SRP om doping med EPO i Biologi A og Kemi B

Side 1

Indholdsfortegnelse

1. Indledning ............................................................................................................................................... 1

2. EPO’s opbygning ................................................................................................................................... 1

2.1. Aminosyrer og Proteiner ................................................................................................................. 1

2.1.1. Proteiners struktur ..................................................................................................................... 2

2.2. EPO’s struktur ................................................................................................................................. 3

2.2.1. Fremstilling af rhEPO ............................................................................................................... 3

3. Proteiners fysiske og kemiske egenskaber ............................................................................................. 4

3.1 Syre-baseegenskaber ........................................................................................................................ 4

3.2 Isoelektrisk punkt ............................................................................................................................. 5

3.3 Proteins opløselighed i vand ............................................................................................................. 6

3.4. Proteiners koge- og smeltepunkt ..................................................................................................... 6

4. EPO’s virkning i kroppen ....................................................................................................................... 7

4.1 EPO’s intercellulære kommunikation .............................................................................................. 7

4.2 Erythropoiesen .................................................................................................................................. 8

4.3 Energistofskiftet ............................................................................................................................... 8

4.4 Bjørn Ekbloms undersøgelse .......................................................................................................... 10

4.5 Højdehuse og højdetræning ............................................................................................................ 11

4.6 Bivirkninger ved rhEPO ................................................................................................................. 11

4.7. Vurdering af rhEPO’s virkning ..................................................................................................... 12

5. Testmetoder .......................................................................................................................................... 13

5.1. Hæmatokrotværdi .......................................................................................................................... 13

5.2 Elektroforese................................................................................................................................... 13

5.3 Sammenligning af hæmatokrit og elektroforese ............................................................................. 15

5.4 Fremtidige testmetoder ................................................................................................................... 15

6. Gendoping ............................................................................................................................................ 16

6.1. Metode ........................................................................................................................................... 16

6.2 Ulemper ved gendoping ................................................................................................................. 17

6.3 Vurdering af gendoping som ’det perfekte dopingmiddel’ ............................................................ 18

7. Konklusion ........................................................................................................................................... 19

8. Litteraturliste ........................................................................................................................................ 20 Bilag 1 ...................................................................................................................................................... 22 Bilag 2 ...................................................................................................................................................... 22

Side 2

Side 1 af 24

1. Indledning

Inden for lægeverdenen er der sket en stor videnskabelig fremgang gennem de sidste par årtier og man er i dag i stand til at helbrede rigtig mange sygdomme. Desværre er denne viden blevet misbrugt i sportens verden, hvor stadig flere idrætsudøvere vælger den nemme vej til bedre resultater. I 1985 [1] lykkedes det at fremstille hormonet erythropoietin, der kan hjælpe mod bl.a.

nyresvigt og blodmangel. Kort efter dukkede samme stof op i sportens verden, da det viste sig at have en præstationsfremmende effekt og derfor en god erstatning for bloddoping. Lige siden har stoffet skabt store problemer i udholdenhedsidrætter som cykling og løb. Stoffet er et af de mest udbredte dopingpræparater, men hvad er det egentlig for en størrelse? Jeg vil i denne opgave koncentrere mig om EPO som dopingmiddel set fra en biologisk og kemisk vinkel. Der vil følge en gennemgang af stoffets struktur, hvorefter jeg vil analysere og vurdere dets virkning gennem en videnskabelig undersøgelse. Dernæst vil jeg redegøre for, hvordan man kan spore EPO i kroppen og vurdere nye testmuligheder for femtiden. Til slut vil jeg komme ind på gendoping, der er fremtidens skrækscenarie i sportens verden.

2. EPO’s opbygning

EPO er en forkortelse for erythropoietin, som er et endokrin hormon, der naturligt dannes i nyrerne

(90%) og i leveren (10%)^{2}. EPO er et glykoprotein, der består af 166 aminosyrer og 4

polysaccarider [3] og hører til gruppen af polypeptidhormoner.

2.1. Aminosyrer og Proteiner

Der findes i alt 20 forskellige aminosyrer. Disse er alle bygget op af samme grundskabelon, der kredser om et C-atom, hvortil der er bundet en carboxylsyregruppe, hydrogenatom og en aminogruppe. De 20 aminosyrer har kun en radikalgruppe til forskel. Denne gruppe sidder på det centrale kulstofatom og kan indeholde carbon, hydrogen, oxygen, nitrogen og svovl:

Figur 1) Opbygningen af en aminosyre

1

Møller, 2007 - slide 21

2

Falkenberg, 2000 - s. 44

3

Bilag 1

Side 3

Side 2 af 24

Aminosyrerne inddeles i 4 grupper efter radikalets opbygning: polære, upolære, positivt ladet og negativt ladet, alt efter radikalets struktur. Altså har de forskellige aminosyrer forskellige egenskaber, og da proteiner består af en række aminosyrer er aminosyresammensætningen afgørende for proteiners egenskaber. Aminosyrerne sættes sammen, efter at aminosyrerne er dannet under proteinsyntesen i cellens ribosomer, og danner peptider, der inddeles efter antallet af aminosyrer. To sammensatte aminosyrer kaldes et dipeptid, 3 en tripeptid osv., mens proteiner består af over 50-100 aminosyrer [4]. Sammenkoblingen sker ved en polymerisering, hvor der dannes en kovalent peptidbinding mellem den ene aminosyres carboxylsyregruppe og den anden aminosyres aminogruppe. Peptiderne dannes fra enden med den frie aminogruppe, og aminosyrene sættes derfor på den frie syreguppe. Under polymeriseringen, fraspaltes et vandmolekyle, og reaktionen er således en kondesationsreaktion:

Figur 2^{5} Dannelse af en peptidbinding

Reaktionen er energikrævende, og energien fås ved spaltning af ATP. De mange kombinationsmuligheder for polymeriseringen af aminosyrer gør, at der kan dannes et uanet antal af forskellige proteiner ud fra de 20 eksisterende aminosyrer.

