UV-stråling og mutationer hos gær | Rapport

Side 1

1

U U V V - - B B E E S S T T R R Å Å L L I I N N G G A A F F G G Æ Æ R R

Formål:

• At inducere mutationer hos gærceller ved hjælp af UV-stråling.

• At vise at UV-stråling kan virke dræbende.

• At belyse teorien om at UV-stråling kan fremkalde skader på DNA.

Teori:

Skadetyper på DNA i forbindelse med UV- bestråling:

Ved UV- bestråling af gærceller kan der opstå flere forskellige typer af skader på DNA- strukturen.

UV- lyset absorberes af elektroner, som binder atomer sammen til molekyler. Disse spaltes derfor til mindre dele, da bindinger i DNA, RNA eller enzymer brydes. På kopiark 43 ses en oversigt over mulige skadetyper på DNA i forbindelse med UV- bestråling.

a) To baser, der sidder ved siden af hinanden kan, ved UV- bestråling, bindes til hinanden ved en såkaldt dimerdannelse. Disse bindinger kan kun ske mellem to thyminbaser, to cytosinbaser eller mellem en thymin- og en cytosinbase. En dimerdannelse kan også opstå mellem DNA’ets to dobbeltstrenge, altså mellem to baser i hver sin DNA- streng, der er forskudt i forhold til hinanden på grund af baseparringsprincippet, hvor En thyminbase aldrig vil side overfor en anden thyminbase eller cytosinbase. Illustrationen kan altså godt være lidt misvisende idet man ikke ser DNA- strengen tredimensionalt.

b) Vand kan gå i forbindelse med en thymin- eller cytosinbase ved en hydration, som ses øverst på tegningen.

c) Der kan ske et brud i selve DNA- kæden, altså mellem fosfat - kulhydrat bindingerne, som logisk nok kaldes et kædebrud.

d) Brydes en af de svage hydrogenbindinger mellem baseparrene i DNA kaldes mutationen en denaturering. Både hydration og dimerdannelse kunne ikke forekomme uden at der først er tale om lokal denaturering.

e) Den værste skade UV-bestråling kan medføre er, at DNA- molekylets replikation kan blokeres, ved at DNA- polymerase mister sin virkning. Som følge heraf vil cellen ikke få transporteret nyt DNA- materiale til evt. duplikerede celler, og væksten vil altså gå i stå.

Side 2

2

Den hyppigst forekomne mutation i forbindelse med UV- bestråling er dimerdannelse, og særligt dimerdannelsen mellem to thyminbaser.

Som nævnt kan der også forekomme skader på RNA og proteiner, men da disse strukturer findes og produceres i stort omfang i cellen, skal der et meget stort antal skader til før det har nogen indvirkning på cellen.

DNA’ets reparationsmekanismer:

Cellen har en række måder at beskytte sig mod skader på DNA’et, for det første ved hjælp af pigmentdannelsen i hudcellerne, der delvist beskytter mod ioniserende stråling, og andre skadelige påvirkninger. Hvis der i en celle opstår en af ovenstående mutationer på DNA’et kan det få flere forskellige konsekvenser for den pågældende celle.

Ved bestråling af en celle kan der ske tre forskellige ting:

Cellen kan forbrænde den ioniserende stråling således at der ikke sker nogen skade på cellen.

Skader ved ioniserende stråling opdeles i somatiske skader og skader på DNA’et. Er der tale om en somatisk skade vil cellen enten gå til grunde, eller den vil overleve ved hjælp af de reparationsmekanismer, der er tilknyttet cellen. Er der tale om en skade på DNA’et kan dette også være letalt for cellen, eller reperationsmekanismerne kan udbedre skaden mere eller mindre. Er der tale om en perfekt reparation, er der naturligvis ingen problemer, men hvis der er tale om en fejlreparation hvor cellen overlever, kan det få konsekvenser senere i cellens liv. Hvis fejlreparationen er sket i en kønscelle vil fejlen sandsynligvis overføres til afkommet, hvor den vil have større betydning for udviklingen af fosteret. Er der tale om en somatisk celle kan denne gå til grunde ved en celledeling, eller forårsage fejlfunktion f.eks. i form af kræftegenskaber. På kopiark

45 er et af DNA’ets reperationsmekanismer vist, i form af et enzymsystem der kan fjerne dimerer.

