed. Dette er illu-
30 streret på figur 7.
Til slut viser Michaelis-Menten-ligningen, at et enzym med en lav K -værdi katalyserer
M med en reaktionshastighed tæt på den mak-simale hastighed i den initiale stationære fase – endog med en relativ lav substratkon- på yaksen.
centration. Modsat kræves substratkoncentrationen at være høj, for at reaktionshastigheden nærmer
sig v, når værdien af K er høj.^{31} Ved at omskrive Michaelis-Menten-ligningen kan man få ud-max M regningerne for ligningens parametre v og K: max M
30
http://www.biotechacademy.dk/Undervisningsprojekter/Gymnasiale- projekter/enzymer/teori/enzymer/enzymkinetik
31
Nielsen, s. 185
𝑣 = 𝑣_{𝑚𝑎𝑥} ∙[𝑆]
[ 𝑆] + 𝐾_{𝑀}Figur 7. Betydning af K_{M} og V_{max} illustreret på graf medsubstratkoncentration på x - aksen og reaktionshastighed
𝑣_{𝑚𝑎𝑥} = 𝑜𝑔 𝐾_{𝑀} = [𝑆] ∙ ( − 1)𝑣 𝑣_{𝑚𝑎𝑥}[𝑆]
[ 𝑆] + 𝐾_{𝑀}𝑣
Side 16
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
13
FORSØG: ENZYMKINETIK FOR ENZYMET ’ALKALISK FOSFATASE’
Udført på [navn fjernet] Gymnasium d. 7. december 2016 sammen med Tobias Brink 3.U
INTENTIONEN MED FORSØGET
Formålet med forsøget ’Enzymkinetik for enzymet alkalisk fosfatase’ er at undersøge reaktionsha-stigheden v’s afhængighed af substratkoncentrationen [S] i den initiale stationære tilstand. Derud-over har forsøget en bestemmelse af K
M max og V for alkalisk fosfatase til formål. Dette muliggør en vurdering af enzymets evne til at spalte substrater. Forsøget skal illustrere enzymers virkemåde samt bevise, at Michaelis-Menten-modellen kan bruges til beskrivelse af enzymkinetikken.
TEORI
Alkalisk fosfatase finder vi i bakterier og planter såvel som i pattedyr. Med andre ord findes alka-lisk phoshatase i stort set alt der er levende, hvor det syntetiseres i alle væv. Hos pattedyr – herun-der os mennesker –syntetiseres enzymet især i tarm, galde, nyre, livmoder, lever og knogler.
For at undersøge aktiviteten af alkalisk fosfatase tager vi i dette forsøg udgangspunkt i alkalisk fos-
fatase fra bovint tarmepitel, som har pH-optimum ved en pH-værdi på 9,8.^{32} Som tidligere nævnt erenzymet en hydrolase, som katalyserer hydrolyser af phosphatestre, hvorved der dannes hydrogen-phosphat og alkohol som produkter. I dette forsøg vil vi undersøge alkalisk phosphatases katalyse af substratet para-nitrophenylphosphat (4-nitrophenylfosfat eller pNPP), hvilket figur 8 viser reakti-
onsskemaet af.^{33}Figur 8. Reaktionsskema for AP’s katalyse.
Selvom et af alkalisk phosphatases karakteristika er, at det katalyserer mange forskellige substrater
34 grundet flere varianter af enzymet
, er pNPP ikke et substrat, som alkalisk fosfatase naturligt kata-lyserer. Dog er substratet velegnet til undersøgelsen af alkalisk fosfatases aktivitet, da produktet
32
https://www.lmfk.dk/artikler/data/artikler/1104/1104_63.pdf
33
https://www.lmfk.dk/artikler/data/artikler/1104/1104_63.pdf
34
Isoenzymer: Katalyserer den samme type proces, men er forskelligt opbyggede.
http://net.biolyt.dk/docs/M7/biokemi/enzymkinetik/Enzymkinetik.swf, s. 13
Side 17
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
14
35 para-nitrophenol (4-nitrophenol eller pNP) er gult.
Idéen i et gult produkt er beskrevet i afsnittet om spektrofotometri med Lambert-Beers lov.
For at undersøge reaktionens hastighed som funktion af substratkoncentrationen udfører vi et kon-trolleret eksperiment, hvor det eneste der ændres er substratkoncentrationen. Ved at kende reaktan-ternes aktuelle stofmængdekoncentrationer, lige når de blandes sammen, får vi et sæt sammenhø-rende værdier af hastighed og substratkoncentration ved måling af initialhastigheden. Ved udførelse af forsøget gentagne gange, hvor mængden af substrat er ændret fra gang til gang, er det til sidst muligt at finde reaktionens hastighedsudtryk, hvilket beskriver enzymets aktivitet. Med andre ord
36 benytter vi altså initialhastighedsmetoden.
FORSØGETS UDFØRELSE
(Se bilag 4 for fuld forsøgsvejledning)
Inden forsøgets start lavede vi en substratopløsning ved at opløse 11 piller pNPP af 5 mg i en
10mM Tris-opløsning med pH 8 justeret af HCl, som vi havde lavet forinden. pH-værdien skulle være forholdsvis neutral, for at undgå autohydrolyse.
Derudover fortyndede vi enzymet leveret som 40.000 DEA U/mL 400 gange. Det gjorde vi ved at
fortynde 2,5𝜇L enzym med 1000𝜇𝐿 10mM Tris-opløsning med pH 8. Opløsningen med enzym var
nu 100 DEA U/mL.
Til sidst inden forsøgets start fremstillede vi en DEA-buffer med en pH-værdi på 9,8 for højest mu-lig enzymaktivitet.
For at udføre forsøget og undersøge reaktionshastighedens afhængighed af substratkoncentrationen, varierede vi substratkoncentrationen, mens enzymkoncentrationen holdtes konstant. I otte kuvetter blandede vi 1000𝜇L DEA-buffer med substratmængder efter blandeskemaet i bilag 4, som jeg ind-stillede med demineraliseret vand. I blandeskemaet ses også vandmængden samt substratkoncentra-tionen. Med spektrofotometeret koblet til Logger Pro kalibrerede vi med demineraliseret vand og indstillede Logger Pro til at måle med bølgelængden 405 nm, da absorbansen af denne var størst.
For hver af vores 8 prøver iblandede vi 20𝜇L enzym lige inden måling.
35
Forsøgsvejledning
36
Nielsen, s. 67
Side 18
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
15
METODE: SPEKTROFOTOMETRI MED LAMBERT-BEERS LOV
For at forstå sammenhængen mellem teori og databehandling (se bilag 4) må vi først få en indsigt i, hvad Logger Pro beregner.
Ved hjælp af et spektrofotometer kan man lave et absorbtionsspektrum for et stof, såfremt stoffet ikke er farveløst. Da vi ønsker at finde hastigheden for dannelsen af produkt, og da produktet para-nitrophenol er gult, bestemmer vi produktets absorbtionsspektrum. Lambert-Beers lov fortæller, at der er ligefrem proportionalitet mellem absorbansen betegnet med A og koncentrationen af den målte opløsning betegnet med c.
𝐴 = 𝜀_{𝜆} ∙ 𝑐 ∙ ℓℓ er lysvejen, hvilket vil sige bredden af den kuvette, som opløsningen er i. I dette forsøg har vi benyttet kuvetter med en bredde på 1cm. Ekstinktionskoefficienten (absorbtionskoefficient) er pro-portionalitetskonstanten og betegnes med 𝜀. Konstantens værdi varierer fra stof til stof og er for-
37 skellig ved forskellige bølgelængder. Ekstinkstionskoefficienten for para-nitrophenol ved en bøl-
gelængde på 405 nm er givet til at være 𝜀_{𝜆} =18600 M^{-1} cm^{-1}.^{38} Vi benytter ekstinkstionskoefficientenved netop denne bølgelængde til vores beregninger, da pNP’s absorbans af lys er størst netop her.