2.1.1. Proteiners struktur

Proteiners struktur opdeles i 4 niveauer: Primærstruktur, sekundærstruktur, tertiærstruktur og kvartenærstruktur. Primærstrukturen angiver proteinets aminosyrerækkefølge sat sammen af peptidbindinger. Den sekundære struktur viser de enkelte polypeptidkæders struktur og der skelnes her mellem den spiralformede α-helixstruktur og β-foldebladsstruktur. Begge stabiliseres af hydrogenbindinger mellem H i aminodelen og O i syredelen. Alle proteiner har således både en sekundær og primærstruktur. Hvis proteinet består af en eller flere α-helix spiraler, vil dette betyde at stoffet også har en tertiærstruktur (rummelig opbygning). Denne struktur holdes sammen af ionbindinger, svovlbroer og hydrogenbindinger. Ionbindingerne dannes mellem de ladede syrer og

4

Bremer, 1995 – s. 50

5

Torp, 2007, s. 73

Side 4

Side 3 af 24

Figur 3) EPO’s tertiære struktur

(Møller, 2007 – slide 5) baser. Svovlbror opstår når to svovlatomer bindes til hinanden Dette sker, når to enheder af aminosyren cystein, der har radikalgruppen CH

2

-SH mødes. Ved fraspaltning af et H-atom fra hver aminosyre, dannes den stærke binding. Hydrogenbingerne dannes mellem polære aminosyrer. Det resulterer i, at de upolære aminosyreradikaler vil vende ind mod molekylets indre, da de skyr vand, og derved bliver stoffet overordnet set hydrofilt og blandbart med vand i modsætning til β-foldebladsstrukturen, der oftest består af hydrofobe radikaler, som vender ud mod omgivelserne og derfor gør stoffet hydrofobt. Det sidste niveau, der er den kvarternære struktur opstår hvis proteinet består af flere polypeptidkæder og beskriver koblingen af disse.

2.2. EPO’s struktur

EPO er et typisk tertiært protein. Som det også fremgår af figuren på bilag 1 er der i EPO to svovlbroer (disulfid bindinger) mellem cysteinaminosyrerne 7 og

161 samt mellem 29 og 33. Derved får EPO’s dets tertiære struktur.

Det er f.eks. en svovlbro, der holder to af molekylets α-helixer sammen. Udover peptidbindinger og svovlbroer holdes EPO også sammen af hydrogenbindinger, der giver molekylets fire α-helixer deres spiralform.

Af de fire polysaccarider, der gør EPO til et glykoprotein, er 3 afdem bundet til N ved Asp24, Asn38, Asn83, og det sidste er O-

undet ved Ser126.^{6} Det samlede resultat er et stort, komplekst og hydrofobt molekyle (figur 3) med
en molekylevægt på ca. 34.000 g/mol^{7}. Heraf udgøres 40%^{8} af molekylevægten af fire

polysaccarider.

Den tertiære struktur ødelægges ved f.eks. opvarmning eller kontakt med en stærk syre eller base, hvor svovlbindingerne vil brydes, og ladningen ændres, hvorfor ionbindingerne vil påvirkes, og proteinet denatureres og mister sine egenskaber. Derfor skal rhEPO indsprøjtes direkte i blodbanen for at undgå saltsyren fra fordøjelsessystemet.

2.2.1. Fremstilling af rhEPO

Rekombinant EPO, rhEPO, fremstilles ved genteknologi. Når man kender aminosyresammensætningen, er det muligt gennem forskellige teknikker at fremstille et rekombinant DNA-molekyle, der herefter overføres til en værtscelle, som oftest er en kinesisk

6

DMF, 1998

7

DMF, 1998

8

Institut für Biochemie, 2002

Side 5

Side 4 af 24

          9
hamstercelle . Nu vil det kunstige DNA replikeres i hamstercellen, og det dannede rhEPO kan

opsamles. Resultatet er et protein, der har næsten samme struktur som endogent EPO. Den eneste forskel er polysaccariderne. Disse vil variere alt efter hvilke celler der benyttes som værtscelle [10].

3. Proteiners fysiske og kemiske egenskaber

3.1 Syre-baseegenskaber

Proteiner består som sagt af en række aminosyrer, der alle indeholder to funktionelle grupper: en basisk aminogruppe og en sur carboxylsyregruppe. Blandingen af en basedel og en syredel gør, at aminosyrer ændrer ladning efter pH. Aminogruppen er en base og derved i stand til at afgive en

proton (H^{+}) og oxidere et andet stof. Omvendt er carboxylsyregruppen en syre og kan optage en

proton og reducere et andet stof. Ved protonoverførsel indenfor et molekyle dannes en amfoion, der er meget polær pga. den modtaget proton. I et surt miljø vil aminosyren optage en proton og i et basisk miljø vil aminosyren af give en proton. Denne evne til at optræde som både en syre og en base gør aminosyrer til en amfolyt:

Alanins ladning i hhv. surt og basisk miljø

Aminosyrerne lysin og arginin vil være positivt ladet ved pH under 8 og histidin ved pH under 7,7.

Dette skyldes at de indeholder en aminogruppe, som vil optage en proton, i deres radikal. Ligeledes indeholder aspartat og glutamat en caboxylsyregruppe i deres radikal og vil derfor være negativt ladet ved en pH over 6.

Proteiners ladning bestemmes af sammensætningen af aminosyrer. En overvejende mængde positivt ladet aminosyrer vil give proteinet en positiv ladning og omvendt.

Disse syre-baseegenskaber gør proteiner anvendelige som oxidations- og reduktionsmidler.

Enzymgruppen for enzymer, der oxiderer eller reducerer andre molekyler, betegnes oxidoreduktaser og spiller en vigtig rolle i f.eks. energistofskiftet.

9

P1, 2008

10

Møller, 2007 – Slide 10

Side 6

Side 5 af 24

3.2 Isoelektrisk punkt^{11}

Som tidligere set vil aminosyren ved et surt miljø være positiv, mens ladningen vil være negativ i et basisk miljø. Der vil derfor også være ét punkt, hvor molekylet er fuldt ioniseret, og dets samlede ladning vil være neutral: Det isoelektriske punkt (pH iso

). Ved en pH under dette punkt vil stoffets nettoladning være positiv, mens den vil være negativ ved en pH værdi over pH. PH kan bl.a.

iso iso findes ved titrering med en base. Aminosyrer i et surt miljø vil som beskrevet indeholder to syregrupper: carboxylsyregruppe og aminosyregruppe. Ved titrering med en base vil carboxylsyregruppen først afgive sin proton, da denne fremtræder som den stærkeste syre. Derved fås følgende reaktion for aminosyren glycin:

Ud fra en grafisk illustration [12] af titreringen kan det isoelektriske punkt bestemmes:

Jo mere negativt ladet molekylet er, jo lavere vil dets isoelektrisk punkt altså være. I et protein er aminosyrernes amino- og carboxylsyregruppe uladede, da peptidbindingen er mellem disse grupper.

