Bestemmelse af Proteinindholdet i Mælk - Rapport i Kemi

Side 1

STX 3.g

Kemi A

Kemirapport:

Bestemmelse af protein i skummetmælk –

Biuretmetoden

Forsøgspartner: Rune Schrøder Motzkus

[navn fjernet], 3. b

Side 2

[navn fjernet], 3. b Kemi-rapport 10.01.11

Side 2 af 9

Formål:

Formålet med dette forsøg er vha. biuret-metoden at bestemme proteinindholdet i skummetmælk

                                                                         2+
spektrofotometrisk. Biuret-metoden tager sit udgangspunkt i komplexdannelse mellem Cu og

peptidbindingerne i proteiner.

Teori:

Proteiner og aminosyrer:

Mælk indeholder ligesom så mange andre fødevarer proteiner. Disse er opbygget af en række af aminosyrer, der er bundet sammen med bindinger, der kaldes peptidbindinger.

C CNH

2

O

O H

H

R

C CNH N C C N C C

2

O

H H O H

R H R

R

O

O H

H

Aminosyre Protein

Ovenfor er angivet en aminosyre, hvorpå der sidder en radikal, R. Ligeledes er der angivet en tripeptid, altså et protein opbygget af tre aminosyrer. Peptidbindingerne er markeret med en sort firkant. Et protein dannes ved en kondensationsreaktion, hvor der altså fraspaltes vand.

Biuretreagens og protein-komplexer

Biuretreagens indeholder Cu^{+} -ioner, der kan danne Cu^{2+} -protein-komplexer med nitrogenatomet fra

peptidgrupperne som ligander.

Disse dannede komplexer ses, idet de har en blåviolet farve og derved absorberer lys ved ca. 540 nm.

Intensiteten af farven og dermed absorptionen af lyset vil være proportional med hvor mange peptidbindinger, der er i opløsningen. Dette er så også proportionalt med proteinkoncentrationen.

Standardkurve:

Ligander: Et molekyle, som er i stand til at binde sig til og danne et kompleks sammen med et biomolekyle for at tjene et biologisk formål.

Side 3

[navn fjernet], 3. b Kemi-rapport 10.01.11

Side 3 af 9

En standardkurve er en kurve, der afbilder absorbansen, A som funktion af koncentrationen, [ ] F af

den farvede opløsning. Kurven er en ret linje med forskriften y=ax+b, der skal gå gennem ( ) 0, 0,
hvorfor b=0. Dvs. forskriften bliver y=ax. Linjens hældning er ⋅, dvs. a =⋅. Her er

ε ε ε

ekstinktionskoefficienten for den valgt bølgelængde i et bestemt stof med enheden^{−−}^{11} ⋅ Mcm og er

bredden af kuvetten, som stort set altid er 1 cm.

Ud fra en sådan standardkurve er det så muligt at beregne koncentrationen af en opløsning af samme stof ved en målt bølgelængde.

Hele denne standardkurve følger Lambert-Beers lov, der gælder ved små koncentrationer.

[ ]

A protein = ⋅ ⋅

ε hvor [ ] protein er den aktuelle proteinkoncentration af stoffet.

Materialeliste:

1 L målekålbe

Vægt

Vejebåde

Tragt

Magnetomrører

50 mL målekålbe

100 mL målekolbe

6 små bægerglas

5 mL pipette

10 ml. pipette

1 mL automatpipette

Tusch ε

⋅

A

[ ] protein / mg mL

Side 4

[navn fjernet], 3. b Kemi-rapport 10.01.11

Side 4 af 9

7 Reagensglas i stativ

Spektrofometer med computer og kuvetter

Kemikalier:

1,5 g Kobber(II)sulfatpentahydrat (CuSO ⋅5H O)
                                4  2

6,0 g Kalium-natriumtartrat (KNaC H O ⋅4H O, M = 282,23 g/mol)
                           4 4 6 2

300 mL 10% Natriumhydroxid (10% NaOH ≅ 2,772 M NaOH ≅ 208 mL 4M NaOH)

Demineraliseret vand

500 mg casein skummetmælk

Sikkerhedsforanstaltninger:

Brug kittel, briller og evt. handsker. Der skal arbejdes meget renligt og omhyggeligt for præcise resultater.