Dette viser absorptionsspektrummet vist i bilag 4.
Ud fra proportionaliteten gælder det, at jo mere produkt opløsningen indeholder, desto større bliver absorbansen. Da vi undersøger dannelsen af produkt, er c i dette forsøg produktkoncentrationen.
Lambert-Beers lov kommer herved til at se ud som følgende:
𝐴 = 18600𝑀^{−1} 𝑐𝑚^{−1} ∙ [𝑃] ∙ 1𝑐𝑚Ved måling af absorbansen bliver [P] ligningens eneste ubekendte. Vi isolerer derfor [P] og får:
[ 𝑃] = ⟺ [ 𝑃] =
𝐴 𝐴
18600𝑀^{−1} 𝑐𝑚^{−1} ∙ 1𝑐𝑚 18600𝑀^{−1}Da substratkoncentrationen bliver større for hver måling, må vi antage at der også sker en tilvækst i produktdannelsen. Da tilvæksten af produkt er proportional med tilvæksten af absorbans, kommer ligningen til at se således ud:
37
Bruun, Kim, m.fl., Grundbogen i Bioteknologi 1, København, Gyldendal, 2014, s. 72
38
Forsøgsvejledning
Side 19
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
16
Δ [ 𝑃] =
Δ𝐴
18600𝑀^{−1}Da reaktionshastigheden v beskriver tilvæksten i [P] pr. tidsenhed, divideres der nu med ∆t på beg-ge sider af lighedstegnet. Da vi tidligere (s. 7) har defineret v til at være differentialkvotienten til P
𝑑𝑃 Δ𝑃
som funktion af tid: , kan vi kalde for v:
𝑑𝑡 Δ𝑡Δ𝑃 Δ𝐴 1 1 Δ𝐴
Δ𝑡 18600𝑀^{−1} Δ𝑡 18600𝑀^{−1} Δ𝑡= ∙ ⟺ 𝑣 = ∙
Δ𝐴
Δ𝑡 er et andet udtryk for tangenthældningen a t til et gældende tidspunkt. Derfor kan vi forenkle
Δ𝐴
formlen, ved at erstatte med a :
Δ𝑡t
𝑣 =
𝑎_{𝑡}
18600𝑀^{−1}v er reaktionshastigheden for alkalisk phosphatases katalyse af substratet pNPP, og a er tangent-t hældningen i den initiale stationære tilstand for den pågældende prøves substratkoncentration.
Mere generelt kan Lambert-Beers lov altså omskrives til nedenstående formel, som beskriver reak-tionshastigheden i den enzymkatalyseret proces’ initiale stationære tilstand:
DATA
Figur 9 øverst på næste side viser, produktets absorbans af en bølgelængde på 405nm som funktion af tiden efter enzymtilsætningen for hver af de otte målinger. Absorbansen er et mål for pro-duktdannelsen grundet proportionalitet mellem absorbans og produkt beskrevet i Lambert-Beers lov. Hvilken substratkoncentration der hører til hver graf fremgår af tabellen under resultater.
Graferne viser, at jo højere substratkoncentrationen er, desto højere er initialhastigheden, og at de stiger, indtil reaktionerne når deres maksimale hastighed. Grafernes udsving efter den initiale fase må skyldes, at substratkoncentrationerne ikke længere er højere end enzymkoncentrationerne.
𝑣 =
𝑎_{𝑡}
𝜀_{𝜆} ∙ ℓSide 20
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
17
DATABEHANDLING
For hver af de otte målinger ønsker jeg at finde tangenthældningen for substratkoncentrationen som funktion af tiden i reaktionens initiale stationære tilstand. Dette gøres ved at foretage Linear Fit
(lineær regression) over grafernes første lineære stykke. Hældingen svarer til absorbansændring pr.
sekund og fremgår for hver graf i tabellen herunder.
Farve på graf Prøve nr. Substratkoncentration Initialhastighed (∆A/∆t)
𝜇 M s^{-1}Rød 1 37,5 0,02101
Blå 2 75 0,02739
Grøn 3 150 0,04710
Gul 4 225 0,1302
Brun 5 300 0,1793
Mørkegrøn 6 600 0,2049
Mørkeblå 7 1200 0,2347
Lysebrun 8 4800 0,2618
-1 For at omregne initialhastigheden (tangenthældningen ∆A/∆t) fra s til enheden 𝜇M/min benyttes
Lambert-Beers lov. Da loven kan omskrives til følgende udtryk, og vi allerede har værdierne af ekstinktionskoefficienten og lysvejen, indsættes de målte tangenthældninger blot på a ’s plads.
t
Figur 9. Absorbans af bølgelængde på 405 nm (y-aksen) som funktion af tid målt i sekunder (x-aksen) for otte prøver med forskellige substratkoncentrationer.
Side 21
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
18
𝑣_{0} = ⟹ 𝑣_{0} =𝑎_{𝑡} 𝑎_{𝑡}
𝜀_{𝜆} ∙ ℓ 18600𝑀^{−1}Der vises herunder et eksempel for omregning af initialhastigheden v ’s enhed for enzymaktiviteten
0 ved den laveste målte substratkoncentration på 37,5𝜇M.
𝑣_{0} = = 1,130 ∙ 10^{−6}0,02101𝑠^{−1} 𝑀
18600𝑀^{−1} 𝑐𝑚^{−1} ∙ 1𝑐𝑚 𝑠For at komme et skridt nærmere den ønskede enhed ganger jeg den udregnede værdi med 10^{6},
hvorved enheden går fra M/s til 𝜇M/s.𝑣_{0} = 1,130 ∙ 10^{−6} ∙ 10^{6} = 1,130𝑀 𝜇𝑀 𝑠 𝑠
For omregning fra sekund til minut ganger jeg nu med 60:
𝑣_{0} = 1,130 ∙ 60 = 67,80𝜇𝑀 𝜇𝑀 𝑠 𝑚𝑖𝑛
Initialhastigheden udregnet i 𝜇M/min for den alkalisk phosphatase katalyseret proces med substrat-
koncentrationen på 37𝜇M er altså på 67,80_{𝑚𝑖𝑛}^{𝜇𝑀}. Det betyder at produktkoncentrationen stiger med67,80𝜇M i minuttet i den initale stationære tilstand, når substratkoncentrationen er 37𝜇M.
På denne måde kan vi ved brug af Lambert-Beers lov altså udregne initialhastighederne målt i
𝜇M/min ved alle de målte substratkoncentrationer.
Lægges alle mellemregninger sammen får vi, at man ganger med 3226 for omskrivning af inital-hastighedens enhed for alkalisk phosphatase ved bølgelængden 405nm:
𝑣_{0} = 𝑎_{𝑡} ∙ = 𝑎_{𝑡} ∙ 322610^{6} ∙ 6018600
Ved at indskrive substratkoncentrationen som x og absorbansændringen pr. sekund som y i en ny Logger Pro fil kan vi få en graf over initialhastigheden v som funktion af substratkoncentrationen.
0
Absorbansændringen pr. sekund omregnes til initialhastigheden ved at gange med 3226 i en ny kal-kuleret kolonne.
På x-aksen har vi nu substratkoncentrationen målt i 𝜇M, og på y-aksen har vi initialhastigheden
målt i 𝜇𝑀/min. Ved at lave en kurvefitning til Michaelis-Menten-ligningen kan vi nu aflæse K og
M
V, som Logger Pro har beregnet for os (se bilag 4) max
Side 22
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
19
På grafen kan vi på punkternes placering ift. linjen se, at resultaterne fra vores målinger følger Mi-chaelis-Menten-modellen i rimelig grad. Da dette er tilfældet, kan jeg bestemme V og K ud fra max M ligningens forskrift.