11

Bremer, 1995 – s 48-49

12

Institut für Biochemie, 2002

Side 7

Side 6 af 24

Derimod vil aminosyrernes radikaler have forskellig ladning afhængigt af pH af miljøet. Derfor vil der også findes et isoelektrisk punkt for proteiner.

3.3 Proteins opløselighed i vand

Når et stof opløses i vand, skyldes det, at stoffet binder sig til vandmolekylet gennem elektriske kræfter, og der dannes en elektrisk hydrogenbinding. Det er altså nødvendigt at dele af stoffet er polariseret eller ladet og jo større dele af stoffet, der er dette, jo lettere opløses det i vand. Der gælder, at kun polære stoffer kan opløses i andre polære stoffer. Dette skyldes, at hydrogenbindinger dannes ved en ladningsforskel. Dvs. at H-atomet i et vandmolekyle vil danne en hydrogenbinding med negativt ladede organiske ioner og med organiske molekyler, der indeholder de elektronegative atomer F, N eller O. Omvendt vil et H-atom, der er knyttet til et elektronegativt atom i en organisk forbindelse danne en hydrogenbinding med det elektronegative O-atom i vandmolekylet [13]. Af de fire grupper, som aminosyrerne inddeles i, er det kun den upolære gruppe der ikke kan opløses i vand, og da disse aminosyrer som beskrevet vil tiltrækkes af hinanden i proteinets midte ved en tertiærstruktur, vil disse proteiner være opløselige i vand. I modsætning til β-foldebladsstruktur, hvor radikalgrupperne går ud mod omgivelserne, og derved vil de upolære radikaler gøre stofferne hydrofobe. Som sagt varierer aminosyrers og proteiners ladning af pH.

Derfor vil stoffets opløselighed i vand også afhænge heraf. Jo større ladningsforskydning, jo bedre opløses stoffet i vand. Ved én bestemt pH vil den samlede nettoladning være lig 0, og stoffet vil derfor opløses dårligst ved denne pH, der betegnes det isoelektriske punkt. Da vands pH ligger nær

7, vil man kunne vurdere et stofs opløselighed heri ud fra det isoelektriske punkt. Jo længere fra 7 punktet ligger, jo mere opløseligt vil det være i en vandig opløsning. Da blodets pH ligger lige over

7, vil samme regel gælde for opløselighed i kroppen.

3.4. Proteiners koge- og smeltepunkt

Da næsten alle aminosyrer fremkommer som amfoioner, vil aminosyrer og dermed også proteiner have høje smeltepunkter (mellem 200˚C og 300˚C) [14] og kogepunkter. Dette skyldes, at negativt ladede ioner vil tiltrækkes af positivt ladede ioner og danne en kemisk ionbinding, som holdes sammen af store elektriske kræfter. Derved skal der tilføres meget energi for at nedbryde ionbindingerne. Proteiners smelte- og kogepunkt afhænger også af pH. I det isoelektriske punkt, hvor der er en ligelig fordeling af positive og negative ladninger, som vil holde proteinet sammen, vil smelte- og kogepunktet være størst.

13

Bremer, 1995 – s 46

14

Mygind, 1992 – s.194

Side 8

Side 7 af 24

4. EPO’s virkning i kroppen

EPO dannes som sagt hovedsageligt i nyrerne. Dette sker ved, at sensorer i nyrerne registrerer et lavt iltindhold i blodet. Herefter vil EPO udskilles til blodbanen og transporteres til målcellerne i den røde knoglemarv, hvor dets opgave er at stimulere produktionen af røde blodlegemer. Men fra at nyrerne registrerer lavt ilttryk, og til der er dannet nye røde blodlegemer, forløber forskellige processer.

Figur 4^{15}) Forenkling af EPO’s virkning

4.1 EPO’s intercellulære kommunikation

På grund af EPO’s størrelse og det, at det er et hydrofilt hormon, kan det ikke selv trænge ind gennem målcellens cellemembran, der her er stamcellen i knoglemarven. En cellemembran består af et doppelt lipidlag med et hydrofobt ydre, der kontrollerer hvilke stoffer, der trænger igennem. Små hydrofobe molekyler kan selv trænge gennem membranen, men for de stoffer, der ikke kan, findes der på membranoverfladen forskellige transportmolekyler. For EPO’s tilfælde er det receptoren epoR [16], hvortil receptorerne på EPO molekylet, EPObp1 og EPObp2 [17] bindes. Når begge disse steder er bundet til epoR, aktiveres enzymet Jak2 tyrosin-kinase, der er bundet til epoR på cellemembranens inderside og fungerer altså som ét molekyle. Jak2 Tyrosin-kinase aktiverer nu andre intracellulære enzymer ved phosphorylering. Dvs at der tilføres stoffet et phosphatatom. Der

er nu startet en ’bølge’ af aktivering, og i sidste ende aktiveres Ras/MAP kinase, der virker som

katalysator for dannelsen af de røde blodlegemer. Processen, fra at stamcellen i knoglemarven er blevet stimuleret til, at de røde blodlegemer er modnet, kaldes eryhtropoiesen.

15

Møller, 2007 - slide 13

16

Bioportfolio

17

Spahlinger m.fl., 2007

Side 9

Side 8 af 24

Figur 5) Overblik over erythropoiesen

4.2 Erythropoiesen^{18}

Blodet består af 4 dele: plasma, blodplader, røde- og hvide blodlegemer. De hvide blodlegemer og blodpladerne udgør kun en meget lille del af det samlede blodvolumen, mens plasmaet udgør den største del på ca. 55-60% hos en mand. Resten udgøres af de røde blodlegemer, der dannes under erythropoiesen, som foregår i den røde knoglemarvs hæmopoietiske (bloddannende) væv. Her findes hæmocytoblaster, der er kendetegnet ved basofilt cytoplasma og en stor cellekerne med flere små, tydelige kerner indeholdende arvemateriale. Dernæst udvikles hæmocytoblasten til en proerythroblast, der i høj grad ligner hæmocytoblasten. Næste trin er den basofile erythroblast, hvis cytoplasma er mere basofilt, og de små kerner er meget utydelige. Denne udvikles til en polykrome erythroblast, hvis cellekerne er mindre og tættere, og hvor de små kerner ikke længere kan ses. Samtidig er der nu dannet hæmoglobin i cytoplasmaet, som derfor får en karakteristisk lyserød farve i næste fase: Den eosinofile erythroblast. Kernen er her skrumpet endnu mere ind for helt at forsvinde ved næste stadie, der er en reticulocit. Disse modnes til de færdige røde blodlegemer, eryhtrocytter.