Figuren viser hvordan et enzym binder sig til DNA’et i nærheden af dimerdannelse mellem to thyminbaser. Da det er et fotoaktivt enzym der er tale om, vil skaden udbedres ved absorption af lys i bølgelængdeområdet 330-600 nm. DNA- molekylet vil herved blive repareret, og da fejlen er komplet fjernet vil cellen igen kunne lave de nødvendige processer som transskription og replikation uden problemer.

Et andet eksempel på et reparationsenzymsystem er vist på kopiark 46. Denne reparation kan forekomme ved en hvilket som helst mutation i DNA. Reparationen går ud på, at beskadigede dele af DNA- molekylet bliver klippet ud og nye nukleotider indsættes. På figuren ses at der ved UV-stråling er opstået en thymindimer, hvorved denne skade udbedres ved hjælp af fire enzymer.

Side 3

3

Enzym A, der kaldes Endonuklease klipper DNA’molekylet op ved at bryde bindinger i strengen.

Enzym B, Exonuclease skærer den beskadigede del af DNA’et fri ved at fjerne nukleotiderne enkeltvis fra DNA- strengens ender. Enzym C, som er en polymerase indsætter nye nukleotider, efter opskrift fra den anden side af DNA- strengen. Baseparringsprincippet er altså en forudsætning for at nye nukleotider kan dannes korrekt. Enzym D er en ligase der klistrer DNA- strengen sammen, hvorefter den er så god som ny, medmindre der er tale om de nævnte fejlreparationer som f.eks. indsættelse af et forkert nukleotid.

Forsøgsorganismens genetik:

Forsøgsorganismen består reelt af to forskellige gærstammer. Der er tale om M46 og CG52. Disse er begge haploide stammer. M46 har et defekt gen ade 2, og et normalt gen ADE 1. CG52 har et defekt gen ade 1 og et normalt gen ADE 2. Da de to stammer har forskellige kønsgener kan man tvinge dem til at krydses, ved at sørge for at de ikke har tilstrækkelig næring i den agar de spredes ud på. Hver for sig er både M46 og CG52 rødfarvede på grund af gendefekten. Adeninsyntesen foregår nemlig således: ADE 1 → rødt mellemprodukt. ADE 2 → adenin.(hvide gærceller)

Heraf ses, at der er tale om en form for epistasi, hvor begge gener skal være til stede i deres dominante, ikke defekte form for at der kan dannes adenin. Hvis dette ikke er tilfældet ophobes det røde mellemprodukt og gærcellerne bliver røde.

Når M46 og CG52 spredes sammen ud på mangelagar vil disse gå sammen og danne en diploid celle. Denne vil så vokse og dele sig, så en gærcellekoloni opstår. Disse gærceller vil være hvide, da CG52 indeholdt genet ADE 1 mens M46 indeholdt genet ADE 2. Således bliver zygoten altså heterozygot med hensyn til egenskaben for adeninsyntesen.

Materialer:

Gærstamme: CG 52 X M46. Gasflamme.

Sterile petriskåle med YPD- substrat (agar) Sprit.

UV-lampe. | Stopur.
Pipetter. | Varmeskab.
Pipettehjælper. | Vand.

Drigalskispatel.

Side 4

4

Udførelse:

1. Fortyndinger af gærkulturen fremstilles. 9 ml. vand overføres til 1. ml. af den fortynding af

                                                                        -3  -4
gærkulturen der er en faktor 10 mere koncentreret. Således fremstilles fortyndingerne: 10 ,10

og 10^{-5}.
2. Fra glasset med 10^{-3} fortyndingen overføres 0,1 ml. til hver af de 12 petriskåle med agar.

3. Straks efter denne overførsel fordeles gærkulturen med en flamberet og afkølet drigalskispatel over hele petriskålens overflade.

4. Petriskålen mærkes med 10^{-3} fortynding.
5. Samme procedure gennemføres af fortyndingerne: 10^{-4} og 10^{-5}.

6. Petriskålene anbringes nu under den tændte UV-lampe.

7. Petriskålene modtager forskellig strålingstid under UV- lampen, således at en skål tages væk efter 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, og 100 sekunder. Desuden gøres en petriskål til ”kontrolskål” ved at den ikke modtager UV- stråling.

8. Herefter anbringes petriskålene i varmeskab ved 30°C i 3-5 døgn, hvorefter de tages ud, og de fremkomne kolonier kan inspiceres og optælles.