V K max M
951,7𝜇M/min 327,7𝜇M
V fortæller, at den maksimale reaktionshastighed for hydrolyse af pNPP til pNP er max
951,7 𝜇M/min. K har værdien 327,7𝜇M, hvilket er en relativ lille K -værdi. Det betyder, at en-
M M zymkoncentrationen er lav, mens enzym-substrat-koncentrationen er høj, og alkalisk phosphatases substratbinding er altså derfor effektiv.
DISKUSSION OG VURDERING
For at vi kan drage konklusioner om sammenhængen mellem reaktionshastighed og substratkoncen-tration, må der kun være en enkelt faktor som er vekslende mellem de otte prøver – nemlig sub-stratkoncentrationen. Er der flere faktorer end én, kan vi ikke afgøre, om det egentlig er mængden af substrat, som hastigheden i dette tilfælde afhænger af. Derfor er det meget vigtigt, at alle afmå-linger ved forsøgets udførelse er meget nøjagtige for at få så identiske prøver som overhovedet mu- Figur 10. Kurvefitning til Michaelis-Menten-ligningen med substratkoncentration målt i 𝝁M på x-aksen
og initialhastigheden v_{0} målt i 𝝁 M/min på y-aksen.Side 23
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
20 ligt. Ved at lave summen af substrat og demineraliseret vand den samme for alle prøver, opnås ens volumener, hvilket er med til at gøre forsøgets prøver sammenlignelige.
Det faktum at enzymers aktivitet afhænger af faktorer som temperatur, pH og enzymkoncentratio-ner har stor indflydelse på forsøgets resultater. At mængden af DEA-buffer er taget fra samme op-løsning hver gang mindsker risikoen for forskellige pH-værdier.
De ens enzymkoncentrationer gør også forsøget sammenligneligt vel at mærke at enzymmængden er afpipetteret præcist. Derimod har vi ikke målt temperaturen undervejs i forsøget, og da enzymer har et meget specifikt temperaturoptimum, hvorefter de denaturerer, er temperaturen vigtig for reak-tionshastigheden. Det vigtigste er dog her, at temperaturen ikke kommer over temperaturoptimum-met på ca. 37℃, da alkalisk phosphatase-enzymerne her denaturer. Denaturering vil medføre en enzymaktivitet på nul, og vi vil derfor ikke kunne sige noget om alkalisk phosphatases effektivitet.
På baggrund af den målte aktivitet samt dét, at enzym og substrat har stået på køl (dvs. en tempera-tur langt under temperaturoptimum), kan vi afskrive denaturering som fejlkilde. Den lavere og ”upræcise” temperatur kan dog være med til at forklare punkternes afvigelse fra Michaelis-Menten-ligningen. At vi ikke har arbejdet ved v max kan også være med til at forklare afvigelserne fra Mi-chaelis-Menten-kurven.
Da der er afvigelser, må vi antage at forsøget indeholder en fejlkilde eller en måleusikkerhed, men da vi ikke har et specifikt resultat for V max M og K er det vanskeligt at sige noget om fejlkildernes størrelse.
En fejlkilde kan også være, hvis enzym og substrat allerede har reageret med hinanden inden må-lingens påbegyndelse, så vi ikke længere befinder os i den initiale stationære tilstand.
Da vi ikke har målinger, hvor initialhastigheden er den samme ved forskellige koncentrationer, kan vi ikke vide os sikre på at den beregnede V max passer, men da punkterne ellers følger modellen og da initialhastigheden falder i forhold til substratkoncentration ved koncentrationer over minimum
30 𝜇M, må vi gå ud fra, at V i rimelig grad passer.
max
Holder antagelsen om at det katalytiske trin ikke kan forløbe i den modsatte retning i starten af re-aktionens forløb ikke stik, indeholder forsøget også en systematisk fejlkilde, da Michaelis-Menten-modellen herved ikke kan beskrive enzymaktiviteten i rent praktisk.
Den viden som kan udledes gennem en forsøgsopstilling som denne, kan blandt andet bruges til at klassificering af enzymer efter fx effektivitet, hvilket især er nyttigt i industrien for optimering af de enzymkatalyseret processer. En undersøgelse af enzymaktivitet benyttes også i forbindelse med
Side 24
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
21 diagnoser, da en for lav eller for høj aktivitet kan være et sygdomsmarkør. Derudover kan den ud-ledte viden også bruges til beskrivelse af det undersøgte enzym.
KONKLUSION PÅ FORSØGET
Vi må konkludere på baggrund af forsøgets otte prøver med substratkoncentration som den eneste varierende faktor, at reaktionshastigheden afhænger af substratkoncentrationen. Vi kan se på den stigende tangenthældning, at jo større substratkoncentrationen er, desto højere er initialhastigheden.
På baggrund af teorien om den enzymkatalyseret proces samt den faldende initialhastighed i forhold til substratkoncentration, må vi antage, at dette kun gælder, indtil koncentrationen af enzym-substratkomplekset er konstant.
Ved anvendelse af Michaelis-Menten-ligningen til behandling af forsøgets resultater kan vi se, at alkalisk phosphatase følger enzymkinetikken beskrevet af Michaelis og Menten. Ved bestemmelse af V ud fra forsøgets resultater, kan vi konkludere, at alkalisk phosphate kan omdanne pNPP til max
pNP med en maksimal hastighed på 951,7𝜇M/min. Derudover har vi bestemt K til at have en vær-
M di på 327,7𝜇M. Den relative lille K
M
-værdi betyder at enzym-substratkomplekskoncentrationen har været stor, og vi kan derfor konkludere, at alkalisk phosphatase er et effektivt enzym til at binde substrater. Det betyder også, enzymet har en god evne til at spalte substrater til produkter og der-med en effektiv katalyse. Med andre ord er alkalisk phosphatases aktivitet høj.
MUTATION I ALPL-GEN
ALPL-gener koder for det humane alkaliske phosphatase. Der findes flere variationer af dette en-zym, hvor det ene isoenzym findes i tarmepitel, mens et andet isoenzym er det vævs uspecifikke enzym, som vi finder i lever, knogler og nyrer. ALPL-genet kodende for netop dette enzym sidder
på kromosom 1, mens de andre ALPL-gener er placeret på kromosom 2.^{39} Den mutationstype som40 oftest er set i ALPL-generne i forbindelse med sygdomme er missense mutationen.
En genmutation er en permanent baseændring DNA’et. En mutation kan medføre store konsekven-ser for personen med mutationen i sit DNA samt for personens afkom, såfremt mutationen finder sted i kønscellerne eller stamcellerne dertil og dermed er arvelig. Missense mutation hører under
’punktmutation’, som betegner de mutationer, hvor kun enkelte baser ændres. Forårsager baseæn-dringen en udskiftning af aminosyren, kaldes mutationen for en missense mutation. Med en udskif-
39
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ALPL
40
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/
Side 25
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
22 tet aminosyre bliver proteinets struktur anderledes, hvilket for enzymer kan betyde, at enzymet slet ikke længere fungerer, da enzymstrukturen ikke passer til substratet, eller at substratbindingen
41 ”blot” bliver mindre effektiv. Herved vil reaktionshastigheden for omdannelsen fra substrat til
produkt være lav. Det samme gælder for V max M
, mens K vil være relativ høj, som indikerer en lille enzymsubstrat-koncentration grundet en ineffektiv substratbinding.
Ved forsøget har vi set, at alkalisk phosphatase generelt har en høj aktivitet, hvilket indikerer en vis vigtighed af enzymet. Bliver enzymstrukturen ændret, er der altså risiko for, at aktiviteten falder drastisk, og der vil hermed være meget substrat, som ikke omdannes, men som i stedet evt. opho-bes.