Reticulocit skiller sig fra eryhtrocytter ved at have et basofilt net, der farves i et surt miljø.

Eryhtropoiesen tager ca. 5 døgn, fra at stamcellen i knoglemarven stimuleres, og til den er modnet til en erythrocyt [19]. Efter iltmætningen i blodet er normaliseret, vil dette have en negativ feedback virkning på EPO-dannelsen, der igen vil ophøre.

4.3 Energistofskiftet

Når musklerne skal udføre et arbejde, kræver det energi. Energien kommer ved nedbrydning af en fosfatbinding i ATP, der bliver til ADP. For at genopbygge ADP til ATP kræves ny energi. Denne fås ved nedbrydning af næringsstofferne protein, fedt og kulhydrat. Ved hårdt muskelarbejde vil

energien hovedsageligt komme fra nedbrydning af kulhydrat/glukose, da denne proces giver hurtig

og meget energi pr. iltforbrug i forhold til nedbrydning af fedt og protein. Nedbrydningen af glukose kan forløbe ved anaerob spaltning og aerob forbrænding (respiration).

Første del i de to processer forløber ens. Glukosen omdannes til pyrodruesyre og NADH gennem

2 glykolysen i cellens cytosol. Herefter afgør iltforholdet i musklen den videre nedbrydning.

18

Løvschall m.fl.

19

Brandt, 2001

Side 10

Side 9 af 24

Ved utilstrækkelig ilttilførsel til musklerne vil pyrodruesyre omdannes til mælkesyre ved følgende reaktion i cellens cytoplasma:

CH -CO-COOH + NADH 🡪 CH -CHOH-COOH + NAD + 2ATP^{20}

2 2 3

Den aerobe nedbrydning finder sted, når muskelcellerne har god tilgang til ilt. Reaktionen herfor er noget mere kompliceret og forløber gennem 2 trin. Først omdannes pyrudruesyren til acetyl-CoA i

mitokondrierne. Her sker først ved hjælp af NAD^{+} som oxidationsmiddel en oxidativ

decarboxylisering, hvor der fraspaltes CO

2 2 og dannes NADH

. Processen frigør en stor mængde energi, der oplagres i en energirig binding mellem acetyl og CoA. Acetyl-CoA nedbrydes videre i citronsyrecyklus, der også foregår i mitokondrierne. Slutproduktet af processen er 2 CO, der

2 afgives til cellen, 1 ATP, der bruges til de energikrævende processer, og 8 H, der er bundet i 3

NADH + 3H^{+} og FADH. Det er disse bundne H-atomer, der er interessante for respirationskæden,

2 da de bundne H indeholder energirige elektroner. Denne energi benyttes til phosphorylering af ADP til ATP [21]. Den samlet aerobe reaktion bliver:

C H O + 6O + 38ADP + 38P 🡪 6CO + 6H O + 38ATP^{22}

6 12 6 2 2 2

Ved sammenligning af de to processer kan ses, at der ved anaerob nedbrydning dannes betydeligt mindre energi end ved aerob forbrænding. Dertil kommer, at der ved anaerob nedbrydning vil komme en forskydning i forholdet mellem kaliumindholdet i og udenfor muskelcellen. Dette resulterer i, at signalerne fra hjernen hæmmes, og musklerne lammes. Mælkesyre dannes for at modvirke denne forskydning, og er altså ikke årsagen til træthed, som man før har troet [23].

Affaldsproduktet ved aerob respiration er CO

2

, der let transporteres tilbage til lungerne gennem blodet. Af den grund vil det være ønskeligt for en idrætsudøver indenfor udholdenhedsidræt, at kunne udføre aerobt arbejde ved højst mulig belastning. Ilttilførslen til musklerne via kredsløbets blodårer har derfor stor betydning, da dette giver et større energiudbytte og forhindrer muskellammelse. Her kommer de røde blodlegemer ind i billedet. De røde blodlegemer indeholder nemlig proteinet hæmoglobin, der sørger for blodets ilttransport. Hæmoglobin har en kvaternær struktur og består af fire porphyrinringe kaldet hæmgrupper, der hver er knyttet til en proteinkæde kaldet globin. I hæmgruppen er bundet et jernatom, hvortil iltbindingen sker. En erythrocyt rummer godt 350 mio. hæmoglobinmolekyler, og 1 g. hæmoglobin kan binde 1,34 ml ilt [24]. Herved vil en øget mængde røde blodlegemer medføre, at der kan bindes mere ilt til blodet og derfor transporteres

20

Wolf, 1996 – s. 40

21

Bremer, 1995- s. 145

22

Mygind, 1990

23

Nielsen, 2004

24

Saltin, 2000

Side 11

Side 10 af 24 mere ilt til de arbejdende muskler. Dette er præstationsfremmende, da der herved kan arbejdes ved en højere belastning, inden den anaerobe nedbrydning er nødvendig. De fysiologiske virkninger belyses i en videnskabelig undersøgelse, der blev udført i 1991 af svenske Bjørn Ekblom, Ph.D. på

                                                                25
Fysiologisk og Farmakologisk afdeling ved det Karolinske institut i Stockholm.

4.4 Bjørn Ekbloms undersøgelse

Man gav 24 unge, raske mænd 20-40 IU/kg kropsvægt rekombinant EPO (rhEPO) gennem 7 uger.

Gennemsnitsresultaterne blev:

Inden behandling Efter 7 uger med EPO

Hæmoglobinkoncentrationen 152 g/l blod 169 g/l blod

Hæmatokritværdi 44% 49%

VO 4,52 l O /min 4,88 l O /min

2max 2 2

Arbejdspuls ved 200W 144 slag/min 138 slag/min

Systoliske blodtryk ved 200W 177 mmHg 191 mmHg

Derudover viste det sig, at VO

2 ved 200W og blodvolumen samt plasmamængden var uændret

Den øgede hæmoglobinkoncentration skyldes som beskrevet rhEPO’s indflydelse på dannelsen af røde blodlegemer. Da blodvolumen var uændret og hæmoglobinkoncentrationen steget, vil dette samtidig betyde, at procentdelen af røde blodlegemer i blodet (hæmatokrit) vil stige. VO står for

2max den maksimale iltoptagelse, der angiver hvor mange liter O

2

, der kan optages i kroppen pr. min. Da der ved en stigning i hæmoglobinkoncentrationen kan bindes mere O

2 til blodet, vil det naturligvis medføre stigning i VO. Derved vil der ses en præstationsforbedring, da kroppen ved større

2max optagelse af O kan udføre en større aerob respiration og få mere energi i form af ATP til at udføre

2 arbejdet.