Fremgangsmåde:

Fremstilling af Biuret-reagens:

1, 5 g af kobbersulfaten opløses i demineraliseret vand i en 1 L målekålbe. Der tilsættes så 6,0 g kalium-natriumtartrat og herefter 300 mL 4M Natriumhydroxid. Der fyldes så op med demineraliseret vand til 1000 mL.

Fremstilling af 4 standardopløsninger til standardkurve:

For at få præcise resultater, skal der afvejes meget omhyggeligt. Der afvejes nøjagtig ca. 500 mg casein, som overføres til en 100 mL målekobe, der fyldes op til 100 mL med 0,02 M NaOH. Proteinet opløses ved magnetomrøring (tager lang tid). Denne opløsning er stamopløsning A, som hældes over i et bægerglas, der mærkes 1. Af glas 1 tages 5 mL med pipette og hældes over i et nyt bægerglas mærket 2, hvortil der tilsættes yderligere 5,00 mL 0,02 M NaOH. Af glas 2 tages 5 mL med pipette og hældes igen over i et nyt bægerglas mærket 3, hvortil der tilsættes yderligere 5,00 mL 0,02 M NaOH. Af glas 3 tages 5 mL med pipette og hældes igen over i et nyt bægerglas mærket 4, hvortil der tilsættes yderligere 5,00 mL 0,02 M NaOH. Man har så 4 opløsninger med forskellige proteinkoncentrationer.

Fremstilling af analyseopløsning med skummetmælk

Der afpipetteres 10 mL skummetmælk i hhv. en 50 mL målekolbe og en 100 mL målekolbe. Der tilsættes så 10 mL 0,1 M NaOH til begge målekolber, hvorefter de fyldes op til mærkerne med demineraliseret vand. Den i 50 mL målekolbe nummereres med 5 og den i 100 mL målekolbe nummereres med 7.

Fremstilling af måleopløsninger:

7 reagensglas mærkes med tallene fra 1-7 og med en 1,00 mL automatpipette tilsættes der 1,00 mL af hver af de 6 koniske kolber til det tilhørende nummererede reagensglas. I reagensglas 6 tilsættes der

Side 5

[navn fjernet], 3. b Kemi-rapport 10.01.11

Side 5 af 9

1,00 mL 0,02 M NaOH som blindprøve. Til hvert af de 7 reagensglas tilsættes 5,00 mL biuret-reagens med automatpipette. Opløsningerne blandes grundigt og stilles hen i ca. 30 min.

Optagelse af spektrum på spektrofotometer:

Først kalibreres spektrofotometeret med en kuvette med NaOH. Dernæst optages et scan-spektrum

med absorbansen som funktion af bølgelængden. Herved kan man finde ud af, hvor Cu^{2+} -

proteinkomplexet absorberer maximalt. Dette gøres i praksis ved at tage og overføre lidt af opløsningen fra reagensglas 1 (den mest koncentrerede) til en kuvette og få apparatet til at lave et scan. Kuvetten skal være ca. halvt fuld. Den skal vende så lyset sendes gennem den blanke side.

Spektret optages ved 900-300 nm.

Kvantitativ bestemmelse med spektrofotometer:

Spektret fra før indsættes i et graf program og toppunktet ( ) aflæses. Spektrofotometeret
                                                 max

λ

kalibreres igen med en kuvette med NaOH. Herefter indstilles det på den korrekte bølgelænge ( ).
                                                                               max

λ

Spektrofotometeret nulstilles så med blindprøven (reagensglas 6). Absorptionen af de andre opløsninger findes ved at overføre den til kuvetter og aflæse tallet for absorptionen, der fremkommer på displayet, når opløsningen er i. Resultaterne skrives så ind i et regneark.

Resultater og resultatbehandling:

Masse af afvejet casein: 498 mg.

Først skal det beregnes, hvor mange mg protein der findes i de bægerglas 1-5. Der afvejet 498 mg casein, som alt sammen er hældt i bægerglas 1, men den mængde i glas 2, skal så trækkes fra, da denne ikke er der længere. Dvs. man går ud fra, at der er 95 mL tilbage, når der udtages 5 mL. Ved så at finde antal mg pr. mL, og gange det med de 95 mL får man altså masse af protein i glasset.