Da alkalisk phosphatase som tidligere nævnt blandt andet katalyserer fjernelsen af pyrophosphat, som hæmmer dannelsen af knoglestrukturer, er et rask ALPL-gen vigtigt for knoglemineraliserin-gen. Det skyldes at enzymet katalyserer den proces hvor organisk pyrophosphat omdannes til to uorganiske phosphatmolekyler som binder sig sammen med calcium og derved laver en sund knoglemineralisering. Er koncentrationen af (funktionelt) alkalisk phosphatase lav, vil py-rophosphat ikke omdannes til phosphat, og der bliver dermed ikke dannet nyt knoglevæv. Den manglende omdannelse vil også medfører ophobning af pyrophosphat og calcium i nyrer, muskler og led, som giver smerter.
Har en mutation i ALPL-genet medført et dysfunktionelt alkalisk phosphatase har det altså store
42 konsekvenser eksempelvis for knogledannelsen. Selv efter voksealderen stopper mineraliseringen
af knogler ikke, og der er derfor gennem hele livet brug for funktionelt alkalisk phosphatase.
Andre symptomer end manglende knogledannelse forårsaget af et muteret ALPL-gen er tidligt tab af tænder, dvs. før 5 årsalderen, smertefuld tandtab, hvor roden ryger med ud, muskel og led smer-ter, astma, anfald, nyresygdomme m.m.
DIAGNOSTICERING OG BEHANDLING
En sygdom som netop er forbundet med missense mutationer i ALPL-genet for det vævs uspecifik-
43 ke isoenzym er hypophosphatasia, som betegner for lidt phosphat i blodet. Mutationen gør, at en-
zymkoncentrationen er lav. Hypophosphatasia er en arvelig sygdom, som nedarves autosomalt re-cessivt. Den kan komme til udtryk ved både kvinder og mænd i alle aldre. Sygdommen er progres-
41
Egebo, Lone A., GENETIKBOGEN B+A, Århus: Zeuner Grafisk as, 2015, s. 57
42
http://www.hypophosphatasia.com/index.php/getting-to-a-diagnosis-of-hpp/getting-to-a-
diagnosis-of-hpp
43
http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ALPL
Side 26
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
23 siv, og dens symptomer kan derfor opstå samt tiltage med alderen. Det muterede ALPL-gen er re-cessivt, hvilket betyder, at begge alleller skal være muterede, for at sygdommen kommer til udtryk.
Dette har betydning for, at sygdommen er sjælden.
Når man som læge skal diagnosticere patienter, kigger man først efter synlige tegn og symptomer.
Optræder ovenstående symptomer mistænkes lavt fosfatindhold i blodet, og blodets fosfatindholdet testes ved en simpel blodprøve. Alkalisk phosphatase fraspalter fosfat fra et organisk mineral, såle-des uorganisk phosphat kommer ud i blodet. Et lavt fosfatindhold i blodet peger derfor på en ikke
44 særlig effektiv defosforylering, hvilket kan ledes tilbage til et muteret ALPL-gen.
Peger både symptomer og fosfatindhold på et muteret ALPL-gen, tester man for en lav alkalisk phosphatase-aktivitet, hvilket også gøres ved en simpel blodprøve. Alkalisk phosphatases aktivitet varierer meget afhængigt af alder og køn. Den er typisk højere hos nyfødte, børn og unge end hos
45 voksne grundet voksealderen.
Skal man være helt sikker på, at sygdommen og dens symptomer netop skyldes et muteret ALPL-gen, kræves en kortlægning af generne. Dette er meget omkostningsfuldt, og genetik kommer derfor først sent ind i diagnosticeringsforløbet, hvis ikke det helt kan undgås. Der skal være tilstrækkelige tegn, som peger i retningen af muterede gener, før kortlægning af gener bliver taget i brug. Syg-dommen skal være arvelig og alvorlig. Et muteret ALPL-gen kan altså fører til en tidkrævende, om-
46 fattende og dyr diagnosticeringsperiode for både patient, pårørende og læger.
FEJLDIAGNOSTICERING
Mange af symptomerne forbundet med et muteret ALPL-gen ses også i forbindelse med andre mere ”almindelige” sygdomme. Det er fx symptomer som svage knogler eller knogleskørhed. Da en syg-dom som hypophosphatasia forårsaget af et muteret APLP-gen er sjælden, kommer andre mere ty-piske sygdomme i spil først under diagnosticering. Dette medfører, at patienter med hypophospha-tasia relativt ofte fejldiagnosticeres. Det faktum at ALPL-genet koder for flere varianter af alkalisk phosphatase, og at alkalisk phosphatase derfor findes i flere forskellige organer, gør, at symptomer-ne er en del forskellige fra patient til patient og varierer i graden. Dette besværliggør diagnostice-ring af sygdomme forbundet med et muteret ALPL-gen, hvilket igen kan føre til fejldiagnosticerin-
44
Haunsø, Stig, m.fl., MEDICINSK KOMPENDIUM, København: Arnold Busck, 2013, s. 2179
45
http://www.hypophosphatasia.com/index.php/getting-to-a-diagnosis-of-hpp/getting-to-a-
diagnosis-of-hpp
46
http://videnskab.dk/teknologi/kortlaegning-af-gener-sker-hurtigere-end-nogensinde
Side 27
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
24 ger. Fejldiagnosticeringerne er blandt andet vitamin-D mangel, knogleskørhed, slidgigt, tandkøds-
sygdomme, leukæmi m.m.^{47}Det allerede lange diagnosticeringsforløb samt eventuelle fejldiagnosticering har store negative konsekvenser for patienten, samt at det koster penge. Ved fejldiagnosticering bliver man typisk gi-vet det forkerte medicin, hvilket i nogle tilfælde ligefrem kan være skadeligt for patienten. For pati-enter med hypophosphatasia er medicin i form af calcium-, vitamin D- og phosphat-tilskud skade-ligt, hvilket er medicin, man blandt andet vil give folk med førnævnte sygdomme. Alkalisk phosphatase katalyser omsætningen af disse mineraler i kroppens metaboliske processer. Derfor risikerer man ophobning af disse mineraler og tiltag i smerte eller andre symptomer, hvis man har et muteret ALPL-gen. Tager man medicinen over en længere periode, risikerer man også at udvikle resistens for det pågældende medikament.
BEHANDLING
Da men selv ved korrekt diagnosticering ikke kan behandle med erstatninger for alkalisk phospha-tase, er man nødt til at symptombehandle. Man vil blive behandlet med smertelindrende medicin til håndtering af knogle, led og muskel smerter. Der er mulighed for at blive henvist til en specifik tandlægebehandling, da sygdomme i forbindelse med lav alkalisk phosphatase aktivitet ofte medfø-rer problemer med tænder og tandkød. Der kan foretages konsultationer med ortopædkirurger om operation for stabilisering af svage og bløde knogler, hvilket også ofte er et problem. Speciallister kan give de rette øvelser for at gøre muskler og led stærkere omkring de svage knogler. Alle de nævnte behandlingsformer er omkostningsfulde, men de kan være nødvendige for en patient med et livs langt sygdomsforløb foran sig. Det vil gøre sygdommen mere udholdelig, men det er samtidig ikke optimalt, at skulle tage medicin dagligt samt andre forbehold. I dag er der også gode mulighe-der for fx tandbøjler og kørestole, men det er ofte langt fra, hvad patienter ønsker – særligt ikke unge.