Arbejdspulsen ved et arbejde på 200W faldt med 6 slag/min. Årsagen hertil skal ses i sammenhæng

med, at VO viste sig at være uændret. Det vil sige, at ved en arbejdsbelastning på 200W var

2-200W iltoptagelsen og dermed iltbehovet i muskelvævet det samme før og efter rhEPO-kuren. Det betyder, at blodet grundet den høje hæmoglobinkoncentration som sagt har mere O bundet pr. L

2 blod, og derfor skal der ved den givne arbejdsbelastning ikke transporteres så meget blod som før for at tilføre den nødvendige mængde O til muskelvævet.

2

25

Bilag 4

Side 12

Side 11 af 24

Altså er det for en eliteudøver ønskeligt at øge mængden af erythrocytter i blodet for at kunne transportere mere ilt pr. min. Men der kan også ændres på hæmatokritværdien uden brug af doping.

4.5 Højdehuse og højdetræning

Ved forøgelse af VO ved normal konditionstræning vil blodets hæmatokrit ikke stige, da

2max blodplasmaet og blodets samlet volumen øges samtidigt. Dette sikrer en rimelig konstant hæmatokrit. Hos personer, der har trænet gennem mange år, vil der endda kunne måles et fald i deres hæmatokritværdi, da plasmavolumen øges mere end mængden af røde blodlegemer [26]. Derved vil blodgennemstrømningen øges, og blodtrykket vil falde [27]. Dog kan der ved væsketab ske en stigning i hæmatokrit, da vandindholdet i blodets plasma vil falde. Omvendt vil en stor tilførsel af væske kunne sænke hæmatokritværdien [28]. Denne ændring vil dog kun vare nogle timer [29]. En anden metode til ’naturligt’ at øge mængden af røde blodlegemer er ved et 3-5 ugers ophold i over 2000 meters højde [30] eller såkaldte højdehuse. Begge metoder udnytter den lave iltmætning i luften til naturligt at stimulere dannelsen af EPO og derved opnå samme virkning som ved brug af rhEPO.

Dog vil hæmatokrit allerede være normaliseret 2-3 dage efter, at man er kommet tilbage til normale omgivelser, da volumen af plasmaet vil stige markant, når den normale iltmætning i luften

        31
registreres .

4.6 Bivirkninger ved rhEPO

RhEPO er indtil videre det dopingmiddel, der har forårsaget flest dødsfald [32]. Selvom det tydeligt fremgår af forsøgsresultaterne ovenfor, at rhEPO har en gavnlig effekt på iltoptagelsen, er der en alvorlig bagside af medaljen i form af forskellige bivirkninger. Den øgede hæmatokritværdi vil medføre, at blodet bliver mere viskøst, og for at pumpe det tykke blod rundt i kroppen vil hjertets blodtryk ved arbejde automatisk stige. Dette vil ske, da modstanden i blodkarrene stiger pga., at arterierne trækker sig sammen for at undgå overstrømning af blod til kroppens organer [33].

Blodtryksstigningen blev også bekræftet i Ekbloms undersøgelse fra 1991 [34]. Blodtrykket vil stige ekstra meget, når kroppen udsættes for arbejde, og det høje blodtryk slider voldsomt på hjertet, og kan resultere i at blodkar sprænges. Det høje blodtryk blandet med hårdt fysisk arbejde forøger

26

Jensen

27

Falkenberg m.fl., 2004 - s. 203

28

Saltin, 2000

29

Jensen

30

Saltin, 2000

31

Saltin, 2000

32

Terney, 2007

33

BioNordic, 2003

34

Se afsnittet ”Bjørn Ekbloms undersøgelse”, s. 9

Side 13

Side 12 af 24 samtidig volumen af hjertemusklen, hvilket nødvendiggør en større blodgennemstrømning gennem selve hjertet. Derved øges risikoen for hjerteanfald, når hjertes muskelceller dør og ikke længere kan tilføre hjertet den nødvendige næring [35]. Det største problem ses under hvile, hvor blodtrykket igen vil falde, og der kan opstå blodpropper.

For at man kan drage nytte af de mange nye eryhtrocytter, er det nødvendigt at have tilstrækkeligt med jern hertil. Eryhtrocytterne fungerer nemlig kun når hæmoglobinets hæmgruppe har bundet et jernatom. Derfor vil idrætsudøvere med meget høj hæmoglobinkoncentration være nødsaget til at tage jerntilskud. Dette kan i få tilfælde give leverkræft pga. den store koncentration af jern i

kroppen^{36}.

En anden alvorlig bivirkning ved brug af rhEPO er risikoen for at udvikle pure red cell-aplasi [37].

Konsekvensen heraf er, at erythropoiesen i knoglemarven ophører, da immunforsvaret har reageret på det fremmede rhEPO og dannet antistof herimod. Det dannede antistof vil også kunne bindes til kroppens eget EPO, hvilket forhindrer kontakten til epoR-receptoren på stamcellerne i knoglemarven. Derved vil knoglemarven ikke længere stimuleres til at danne erythrocytter, hvilket vil medføre blodmangel. Denne immunogene reaktion er dog yderst sjælden og rammer kun 1 ud af

0 rhEPO-brugere.