( )

498 mg

m casein glas mL mg, 1 95 473,1 = ⋅ =

100 mL

I glas 2 er der – inden der er udtaget noget til glas 3 - forskellen mellem det tilsatte og det i glas 1

498 473,1 24,9mg mg mg−=

På samme måde som før divideres med 100 mL og ganges med 95 mL, fordi det er den volumen af opløsningen der er tilbage.

24,9 mg

⋅= 95 23, 7 mL mg

100 mL

På samme måde beregnes resten af masserne for bægerglas 1-4 (se bilag 1)

Tabelværdien for skummetmælk:

Side 6

[navn fjernet], 3. b Kemi-rapport 10.01.11

Side 6 af 9

Skummetmælk indeholder 3,5 g protein pr. 100 mL mælk.

Det beregnes altså på følgende måde, da vi har udtaget 10 mL

3,5 g

⋅ = = 10 0,35 350 mL g mg

100 mL

Koncentrationen af casein beregnes ved at dividere massen af casein med opløsningens samlede rumfang. For første bægerglas, hvor opløsningens volumen er 95mL ser beregningen ud som følgende m mg mg 473,1

c = = = 4,98

V mL mL 95

Se resultaterne i skemaet til højre.

Se bilag 1 for de resterende beregninger.

Absorptionsspektret for bægerglas 1 med den højeste (kendte) koncentration af casein er afbildet i TI- Interactive ud fra målepunkterne, der blev sendt til computeren. Absorptionsspektret som ses nedenfor har bølgelængden i nanometer ud af 1. aksen og absorbansen op ad 2. aksen.

Det ses her, at absorbansen afhænger af bølgelængden. Den første del af spektret kan ikke bruges, men toppunktet skal derimod aflæses, da denne bølgelængde efterfølgende skal bruges til at måle absorbansen for de andre opløsninger.

En funktion i TI-Interactive kan angive koordinatsættet for toppunktet, der er ( ) 561 , 0, 279. Det betyder altså, at absorbansen for de andre opløsninger skal måles ved

= 561nm

λ

Standardkurven:

Hvis resultaterne følger Lambert-Beers lov, er det muligt at lave en standardkurve. Denne laves i programmet TI- Interactive, hvor koncentrationen af de forskellige opløsninger er angivet i 1. kolonne i

tabellen i_{mL} og den målte absorbans af de forskellige opløsninger er angivet i 2. kolonne. Ud fra

mg

disse tal er der lavet en linær regression, da Lambert-Beers lov følger en lineær funktion, y=ax+b.

Denne er så afbildet som graf sammen med målepunkterne.

Bægerglas | Masse af | Koncentration af

casein mg

casein i_{mL}

i bægerglasset.

1 | 473,1 mg | 4,98
2 | 23,7 mg | 2,37
3 | 1,14 mg | 0,114
4 | 0,057 mg | 0,0057
5 | 350 mg | 7
7 | 350 mg | 3,5

Side 7

[navn fjernet], 3. b Kemi-rapport 10.01.11

Side 7 af 9

Det ses af grafen, at målingen af 5. prøve (altså ved 7 mg/mL) at denne ligger meget ved siden af, og er

                                                              2
med til at ændre grafen. Dette er bl.a. med til at forringe forklaringsgraden, r . Ligeledes skulle b-

værdien i forskriften, y=ax+b også have være 0. Dette skyldes også, at vores test-måling (nr. 6) skulle

have haft en absorbans på 0, men den har en på 0,094. Men i grove træk følger formlen Lambert-Beers lov, hvor

[ ]_{.}

AF = ⋅ ⋅

ε

Jeg vil så arbejde videre ud fra denne standardkurve, hvor koncentrationen af protein i skummetmælksopløsningen beregnes ud fra forskriften.

Absorptionen på glas 5 var 0,591. Denne indsættes så på f(x)’s plads i forskriften og x (som er koncentrationen) isoleres med TI-Interactives solvekommando.

Det vil altså sige, at koncentrationen af protein i skummetmælksopløsning 5 er

c = 8,55

mg mL

Absorptionen på glas 7 var 0,302. På samme måde indsættes denne på f(x)’s plads og x isoleres.