Et liv med en sygdom forårsaget af en genmutation i ALPL-genet er typisk væsentligt mere ander-ledes og besværligt end en rask persons liv. Det er blandt andet aktiviteter som at dyrke sport, at gå hurtigt, stå behageligt, løfte tungere ting og holde sig vågen. Hos børn betyder det typisk en lang-sommere udvikling, og for patienter generelt, kan det være svært at sætte udefra stående ind i de følelser, der hører med til det at være diagnosticeret med en livsvarig sygdom. Har man en lav akti-vitet af alkalisk phosphatase, som et muteret ALPL-gen medfører, ser man ofte anderledes ud fx
47
http://www.hypophosphatasia.com/index.php/getting-to-a-diagnosis-of-hpp/getting-to-a-
diagnosis-of-hpp
Side 28
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
25 ved at have knogleskørhed, hvilket styrker følelsen af at være anderledes samt i værste fald fører til mobning. Derudover bør man også inddrage risiko for sygdom i sine overvejelser om at få børn, da det er en genetisk fejl, og mutationen dermed er arvelig.
Et muteret ALPL-gen kan altså fører til liv, som er ét langt sygdomsforløb, hvor man skal gøre sig en række forbehold, som man ellers ikke skulle gøre sig med et rask gen.
KONKLUSION
Gennem en redegørelse af enzymers opbygning og funktion har jeg fundet frem til vigtigheden af den rette enzymstruktur, for at substratet kan bindes til enzymet, hvorved det omdannes til produkt.
Enzymer katalyserer metaboliske processer, uden enzymet selv bliver forbrugt. Deres overordnede funktion er at få metaboliske reaktioner til at forløbe, hvilket gøres ved at nedsætte aktiveringsener-gien. Enzymet alkalisk phosphatases proteinsyntese er kodet for af ALPL-genet, som findes på både kromosom 1 og 2, og enzymet er opbygget af to ens peptidkæder, et kulhydrat, hvilket gør enzymet til et glykoprotein, og fire zinkioner og to magnesiumioner som aktivatorer. ALPL-genet på kromo-som 1 koder for alkalisk phosphatases vævs uspecifikke isoenzym, som vi finder i lever, knogler og nyrer. Da ALPL-genet koder for flere isoenzymer, katalyserer alkalisk phosphatase omdannelsen af forskellige substrater såsom DNA, RNA, proteiner samt små molekyler indeholdende fosfat.
Den enzymkatalyserede proces, hvor substrat omdannes til produkt, kan beskrives ved Michaelis- Menten-modellen. Omdannelsen sker med reaktionshastigheden v, som beskriver tilvæksten af pro-dukt pr. tilvækst i tid.
Ud fra modellen kan Michaelis-Menten-ligningen udledes, som gælder i den initiale stationære fase, hvor det antages, at produkt og enzym ikke kan ”gendanne” enzymsubstratkompleks samt at sub-stratkoncentration er langt større end enzymkoncentrationen, således at enzym-substratkoncentra-tionen holdes konstant. Ligningens parametre, V max M max og K
, fortæller om enzymets aktivitet. V er den hastighed, som enzymet hurtigst kan katalysere reaktionen med. For at få den maksimale ha-stighed, skal alt enzym være bundet til substrat, hvilket vil sige, at enzymsubstratkoncentrationen holdes konstant. Michaelis konstanten K
M finder man ved forholdet mellem koncentrationerne af enzym, substrat og enzym-substratkompleks. Konstanten gælder i den initiale stationære tilstand, og den beskriver enzymets effektivitet af substratbinding. En lav K
M
-værdi indikerer en høj effektivi-tet, mens en høj K
M
-værdi modsat indikerer en lav effektivitet.
Gennem forsøget ”Enzymkinetik for enzymet ’alkalisk fosfatase’” har jeg bestemt V - og K - max M værdien for alkalisk phosphatases katalyse af substratet para-nitrophenylphosphat til produktet pa-
Side 29
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
26 ra-nitrophenol, hvor enzymet her stammer fra bovint tarmepitel. Disse parametre kan bestemmes ved måling af produktets absorptionsspektrum ved varierende substratkoncentrationer, hvorefter Michaelis-Menten-ligningen tilpasses initialhastighederne (tangenthældningerne) for spektrene.
Alkalisk phosphatase fundet i tarmepitel fra kvæg kan altså omdanne para-nitrophenylphosphat til
para-nitrophenol med en maksimal hastighed på 951,7𝜇M/min. Med en K -værdi på 327,7𝜇M, har
M enzymet altså en effektiv substratbinding. Ved en antagelse af at dette gælder alkalisk phosphatase generelt, må jeg konkludere enzymet alkalisk phosphatases aktivitet til at være høj. Den høje aktivi-tet betyder også, at der følger store konsekvenser, hvis enzymet ikke virker, som det skal. Et mute-ret ALPL-gen, typisk forårsaget af en missense mutation, fører til en ændret enzymstruktur, så sub-stratbindingen bliver mindre effektiv. Herved bliver phosphat ikke fraspaltet, hvilket blandet andet er nødvendigt for knogledannelse. Den manglende enzymaktivitet kan altså fører til alvorlige syg-domme som hypophosphatasia med symptomer som smertefulde tandtab, smerter i knogler, musk-ler og led, knogleskørhed samt mange flere. Netop for at undgå dette er alkalisk phosphatases funk-tion og aktivitet så vigtig.
Side 30
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
27
LITTERATURLISTE
- Anonym, Alkaline Phosphatase, Liver/Bone/Kidney, Genecards.org <http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=ALPL>
(Sidst besøgt d. )
- Anonym, Everyday with HPP, Cheshire: Alexion, 2014
<http://www.hypophosphatasia.com/index.php/getting-to-a-diagnosis-of-hpp/getting-to-a-
diagnosis-of-hpp>
(Sidst besøgt d. )
- Anonym, Hypophosphatasia: the mutations in the tissue-nonspecific alkaline phosphatase gene, USA: PubMed.gov, 2000
<https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/>
(Sidst besøgt d. )
- Bruun, Kim, m.fl., Grundbogen i Bioteknologi 1, København, Gyldendal, 2014
- Bugge, Carsten S., m.fl., Bioteknologi 2, Århus: Nucleus, 2010
- Christensen, Ulla, m.fl., Introduktion til enzymkinetik, København: Kemi Forlaget, 2005
- Clausen, Flemming, m.fl., Gyldendals gymnasiematematik A, København: Gyldendal, 2012
- Egebo, Lone A., GENETIKBOGEN B+A, Århus: Zeuner Grafisk as, 2015.
- Haunsø, Stig, m.fl., MEDICINSK KOMPENDIUM, København: Arnold Busck, 2013
- Kristiansen, Luise C., Biotech, 2015
<http://www.biotechacademy.dk/Undervisningsprojekter/Gymnasiale- projekter/enzymer/teori/enzymer>
(Sidst besøgt d. )
- Kristiansen, Luise C., Biotech, 2015
<http://www.biotechacademy.dk/Undervisningsprojekter/Gymnasiale- projekter/enzymer/teori/enzymer/enzymkinetik>
(Sidst besøgt d. )
- Larsen, Vagn J., m.fl., Biologiens ABc, Tåstrup: Niche, 2008
- Nielsen, Lars B., m.fl., Alkalisk fosfatase i undervisningen, Valby: LMFK-bladet, 2011
<https://www.lmfk.dk/artikler/data/artikler/1104/1104_63.pdf>
(Sidst besøgt d. )
- Nielsen, Ole V., m.fl., BASISKEMI A, København: Haase & søns forlag, 2011
Side 31
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
28
- Rønning, Asle, Kortlægning af gener sker hurtigere end nogensinde, Valby: Videnskab.dk,
2012
<http://videnskab.dk/teknologi/kortlaegning-af-gener-sker-hurtigere-end-nogensinde>
(Sidst besøgt d. )
- Schmidt, Iver, m.fl. Katalyse, Lyngby: Haldor Topsøe A/S, 1999
- Torp, Kresten C., Biokemibogen, Århus: Nucleus, 2012
- Wolsing, Martin, m.fl., Biolex, Århus: Nucleus, 2002
- Forsøgsvejledning: Nielsen, Marianne S., m.fl., Enzymkinetik for enzymet ‘alkalisk fosfata-se’
Side 32
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
29
BILAG
48 BILAG 1: Enzymers klassifikation
Klasse Reaktionstype
Oxidoreduktaser Redoxreaktioner, dvs. overførsel af elektroner fra et molekyle til et andet Transferaser Overfører en funktionel gruppe fra et molekyle til et andet
Hydrolaser Spalter molekyler under samtidig optagelse af vand
Lyaser Spalter molekyler ved andre reaktionstyper end oxidation eller hydrolyse
Isomeraser Flytter atomer eller atomgrupper inden for molekylet
Ligaser Binder to molekyler sammen. Ligaser kaldes også syntetaser
Tabellen viser en oversigt over, hvilke reaktionstyper de seks forskellige enzymklasser hver især katalyserer.