38

4.7. Vurdering af rhEPO’s virkning

Hverken rhEPO’s præstationsfremmende effekt eller de medfølgende bivirkninger er til at tage fejl af. For eliteudøvere i udholdenhedsidrætter vil rhEPO’s positive virkning på den maksimale iltoptagelse måske betyde, at man går fra en ubetydelig 10. plads til verdensmester. I dag er der store penge indenfor idræt, og bl.a. derfor lukker mange idrætsudøvere øjnene for de alvorlige konsekvenser, der er ved brugen af rhEPO. Da det kan være svært at kontrollere, hvor store doser af rhEPO man skal tage for, at hæmatokritværdien ikke bliver alt for høj, er der stor chance for, at man sætter sit liv på spil ved at dope sig med rhEPO. RhEPO er uundværligt for mange syge mennesker, der lider af nyresvigt og blodmangel. For disse patienter er bivirkningerne meget få, da deres hæmatokrit blot øges til det normale. Før EPO blev syntetiseret, måtte disse patienter jævnligt gennemgå en blodtransfusion, hvilket er hårdt for en allerede svækket krop. For at hjælpe disse patienter endnu mere, er der gennem de seneste år arbejdet meget på at optimere rhEPO. En af

35

BioNordic, 2003

36

Sawka M N, Convertino V A, Eichner E. R, Schnieder M, Young A.J.: “Blood Volume: importance and adaptions to

exercise training, environmental steesses, and trauma/sickness” Med. Sci. Sport Exerc., Vol. 32, No. 2, 332-348 (2000)
37

Høi-Hansen, 2003

38

Bendtzen, 2003

Side 14

Side 13 af 24 rhEPO’s store ulemper er dets korte halveringstid, hvilket gør det nødvendigt at indsprøjte rhEPO

1-3 gange ugenligt^{39}. I 2003 udviklede man stoffet NESP, der kun skulle tages 1-2 gange om

ugen [40]. Senest har man udviklet stofferne CERA og darbepoetin, der kun skal indsprøjtes 1 gang om måneden. Den øgede halveringstid skyldes, at man har koblet en større mængde polysaccarider på stofferne. Stofferne har samme fysiologiske virkning som rhEPO, men er lettere at teste for, da de adskiller sig mere fra det endogene EPO.

5. Testmetoder

EPO er ikke bare sundhedsskadeligt, men også direkte snyd på grund af dets præstationsfremmende egenskaber. Stoffet har siden 1989 [41] været på den internationale dopingliste. Derfor tester man jævnligt idrætsudøvere for brugen af det forbudte stof. Sådan en dopingtest kan foretages direkte og indirekte. De indirekte testmetoder bygger på kvantitative observationer, mens de direkte giver et kvalitativt resultat. Det er i dag kun muligt at anklage en idrætsudøver for dopingbrug ved de

direkte metoder^{42}.

5.1. Hæmatokrotværdi

Et eksempel på en indirekte dopingtest er en måling af idrætsudøverens hæmatokritværdi, som angiver procentdelen af røde blodlegemer i blodplasmaet gennem en lille blodprøve. Denne blodprøve kommes i nogle meget tynde glasrør, der herefter centrifugeres. Efter få minutter vil der være en klar adskillelse af røde blodlegemer og plasmaen, og hæmatokrit kan måles vha. et simpelt

måleapparat [43]. Denne værdi vil normalt ligge mellem 40-45% hos mænd og 38-43% hos kvinder^{44}.

Af hensyn til rytternes sundhed har det internationale cykelforbund sat en grænse på 50% [45]. Ved en hæmatokritværdi over 50% nægtes rytteren deltagelse i konkurrencen, før værdien er kommet under

50% igen.

5.2 Elektroforese

Ved en direkte dopingtest for EPO tages der udgangspunkt i forskellen på rekombinant EPO og endogent EPO. RhEPO og EPO’s aminosyresekvenser er identiske, men polysaccariderne, der sidder på aminosyresekvenserne, er forskellige. Dette giver mulighed for at afsløre brugen af rhEPO

39

Sand, 2008

40

Andreasen, 2003

41

Møller, 2007 – slide 24

42

Anti Doping Danmark 2

43

Saltin, 2000

44

DMF, 1998

45

Anti Doping Danmark

Side 15

Side 14 af 24 gennem en elektroforese. Metoden udnytter, at ladede partikler tiltrækkes af modsat ladede poler.

Derved kan f.eks. proteiner og aminosyrer, der er forskelligt ladet, adskilles ved at sætte dem i en gel med en bestemt pH, der kontrolleres ved brug af en pufferblanding af en svag syre og en svag base. Derefter anbringes en positiv elektrode i den ene ende og en negativ i modsat ende. Positive ladede partikler vil nu vandre mod den negative elektrode og omvendt. Ved adskillelse af aminosyrer vil det være hensigtsmæssigt at benytte en gel med en tæt struktur, der gør det sværere for store molekyler at vandre. Dette gør det muligt at sortere aminosyrerne efter både størrelse og ladning. De der er kommet længst, vil være de mindste og mest ladede partikler. Ved adskillelse af proteiner vil man ofte benytte en ’forhindringsfri’ gel, så proteinerne udelukkende sorteres efter ladning [46]. Efter elektroforesen udfælder man proteinerne ved at tilsætte et farvestof, der bindes til alle proteinerne. Herefter kan man sammenligne de forskellige stoffers sammensætning og konstatere hvilke stoffer, der findes i prøven. En anden variant af elektroforese er isoelektrisk fokusering. Her tages udgangspunkt i molekylers isoelektriske punkt. Ved at ændre pH ned langs gelen vil molekylerne sorteres efter deres isoelektriske punkt, da de vil stoppe deres vandring ved netop denne pH. Denne form for elektroforese benyttes ved den direkte EPO-test af en urinprøve.

RhEPO’s anden variation i polysaccariderne gør det muligt at sammenligne resultatet med elektroforese af endogent EPO og derudfra kan rhEPO spores:

Figur 6^{47} Resultat af elektroforese af rhEPO, NESP og endogent EPO

Det ses at rhEPO og NESP ikke ligger indenfor det endogene område, og derfor vil det ud fra denne test være muligt at dømme en eliteudøver for dopingbrug.

46

Nielsen, 2004 – s. 176

47

WADA, 2007

Side 16

Side 15 af 24

5.3 Sammenligning af hæmatokrit og elektroforese

De dannede erythrocytter, som er resultat af rhEPO’s stimulans, har en levetid på 3-4 uger [48], men rhEPO kan kun spores ved urinprøver 2-3 dage efter indsprøjtning [49]. Derfor kan en urinprøve kun i få tilfælde fange misbrugere af rhEPO. Selv hvis man tester idrætsudøveren indenfor de to dage, vil der være stor risiko for, at han slipper gennem kontrollen med en negativ test. Analysen er nemlig meget følsom og ikke ret sikker. Carsten Lundby undersøgte i juni 2008 sikkerheden af denne EPO-test. En gruppe på otte mænd kom på en rhEPO-kur på 4 uger, hvorefter de hver fik taget to anonym EPO-tests hos det internationale antidopingagentur (WADA). Det viste sig, at der ud fra 16 urinprøver kun blev testet 6 positive, og nogle prøver blev testet positive, selvom de var negative [50].