Resultater:

Antallet af gærceller, der er optalt i forsøget ved de tre forskellige fortyndinger og de forskellige strålingstider ses på resultatbilaget der er vedlagt. Her ses i øvrigt afbildning af de tre datasæt på en logaritmisk skala, hvor disse skulle fremkomme som rette linier, for at man kan antage at antallet af gærceller under UV-stråling er eksponentielt aftagende. Linierne vil nok ikke direkte bestemmes til at være rette linier, men dette skyldes, at optælling af gærkolonierne er meget svær at gennemføre, hvilket også ses på de tal i resultaterne der er markeret med gråt, da de angiver at tallene er skønnede, da der ikke var mulighed for at gennemføre en konkret optælling af disse petriskåle.

Herunder ses samme datasæt afbilledet i et diagram med en normal inddeling af akserne. Her ses bedre, at antallet af gærkolonier aftager eksponentielt med det antal sekunder de modtager UV-stråling. Endvidere kan vi se at grafen: antal gærceller pr. sekunder UV- stråling kan betegnes som

en naturlig logaritmefunktion på formen: y = b x e^{cx}

Side 5

5

Man kan diskutere hvilket diagram, der giver den bedste afbildning – den logaritmiske – eller den normale skala. Dette afhænger selvfølgelig af hvilket formål kurven skal bruges til. Fordelen ved den logaritmiske skala er naturligvis dekadeinddelingen, der gør resultaterne en del mere overskuelige, når man arbejder med værdier med stor afstand mellem, og disse stadig skal afbilledes præcist. Kurverne bliver herved heller ikke sammenpressede, som det er tilfældet i diagrammet herover. Fordelen ved den normale skala er at tendensen bedre kan observeres, især da vi har et sæt resultater, der er så usikre som disse.

For grafen her kan halveringskonstanten udregnes. Halveringskonstanten er i dette tilfælde det antal sekunder det tager, før antallet af gærcellekolonier er reduceret med 50%. Halveringskonstanten udregnes ved hjælp af den naturlige logaritmefunktions regneregler. Formlen for udregning af

halveringskonstanten ser således ud: T = hvor c kaldes den relative væksthastighed.

½ c

)5,0ln(

10^{-3} fortynding: 10^{-4} fortynding: 10^{-5} fortynding:

T = T = T =

½ ½ ½

− 0592,0 − 0557,0 − 0542,0

)5,0ln()5,0ln()5,0ln(

T = 11,71 sek. T = 12,44 sek. T = 12,78 sek.

½ ½ ½

Som det ses, er halveringskonstanten for alle tre fortyndinger meget tæt på hinanden, hvilket ikke kan overraske, da det er det samme ”stof” vi måler på, nemlig gærceller, blot ved tre forskellige fortyndinger. At halveringskonstanten ikke er ens for alle tre fortyndinger må skyldes de fejlkilder der har været i forbindelse med forsøget. Reelt må vi antage at UV- bestrålingen er lige skadelig om der er mange eller få gærceller til stede.

Side 6

6

Tegning af Mitosen med overkrydsning findes på bilag 2 og 3. Som det ses skal overkrydsningen finde sted efter duplikationen, da man ellers vil få en situation hvor både ADE 1 og ADE 2 er til stede i begge celler. Denne situation er skitseret på bilag 2. På bilag 3 ses en mitose hvor den ene celle som resultat har både ADE 1 og ADE 2 og dermed bliver en hvid koloni, hvorimod den anden celle kun har ADE 2, og altså bliver rød på grund af det defekte gen ade 1, der er til stede i homozygotisk form. Resultatet er her en tofarvet koloni. Ved forsøget kunne observeres, at der ved de tofarvede kolonier ikke var en ligelig fordeling af røde og hvide celler, men at der normalvis vil være flest hvide celler. Dette skyldes selvfølgelig at de røde celler ikke kan danne adenin.

Gærcellekolonierne lever jo nu på et vækstmedium der er komplet, altså får de tilført adenin fra agaren. Da de normale hvide celler også selv kan danne adenin vil disse selvfølgelig vokse hurtigere, dele sig hyppigere, og derved være dominerende i kolonien. De røde celler kan sagtens overleve, men de vil altså ikke få tilført tilstrækkeligt adenin, til at de kan følge med til udviklingen af de hvide celler.