BILAG 2: Faktorers påvirkning^{49}Ud fra grafen på figur 11^{50} kan vi se, at jo mere sub-strat der er, desto højere er enzymaktiviteten. Dette gælder indtil enzymerne arbejder ved deres maksimale hastighed for den givne enzymkoncentration, da en-zymerne her alle allerede er ”optagede” af substrat. På grafen kan det ses ved, at kurven flader ud.
48
Orange, s. 66
49
Biologiens ABc, s. 34-35
50
http://leavingbio.net/enzymes.htm
Figur 11. Grafen viser enzymaktiviteten (anden aksen) som funktion af substratkoncentration
(første aksen).
Side 33
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
30
Ud fra grafen på figur 12^{51} kan vise, at reaktionshastigheden er pro-portional med enzym-koncentrationen. Dvs. jo mere en-zym, desto højere aktivitet. Dette gælder under antagelse af, at der er mere substrat end enzym.
Ud fra grafen på figur 13^{52} kan vi se, at enzymaktiviteten stiger med temperaturen, indtil en maksi-mal aktivitet nås. Det skyldes, at sammenstød mellem substrat og enzym sker hyppigere ved højere kinetiske energier. Energien øges med temperaturen.
Ved den maksimale aktivitet har enzymet sit temperaturoptimum. Ved temperaturer højere end op-timummet vil enzymerne denaturere, og aktiviteten falder derfor brat.
51
https://biotekroedovre.wikispaces.com/Enzymkoncentration
52
http://www.wikiwand.com/de/Thermostabilität
Figur 12. Grafen viser enzymaktiviteten (anden aksen) som funktion af enzymkoncentrationen (første aksen).
Figur 13. Grafen viser enzymaktiviteten (anden aksen) som funktion af temperaturen (første aksen).
Side 34
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
31
Grafen på figur 15^{53} viser den symmetriske sammenhængen mellem pH og enzymaktivitet. HvilkenpH enzymer arbejder mest effektivt ved, pH-optimummet, varierer fra enzym til enzym, og afhæn-ger af det omgivende miljøs pH.
Enzymets tredimensionelle struktur påvirkes af pH-værdien, idet aminosyrernes sidegruppers lad-ninger ændres. Dette påvirker bindingerne, som holder på tertiærstrukturen, og formen på det aktive centrum ændres derved, så det (måske) ikke længere passer til substratet.
BILAG 3: K_{M} -værdier^{54}Enzym Substrat K (mM)
M
Catalase H O 1100
2 2
Carbonsyreanhydrase CO 12
2
Lysozym Carbohydrater i bakteriecelle- 8 vægge
Lactase -lactose 0,6
D
Penicillinase Benzylpenicillin 0,050
Tabellen viser nogle K -værdier for forskellige enzymer. Den benyttes til tolkning af den bestemte M
K -værdi for alkalisk phosphatase på 327,7𝜇M. Omregnes dette til millimolær (tabellens enhed), M fås 0,3277mM, hvilket er en lille K
M
-værdi sammenlignet med tabellens andre værdier.
53
http://paribiology.blogspot.dk/2011/05/210-effect-of-ph-on-rate-of-reaction.html
54
Nielsen, s. 183
Figur 14. Grafen viser enzymaktiviteten (anden aksen) som funktion af pH (første aksen).
Side 35
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
32
BILAG 4: Forsøgsvejledning til ”Enzymkinetik for enzymet ’alkalisk fosfatase’”
Formål
At bestemme K og V for et enzym.
M max
Teori
Alkalisk fosfatase (Alkaline Phosphatase, AP) defosforylerer især DNA, RNA og proteiner (dvs.
fjerner fosfat-grupper). AP har som navnet antyder basisk pH-optimum. AP findes overalt i bl.a. dyr og bakterier. Det findes i alle væv, men hos pattedyr især i galde, lever, nyre, knogler og placenta
(moderkagen). I medicinsk sammenhæng er det en blodmarkør for bl.a. galdesten og kræftsyg-domme som knogle- og prostatakræft.
Figur 15. Alkalisk fosfatase fra humant tarmepitel
Bovint (kalve-) AP er et glykoprotein, dvs. indeholdende kulhydrat. Det er en dimer, og hver pep-
tid-monomer har en molar masse på 69000 g/mol og indeholder metalionerne zink og magnesium.
Det spalter fosfatestre (se figuren herunder) under medvirken af vand. Reaktionen er altså en hydro-lyse og enzymet er en hydrolase. I laboratoriet anvendes følgende reaktion som mål for AP-niveauet:
Side 36
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
33
Figur 16. Reaktionsskema for AP’s defosforylering
Substratet 4-nitrophenylfosfat spaltes af enzymet AP til 4-nitrophenol og fosfat. Produktet 4- nitrophenol er gult, og dannelsen af det kan måles spektrofotometrisk ved 405 nm, idet absorbansen
-1 -1 for 4-nitrophenol følger Lambert-Beers lov med ekstinktionskoefficienten 18600 M cm .
Hvis der er meget substrat gælder det, at jo mere produkt der dannes jo større har enzymmængden været.
(Substratet kaldes også para-nitrophenylphosphat (pNPP), og produktet kaldes para-nitrophenol
(pNP)).
Enzymer karakteriseres ved deres effektivitet til at spalte substrater. Ofte anvende Michaëlis- Menten kinetik til karakteriseringen, og da vil K
M max og V være parametre for enzymets evne til at omdanne substrat.
Michaëlis-Menten ligningen kan skrives på to måder:
𝑣 = og 𝑣 =
𝑉_{𝑚𝑎𝑥} 𝑉_{𝑚𝑎𝑥} ∙ [𝑆]1 +
𝐾_{𝑀}[𝑆]
[ 𝑆] + 𝐾_{𝑀}hvor v er initialhastigheden (begyndelseshastigheden) for reaktionen, [S] er substratkoncentratio-nen, V max M enzymets maximale hastighed og K er den substratkoncentration, der giver den halve
V.
max
Dvs. K og V bestemmes ved en række målinger af initialhastigheden for reaktionen, hvor man M max varierer [S] og holder alt andet konstant. Enzymet skal have en sådan koncentration, at der er et
55 lineært reaktionsforløb i starten, så v kan bestemmes sikkert.
Hypotese
56 Alkalisk fosfatases reaktion med pNPP følger Michaëlis-Menten kinetik.
55
Forsøgsvejledning
56
Forsøgsvejledning
O_{2} N O + H_{2} OP
O
O^{-} APO^{-}O_{2} N OH +OH
P
O
O^{-}O^{-}Side 37
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
34
Materialer
Forberedelse inden forsøget:
Inden forsøgets kunne begynde, skulle vi først lave en Tris-opløsning, DEA-buffer, enzym- og sub-stratopløsning.