En anden ulempe ved urinprøver er at nye stoffer som fx CERA, er så stort et molekyle, at det ikke udskilles i urinen og kan derfor kun spores gennem en blodprøve [51]. Samtidig er elektroforese en meget dyr metode. Analysen fra en urinprøve er 6 gange dyrere end en måling af hæmatokrit [52].

Problemet med de indirekte dopingtests er, at de udelukkende er kvantitative, og derved ikke kan fælde en idrætsudøver for doping, da de ikke siger hvilke stoffer, der har forårsaget resultatet af de kvantitative målinger, eller om det blot er en genetisk mutation, der har forårsaget de unormale observationer.

5.4 Fremtidige testmetoder

Efter den store udvikling i medicinalindustrien er der startet et kapløb mellem dopingsynderne og dopingkontrollen. Der udvikles konstant nye præparater, der udfordrer dopingkontrollørerne ved, at præparaterne i større og større grad ligner kroppens egne stoffer. Under Tour de France i 2007 fandt man en ny form for EPO hos den danske cykelrytter Michael Rasmussen [53]. Den nye EPO kaldes Dynepo og fungerer præcist som rhEPO. Den eneste forskel er, at Dynepo er lavet med menneskeceller som værtscelle i stedet for de traditionelle hamsterceller og har således samme polysaccarider som endogent EPO. Derfor kan præparatet ikke spores gennem elektroforese af en urinprøve. Det nyeste kendte EPO-lignende dopingpræparat hedder hæmatide, og stoffet er endnu så nyt, at man ikke har fundet en test hertil. Og i morgen er der måske produceret et nyt præparat, der igen udfordrer dopingkontrollørerne, som af den grund hele tiden er tvunget til at tænke fremad og have tests klar til nye dopingmidler.

48

Danske Bioanalytikere, 2008

49

Møller, 2007 – slide 31

50

Hansen, 2008

51

Belalcazar, 2008

52

Danske Bioanalytikere, 2008

53

Berlingske, 2007

Side 17

Side 16 af 24

Da præparaterne i højere grad bliver tro kopier af kroppens egne stoffer, mener jeg, at vejen frem er de indirekte testmetoder. Da hæmatokritværdier over 50% ikke kan opnås ved træning, og at en øget hæmatokrit ved højdetræning vil normaliseres efter et par dage, er det en rimelig sikker indikation på, at der er noget unaturligt her. Samtidig kan blodtryksmålinger være en god indikation på, om der har været benyttet doping, da et højt blodtryk vil være meget unaturligt hos en veltrænet idrætsudøver. En anden rimelig effektiv testmetode vil være at måle alderen på de røde blodceller gennem en blodprøve. Erythrocytter, der er dannet ved stimulans fra rhEPO vil hurtigere nedbrydes end naturligt fremkomne erythrocytter [54]. Derfor vil en overvejende mængde af unge blodlegemer være en god indikation på et dopingmisbrug og den unormale fordeling mellem umodne og modne røde blodlegemer vil kunne ses i op til 14 dage efter indsprøjtning [55].

For at modvirke usikkerheden, der er ved de indirekte tests, vil man kunne indføre paskontrol for eliteudøverne. Hver idrætsudøver skal her have en database, hvor deres blod- og hormonværdier er indført. Store og pludselige udsving i disse værdier vil være en forholdsvis sikker indikation på tilstedeværelse af forbudte stoffer, da sådanne udsving ikke er normale. Det eneste metoden kræver er, at WADA godkender metoden, og at det ikke længere er nødvendigt at bevise, hvilket stof der har været brugt. Med den konstante udvikling af nye stoffer kan dette nemlig blive svært. Og måske er indirekte tests dopingbekæmpernes eneste mulighed fremover, fordi lige foran os lurer fremtidens doping: gendoping

6. Gendoping

6.1. Metode^{56}

Gendoping tager udgangspunkt i genmanipulation med kroppens egne gener. Viden omkring sammensætningen af gener er springbrættet herfor. Et DNA-molekyle består af en række gener, der alle koder for noget forskelligt. Et gen kan deles op i to dele. Første del er den kontrollerende, der styrer, hvornår genet skal være aktivt og hvor meget. Den næste del er så selve koden for et specielt protein. Med nutidens viden er det muligt at isolere de to dele af genet. Ved EPO-gendoping vil man isolere den kodende del for EPO og opformere dette i en PCR-maskine. Ligeledes opformerer man en kontroldel, som er mere aktiv end den, der allerede er foran EPO. De to opformerede gener sammensættes dernæst vha. et ligaseenzym og sættes i et plasmid, der er et cirkulært stykke DNA,

54

MAI København

55

Møller, 2007 - slide 31

56

P1, 2008

Side 18

Side 17 af 24 og nu kan det nye gen laves i store mængder i bakterieceller. Derved vil man få et nyt gen, hvor der er ændret for kontroldelen og derfor vil kroppen øge dens produktion af det naturlige EPO.

Der er nu tre forskellige måder at få den nye DNA-sekvens ind i kroppen:

• Den første metode er via indsprøjtning i fx muskelceller. Fordelen ved netop muskelceller er, at disse ikke laver mitose, og derved undgår man en ukontrolleret kopiering af det fremmede DNA. Metoden kan specielt benyttes til EPO-doping, da EPO jo bare skal ud i blodbanen for at stimulere knoglemarven. Ulempen er, at metoden ikke er særlig effektiv, da det kun er et begrænset antal celler, der vil optage det nye gen, selvom man bruger en meget koncentreret mængde. For dopingmisbrugeren er metoden smart, da det vil blive svært at opdage i en dopingtest. Det vil nemlig kræve, at man ved præcist, hvilket gensplejset DNA man skal lede efter og hvor. Dertil kommer, at det højst usandsynligt vil blive legalt for dopingkontrollører at tage den nødvendige muskelbiopsi af en idrætsudøver.

• En anden metode er ved at udskifte DNA fra en virus med det gensplejset DNA og derefter udnytte dens egenskab til at inficere en kropscelle og benytte cellens DNA og organeller til at lave en proteinsyntese af det gensplejsede gen. Metoden er yderst effektiv, men også klart den mest risikable, da det vil være umuligt at kontrollere hvilke celler, der optager det nye gen. Metoden vil være dårlig egnet til doping, da den er meget usikker og samtidig den letteste at spore, da det kunstige gen vil findes mange steder i kroppen. Man skal blot vide hvilket stof man leder efter.