Det vil altså sige, at koncentrationen af protein i skummetmælksopløsning 7 er

c = 3, 52

mg mL

Tidligere er tabelværdien for casein beregnet ud fra det angivne på varedeklarationen. Afvigelsen til koncentrationerne beregnet ud fra tabelværdierne er som følgende:

Side 8

[navn fjernet], 3. b Kemi-rapport 10.01.11

Side 8 af 9

Opløsning 5: ⋅= 100 22,14%

8,55 7 mg mg −

7 mg

Opløsning 7: ⋅= 100 0,57%

3, 52 3, 5 mg mg −

3, 5 mg

Det er altså helt klart absorptionen ved opløsning 7, der er mest præcis. Det var da også meget tydeligt, da vi skulle aflæse, at ved opløsning 5, blev absorptionen ved med at stige. Koncentrationen var simpelthen for stor til at kunne måles nøjagtigt med spektrofotometeret.

Diskussion og fejlkilder:

I dette forsøg gælder det om at være meget omhyggelig i afmålingen i starten af forsøget, da det fortyndes mange gange og dermed er der tale om meget små koncentrationer. Dvs. små afvigelser i de første målinger vil få stor betydning efter 3. fortynding, da koncentrationen er så meget mindre der. Desuden gælder det også om at være præcis, når der pipetteres.

På standardkurven kan man se, at de målinger ved de høje bølge-længder ligger længere fra regressions-grafen, som de med lav bølgelængde. Det tyder altså på, at apparatet har svært ved at måle den præcise absorption, når der er tale om høje bølgelænder. Dog må det siges at være rimelig præcise målinger ved middelstore bølgelængde. En afvigelse på 0,57% må siges at være meget, meget præcis. Afvigelsen på de

22,14 % skyldes hovedsageligt apparatets evne til at måle præcis med høje bølgelængder, men derudover kan der være afpippetteret upræcist af det ene eller det andet stof.

Konklusion:

Forsøget gik ud på beregne koncentrationen af protein i skummetmælk ved at fremstille en standardkurve for nogle standardopløsninger og lave regression på dette, hvorefter absorbansen for skummetmælksopløsningen kunne indsættes heri og koncentrationen kunne isoleres.

Standardopløsningerne blev lavet ved at opløse casein i NaOH og lave forskellige fortyndinger af disse. På absorptionsspektret kunne toppunktet - hvor den største absorption af protein var - aflæses til 561 nm. Ved denne bølgelængde afmåltes de andre absorptioner og en standardkurve med afvigelser ved de høje koncentrationer fremkom. Koncentrationen af protein i opløsningerne blev beregnet med hhv. 22,14% og

0,57% afvigelse, hvor førstnævnte var ved en høj koncentration på 7 (tabelværdi) og sidstnævnte var mg mL ved en middel koncentration på 3,5 (tabelværdi).

mg mL

Side 9

[navn fjernet], 3. b Kemi-rapport 10.01.11

Side 9 af 9

Bilag 1:

Nummer 1 2 3 4 5 7 på bægerglas

Indhold af Opl. 5,00 mL 5,00 mL 5,00 mL 10,0 mL 10,0 mL protein A I II III Opl. B Opl. B

Indhold af 0 mL 5,00 mL 5,00 mL 5,00 mL 0 mL 0 mL

0,02 M

NaOH

Masse af 498 mg_{⋅} ( ) ( ) 24,9 23, 7 − mg_{⋅} 1, 2 1,14 − mg_{⋅} 3, 5 g_{⋅} 3, 5 g_{⋅}

casein 100 mL

95 mL 95 mL 10 mL 10 mL

100 mL 100 mL 100 mL 100 mL

= 473,1 mg = 350 mg = 350 mg

498 473,1 − mg

⋅ 95 mL

100 mL

= 23, 7 mg
= 1,14 mg

( )

95 mL

= 0, 057 mg

Koncentrat ion af protein i mg pr. mL

473,1 mg 23,7 mg 1,14 mg 0, 057 mg 350 mg 350 mg

95 mL 10 mL 10 mL 10 mL 50 mL 100 mL

= 4,98 = 2,37 = 0,114 = 0, 0057 = 7 = 3, 5

mg mg mg mg mg mg mL mL mL mL mL mL