Fremgangsmåden for fremstilling af disse opløsninger er beskrevet herunder.
Tris-opløsning
Da Tris har molarmassen 121,14 g/mol, afvejede vi 12,117 g Tris, hvad der ideelt set skulle være
12,114 g. Vi hældte den nøje afvejede mængde Tris op i en 1L målekolbe, som vi indstillede med demineraliseret vand. Herved fik vi en 100mM Tris-opløsning. Af denne tog vi 100mL til en ny 1L målekolbe. I den nye målekolbe tilsatte vi ca. 400mL deminirealiseret vand, således at målekolben var halvt fyldt. Ved hjælp af 1M HCl indstillede vi opløsningens pH til en pH-værdi på 8. Igen ind-stillede vi målekolben med demineraliseret vand, hvorved vi fik en 10mM Tris-HCl buffer med pH
8.
DEA-buffer
For at fremstille DEA-bufferen bestående af 1 M Diethanolamin (DEA) og 1mM MgCl og med en
2 pH-værdi på 9,8, lavede vi først magnesiumchlorid-opløsningen. Da den molare masse af MgCl ∙6
2
H O er 203,32 g/mol, afvejede vi først 20,33 g af dette. Vi hældte den afvejede mængde op i en
2
100mL målekolbe, som vi indstillede med demineraliseret vand, således at vi nu havde en 1M mag-nesiumchlorid-opløsning. Af denne afpipetterede 100𝜇L til en ny 100mL målekolbe.
Herefter afvejede vi 10,54 g DEA, hvad der ideelt set skulle være 10,51 g, da DEA har en molar-
masse på 105,14 g/mol. Den afvejede mængde DEA hældte vi i den 100mL målekolbe indeholden-
de 100𝜇L magnesiumchlorid-opløsning. Målekolben fyldte vi herefter halvt med demineraliseret
- Tris: 10 mM Tris-HCl, pH 8
- DEA-buffer: 1 M Diehtanolamin (DEA),
1 mM MgCl, pH 9,8 - Plastickuvetter: 2 mL
2
- Enzym: Alkalisk Fosfatase fra Kvæg- - Spektrofotometer: Ocean Optics
tarmepithel, Sigma P6774, 5 DEA U/mL - Lab Pro samt computer med Logger Pro
- Substrat: 15 mM pNPP, Sigma S0942 i
Tris
- Automatpipetter med dertilhørende spid-ser: 2-20 µL, 20-200 µL, 200-1000 µL
Side 38
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
35 vand. Ved hjælp af 2M HCl indstillede vi opløsningens pH til en pH-værdi på 9,8. Igen indstillede vi målekolben med demineraliseret vand, hvorved vi fik en DEA-buffer med pH 9,8.
Substrat-opløsning
I 10mL Tris opløste vi 11 piller substrat (pNPP), som hver vejede 5 mg. Da substratet skulle være helt opløst inden forsøgets start, lod vi Tris-substrat-opløsningen stå under omrøring i en time. Vi pakkede glasset med Tris-substratopløsningen ind i sølvpapir grundet risiko for autohydrolyse. Af samme årsag opløste vi substratpillerne i en Tris-opløsning med en forholdsvis neutral pH.
Enzym-opløsning
Lige inden forsøgets start fortyndede vi enzymet leveret som 40.000 DEA U/mL 400 gange. Det
gjorde vi ved at afpipettere 2,5𝜇L enzym til et eppendorfrør sammen med 1000𝜇𝐿 10mM Tris-
opløsning med pH 8. Herved fik vi en 100 DEA U/mL enzym-opløsning.
Under forsøget:
HUSK:
- Det er vigtigt at arbejde rent og skifte spidser.
- Man må ikke komme enzym i substratet ved en fejl; skift spids ved den mindste tvivl!
- Prøveblandingen skal være godt blandet før målingen startes. Rør rundt med en pipettespids.
Man kan godt være nogle sekunder om det. Pas dog på ikke at få skabt luftbobler i kuvetter-
57 ne. Det forstyrrer målingen!
Spektrofotometri:
Ved hjælp af et spektrofotometer kan man lave et absorptionsspektrum for et stof, såfremt stoffet ikke er farveløst. Det fungerer på den måde, at et lys sendes igennem en kuvette indeholdende op-løsningen, som vi ønsker at undersøge – det vil sige en opløsning hvori der foregår den enzymkata-lyserede proces, hvor pNPP omdannes til pNP. Intensiteten af lyset ved en bestemt bølgelængde måles efter lyset har passeret kuvetten, og ved en kalibrering af spektrofotometret får vi absorban-sen.
Da vi ønsker at finde hastigheden for dannelsen af produktet, og da produktet 4-nitrophenol er gult, bestemmer vi produktets absorptionsspektrum. Lambert-Beers lov fortæller, at der er ligefrem pro-
57
Forsøgsvejledning
Side 39
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
36 portionalitet mellem absorbansen betegnet med A og koncentrationen af den målte opløsning be-tegnet med c.
𝐴 = 𝜀_{𝜆} ∙ 𝑐 ∙ ℓℓ er lysvejen, hvilket vil sige bredden af den kuvette, som opløsningen er i. Ekstinktionskoefficien-ten (absorptionskoefficient) er proportionalitetskonstanten og betegnes med 𝜀
58 Konstantens værdi varierer fra stof til stof og er forskellig ved forskellige bølgelængder.
Da der er tale om tilvækst i produktkoncentration og absorbans pr. tidsenhed, kan Lambert-Beers lov omskrives til følgende:
Lambert-Beers lov er her brugt til beskrivelse af reaktionshastigheden i den enzymkatalyseret pro-ces’ initiale stationære tilstand.
Udførelse af forsøget:
Vi sluttede spektrofotometret til en strømforsyning samt til en computer med Logger Pro. Vi tændte spektrofotometret og lod det varme op i 10 minutter. Imens startede vi Logger Pro.
Vi kalibrerede med demineraliseret vand under ”Experiment 🡪 Calibrate”, og lavede herefter et absorptionsspektrum for at finde bølgelængden med maksimal absorbans. Bølgelængden var her
405 nm. Vi indstillede derfor Logger Pro til at måle absorbansen ved en bølgelængde på 405 nm.
Herefter valgte vi tidsbaseret måling med 1 måling pr. sekund i 100 s under ”Event with Entry”.
Ved brug af automatpipetter blandede vi i otte forskellige 2mL kuvetter DEA-buffer, demineralise-ret vand og substratopløsning efter blandeskemaet vist herunder. Vi nulstillede spektrofotometret og tilsatte enzymet. Vi blandede grundigt den første kuvettes indhold i nogle sekunder ved brug af pi-petten og startede straks målingen herefter. Målingen stoppede efter 100 sekunder, hvor vi iagttog, om der var luft i kuvetten, samt om farven så fornuftig ud (gul). Da det så fornuftigt ud, tilføjede vi en tangent til kurvens første lineære stykke under ”Analyze 🡪 Tangent” samt noterede hældningen af tangenten i resultatskemaet. På samme måde målte vi absorbansen af bølgelængden ved de reste-rende syv prøver.