Diskussion:

Fejlkilder:

• Den største fejlkilde må være at vi ikke har været i stand til at optælle gærcellerne nøjagtigt.

Dette giver stor usikkerhed omkring resultaterne og hvorvidt disse passer.

• En fejlkilde må også være at man, hvis man ikke havde kølet drigalskispatelen tilstrækkeligt af, kunne komme til at brænde nogle gærceller væk, da vi spredte dem ud på kompletmediumet.

Dette vil derfor give færre gærceller ved optællingen.

• En væsentlig fejlkilde ved optællingen er også, hvis man har medregnet eventuelt forkomne bakteriekolonier i optællingen. I resultatet vil der altså fremkomme flere gærceller end det reelt skulle være tilfældet.

• Unøjagtig afmåling ved fortynding af gærcellekulturen er også en væsentlig fejlkilde.

Analyse, vurdering og konklusion:

Analyserer vi resultaterne der er vedlagt på bilag 1 ses, at UV- stråling altså virker dræbende på gærcellekolonier, da det er tydeligt at antallet af gærceller reduceres efterhånden som disse får længere strålingstid. Vi fik også bestemt at antallet af gærceller var halveret efter ca. 12 sekunder.

Endvidere ses, at UV- stråling kan fremkalde mutationer på DNA’et som ses i form af røde kolonier. Tendensen er også klar: Jo stærkere fortynding af gærceller, altså jo flere gærceller der var

Side 7

7 i fortyndingen, jo flere mutationer. Dette er selvfølgelig klart, da der selvfølgelig opstår flere mutationer jo flere gærceller vi arbejder med. Endvidere må vi konstatere at disse tal er meget usikre. Det er væsentligt at bemærke at der udfra resultaterne kan ses, at der har været et problem med hensyn til fortyndingerne af gærcellerne. Reelt burde der blive ti gange mindre gærceller når der fortyndes ti gange. Ved kontrolskålen der ikke modtog stråling skulle der altså have været, hvis

der var 28 kolonier ved 10^{-5} fortyndingen, 280 i 10^{-4} fortyndingen, og 2800 i 10^{-3} fortyndingen. Da

dette ikke nær er tilfældet må vi konstatere at der også kan være store afvigelser i de øvrige skåle.

På trods af disse afvigelser fik vi induceret mutationer hos disse gærceller ved hjælp af UV-bestråling, hvorved det også viste sig at der fremkom mutationer på DNA- molekylet. Nogle af disse skader blev letale for cellerne, mens andre blot viste sig i form af rødfarvning af cellerne.

Selvom resultaterne var usikre fik vi også bestemt at antallet af gærceller aftager eksponentielt med antal sekunder strålingstid. Tendensen kunne altså sagtens ses, hvorved formålet blev opfyldt.

Diverse spørgsmål:

Hvad kan der været sket med en gærcelle siden den blev til en hel rød koloni?

Opstår der en hel rød koloni kunne det tænkes, at der var sket to overkrydsninger i stedet for den ene der er vist på bilag 3. Situationen er skitseret på bilag 4. Her ses at begge celler vil blive røde, da den ene har defektgenet ade 1, mens den anden har defektgenet ade 2.

Hvordan kan testen modificeres til at vise noget om solcremers beskyttende evne?

Skulle testen vise noget om solcremes beskyttende evne skulle vi have lavet to forsøg. Det ene forsøg skulle køre som det her har været tilfældet, mens vi i det andet forsøg skulle give gærcellerne lige så lang strålingstid som i det andet forsøg, men med et lag solcreme henover. Disse vil måske ikke kunne lægges direkte på gærcellerne, men det vil kunne smøres ud på låget, hvorved man efterfølgende kan optælle, om flere gærceller overlever i forsøget med solcreme.

Hvordan har man i øvrigt kunne finde ud af absorptionsspekteret hos DNA?

Ved at bruge fotospektrometeret og dennes bølgelængdeknap vil det være muligt, at finde frem til absorptionsspektret for DNA. Da man ser at jo større relativ absorption des mindre lys trænger ind til DNA’et, kan man ved at lave et absorptionsspektrum, iagttage ved hvilke bølgelængder der er størst relativ absorption. Denne kurve vil altså vise hvor stor en del af lyset ved de forskellige bølgelængder der absorberes i DNA’et.