58
Bruun, Kim, m.fl., Grundbogen i Bioteknologi 1, København, Gyldendal, 2014, s. 72
𝑣 =
𝑎_{𝑡}
𝜀_{𝜆} ∙ ℓSide 40
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
37
Blandeskema^{59}Prøve DEA-buffer Vand mM U/mL koncentration
Substrat, 15 Enzym, 5 Substrat-
nr. | µL | µL | µL | µL | μM 1 | 1000 | 975 | 5 | 20 | 37,5 2 | 1000 | 970 | 10 | 20 | 75 3 | 1000 | 960 | 20 | 20 | 150 4 | 1000 | 950 | 30 | 20 | 225 5 | 1000 | 940 | 40 | 20 | 300 6 | 1000 | 900 | 80 | 20 | 600 7 | 1000 | 820 | 160 | 20 | 1200 8 | 1000 | 340 | 640 | 20 | 4800
Substratkoncentrationerne er beregnet efter formlen:
3
𝑛 𝑐 15 ∙10
1
𝑐 ( 𝑆 ) = = = dvs. c(S)=15 ∙𝑉
1
𝑉∙𝑉_{1} 𝜇𝑀∙𝑉_{1} 𝜇𝑀𝑉 1000𝜇𝐿 𝜇𝐿
Data
Figuren viser absorptionsspek-trummet for para-nitrophenol. Vi kan se, at den maksimale absorpti-on er ved en bølgelængde på
405nm, hvilket er årsagen til, at det er absorbansen af denne bølge-længde, som vi måler på. Værdien af ekstinktionskoefficienten for para-nitrophenol ved bølgelængden
405 nm er 18600 M^{-1} cm^{-1}.59
Forsøgsvejledning
Figur 17. Absorptionsspektrum for para-nitrophenol
Side 41
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
38
Figur 18. Absorbans af bølgelængde på 405nm (y-aksen) som funktion af tid målt i sekunder (x-aksen) for otte prøver med forskellige substratkoncentrationer.
Figuren viser, produktets absorbans af en bølgelængde på 405nm som funktion af tiden efter en-zymtilsætningen for hver af de otte målinger. Absorbansen er et mål for produktdannelsen grundet proportionalitet mellem absorbans og produkt beskrevet i Lambert-Beers lov. Hvilken substratkon-centration der hører til hver graf fremgår af tabellen under resultater. Graferne viser, at jo højere substratkoncentrationen er, desto højere er initialhastigheden, og at de stiger, indtil reaktionerne når deres maksimale hastighed. Grafernes udsving efter den initiale fase må skyldes, at substratkoncen-trationerne ikke længere er højere end enzymkoncentrationerne.
Side 42
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
39
Resultatskema
Prøve nr. Substratkoncentration Tangenthældning Initialhastighed
𝜇 M (∆A/∆t) 𝜇 M/min
s^{-1}1 37,5 0,02101 67,78
2 75 0,02739 88,36
3 150 0,04710 151,9
4 | 225 | 0,1302 | 420,0 5 | 300 | 0,1793 | 578,4 6 | 600 | 0,2049 | 661,0
7 1200 0,2347 757,1
8 4800 0,2618 844,6
V: 951,7𝜇M/min
max
K: 327,7𝜇M
M
Databehandling
For at bestemme initialhastighederne ved de otte forskellige substratkoncentrationer åbnes en ny fil i Logger Pro. Heri indskriver vi substratkoncentrationen som X og absorbansændring pr. sekund
som Y. For at omregne Y til initialhastigheden v målt i μM/min ganger vi Y med 3226 i en ny kal-
0 kuleret kolonne under ”Data 🡪 New Calculated Column”. I feltet ”Equation” indskrives formlen
”Y”*3226. Resultaterne heraf er vist i resultatskemaet under Initialhastighed.
At vi ganger med netop 3226 skyldes, at tangenthældningen ganges med 10^{6} for omregning fra mo-lær til mikromolær, ganges med 60 for omregning fra sekund til minut og divideres med ekstinkti-
onskoefficienten på 18600 M^{-1} cm^{-1} samt divideres med lysvejen på 1cm:𝑣_{0} = 𝑎_{𝑡} ∙ = 𝑎_{𝑡} ∙ 322610^{6} ∙ 60
18600𝑀^{−1} 𝑐𝑚^{−1} ∙ 1cmI Logger Pro’s graffelt vælger vi herefter ”Options 🡪 Graph Options 🡪 Y-axis: Initialhastighed”.
Herved får vi initialhastigheden (den nye kalkulerede kolonne) som Y-akse.
Ved at indskrive Michaelis-Menten-ligningen: V*x/(x+K), hvor V er v, x er substratkoncentrati-
max
onen, og K er K, under ”Analyze 🡪 Curve Fit 🡪 Define funktion: V*x/(x+K) 🡪 Try Fit” tegner
M
Side 43
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
40 vi en regressionskurve over datasættet, hvor X er substratkoncentrationen, og Y er initialhastighe-den. Med andre ord laver vi en kurvefitning til Michaelis-Menten-ligningen, hvorved parametrene v og K samtidig beregnes.
max M
Figur 19. Kurvefitning til Michaelis-Menten-ligningen samt bestemmelse af v_{max} og K_{M}. På x-aksen er substrat-
koncentrationen målt i 𝝁M, og på y-aksen er initialhastigheden v_{0} målt i 𝝁M/min.v er bestemt til at være 951,7𝜇M/min, og K er bestemt til at være 327,7𝜇M, hvilket også frem-
max M går af resultatskemaet. v fortæller, at den maksimale reaktionshastighed for hydrolyse af pNPP max
til pNP er 951,7 𝜇M/min. K har værdien 327,7𝜇M, hvilket er en relativ lille K -værdi. Det bety-
M M der, at enzymkoncentrationen er lav, mens enzym-substratkoncentrationen er høj, og alkalisk phosphatases substratbinding er altså derfor effektiv.
Fejlkilder
Da der er afvigelser mellem kurven tegnet ud fra Michaelis-Menten-ligningen og det målte data, må vi antage at forsøget indeholder en fejlkilde eller en måleusikkerhed, men da vi ikke har et specifikt resultat for V og K er det vanskeligt at sige noget om fejlkildernes størrelse.
max M
Side 44
[navn fjernet] 3z14 [navn fjernet] Gymnasium
SRP: Enzymkinetik
41
Under forsøgets udførelse har vi ikke målt temperaturen, men da både enzym og substrat har stået på køl, og da alkalisk phosphatase har et temperaturoptimum omkring 37℃, har enzymerne ikke arbejdet ved v. Den lave og ”upræcise” temperatur kan være med til en forklaring af afvigelserne max mellem forsøgets resultater og Michaelis-Menten-ligningen.
En anden fejlkilde kan være, hvis enzym og substrat allerede har reageret med hinanden inden må-lingens påbegyndelse, så vi ikke længere befinder os i den initiale stationære tilstand.
Holder antagelsen om at det katalytiske trin ikke kan forløbe i den modsatte retning i starten af re-aktionens forløb ikke stik, indeholder forsøget også en systematisk fejlkilde, da Michaelis-Menten-modellen herved ikke kan beskrive enzymaktiviteten i rent praktisk.
Konklusion
Ved anvendelse af Michaelis-Menten-ligningen til behandling af forsøgets resultater kan vi se, at alkalisk phosphatase følger enzymkinetikken beskrevet af Michaelis og Menten. Ved bestemmelse af V ud fra forsøgets resultater, kan vi konkludere, at alkalisk phosphate kan omdanne pNPP til max
pNP med en maksimal hastighed på 951,7𝜇M/min. Derudover har vi bestemt K til at have en vær-
M di på 327,7𝜇M. Den relative lille K
M
-værdi betyder at enzym-substratkomplekskoncentrationen har været stor, og vi kan derfor konkludere, at alkalisk phosphatase er et effektivt enzym til at binde substrater. Det betyder også, enzymet har en god evne til at spalte substrater til produkter og der-med en effektiv katalyse. Med andre ord er alkalisk phosphatases aktivitet høj.
Se opgaven i originaldokumentet eller gå til tekstens begyndelse.
Materialet
Fuld skærmOpgaven åbner, når du ruller ned til den.