• Den tredje metode foregår in vitro. Det vil sige, at man i et laboratorium tager f.eks. en muskelstamcelle fra kroppen og indsætter det nye gen heri, hvorefter cellen med det nye gen sættes tilbage i kroppen. Det giver en stor kontrol over det nye gen, og samtidig er det svært at opdage doping ved denne metode, da man ligesom ved den første metode skal vide, hvad man leder efter og hvor.

6.2 Ulemper ved gendoping

Fælles for alle 3 metoder er, at blot én behandling vil give en evig effekt. Hvis gendopingen forløber godt, vil dette selvfølgelig være en stor fordel i forhold til i dag, hvor man jævnligt skal indtage sprøjter. Men går det ikke, som man havde håbet, hvilket der er stor mulighed for, vil følgerne vare resten af livet. Selvom der ved metode 1 og 3 er nogenlunde kontrol over det nye gen, ved man i dag stadig ikke præcis, hvilke følger gendoping vil have. Det er uforudsigeligt om det nye gen, der speeder produktionen af EPO, vil medføre en uhæmmet vækst af røde blodlegemer og give meget viskøst blod. Hvis dette sker, vil der formenlig ikke være nogen vej tilbage. I værste fald

Side 19

Side 18 af 24 vil knoglemarven blive ved med at danne røde blodlegemer, og blodet vil til sidst være så tykt, at det ikke kan transporteres rundt i kroppen. Ved metode 2 er der en anden meget alvorlig bivirkning, der blev observeret ved et forsøg i 2005, hvor man indsatte et genmanipuleret EPO-gen i 16 aber [57].

En række af disse aber udviklede anæmi, da immunforsvaret reagerede på den fremmede virus og dannede antistof. Følgen var kronisk anæmi, da produktionen af EPO vil ophøre, og abernes eneste mulighed for overlevelse var blodtransfusioner resten af livet.

Der er ingen tvivl om den store risiko, der er ved gendoping i dag, og højst sandsynligt er der ingen eller kun meget få idrætsudøvere, der allerede nu tør eksperimentere og er villige til at betale den store pris, der kan følge med. Men der arbejdes hårdt på at løse de problemer, der er ved genterapi i dag. Bl.a. forsøger man at modvirke risikoen for at få livsvarige skader, ved at anbringe en form for fortrydelsesknap i det kunstige gen. Dette kan lade sig gøre ved at koble et gen ind, der ved kontakt med et bestemt stof, der er specifikt for netop dette kunstige gen, vil omdannes til et giftstof og

dræbe cellen med det manipolerede gen^{58}. Formålet med bedre genterapi er dog ikke at lave nye

dopingpræparater, men at være bedre rustet til at behandle for sygdomme.

6.3 Vurdering af gendoping som ’det perfekte dopingmiddel’

På nuværende tidspunkt er der en alt for stor mangel på viden omkring genterapi, til at det på nogen måde er værd at overveje. Men om få år vil der formegentlig være en tilstrækkelig stor viden omkring området til, at de første begynder at eksperimentere med metoden. Fordelen ved gendoping for idrætsudøvere, der vil benytte sig af doping, er udover den præstationsfremmende effekt, at chancen for at blive opdaget er uhyre lille. Dette skyldes det, at man blot ændrer på gensammensætningen, og at det derfor vil være kroppens helt eget EPO, der produceres. Den eneste mulighed, der vil være for at fælde en for gendoping, er at man præcist ved hvilket gensplejset DNA, man skal lede efter og hvor. Problemet er bare, at det vil være stort set umuligt at lave tests for alle mulige genmanipolerede dopingpræparater, og at det kunstige gen i princippet kan være i celler overalt i kroppen. Det vil være som at lede efter en nål i en høstak. Og dertil kommer et etisk spørgsmål om, om det skal tillades at tage en biopsi overalt i kroppen for at finde det kunstige gen i en celles DNA. Altså vil indirekte testmetoder muligvis være de eneste, der kan fange dopingsynderne. Så hvis man om nogle år har løst nogle af de problemer, der er omkring genterapi i dag, og hvis ikke disse godkendes af WADA, vil gendoping være det perfekte dopingmiddel. Men

57

Andersen, 2006

58

P1, 2008

Side 20

Side 19 af 24 med de usikre testmetoder der er i dag, kan det ikke på nogen måde betale sig at tage chancen med genterapi. De fysiologiske virkninger vil være stort set de samme og med alle de stoffer, der er syntetiseret i dag, er det ikke så svært at løbe om hjørner med dopingkontrollanterne.

7. Konklusion

I 1985 lykkedes det at syntetisere hormonet erytrhopoeitin som behandling til patienter med blodmangel. Hormonet, der er et glykoprotein, dannes hovedsageligt i nyrerne, når de registrerer lav iltmætning i blodet. Herefter transporteres det via blodbanen til knoglemarven, hvor det bindes til en receptor på stamcellerne og fremmer erythropoiesen, hvorunder de røde blodlegemer dannes.

Røde blodlegemer indeholder hæmoglobin, der indeholder en hæm-gruppe, som kan binde ilt.

Derved sørger de røde blodlegemer for at tilføre ilt til musklerne under arbejde. Hurtigt blev det rekombinante EPO opdaget i sportsverdenen, og dets præstationsfremmende virkning er flere gange blevet bevist gennem videnskabelige undersøgelser. Bl.a. kunne Bjørn Ekblom konstatere en klar stigning i den maksimale iltoptagelse efter en rhEPO-kur på 7 uger. Dette skyldes den øgede hæmatokrit, der gør det muligt at binde mere ilt til blodet, og derved udføre aerobt arbejde ved en højere belastning. Fordelen heraf er, at den aerobe forbrænding giver mere energi betydeligt mere energi end den anaerbe. Ulemperne ved rhEPO er også tydelige: mere viskøst blod og derved øget risiko for blodpropper med døden til følge. Præparatet er ikke alene farligt, det er også imod sportens regler, og derfor testes idrætsudøvere jævnligt for rhEPO. Dette kan gøres gennem indirekte tests som f.eks. måling af hæmatokritværdi eller direkte tests som f.eks. elektroforese, hvor proteiners syre-baseegenskaber udnyttes til analyse af en urinprøve. Testmetoden er dog meget følsom, og kan kun spore rhEPO i blodet i op til 2 dage efter indsprøjtning. Mens man stadig kæmper for mere nøjagtige tests til rhEPO, kommer der stadig flere nye stoffer på markedet, og fremtiden ser ikke bedre ud. Få år fremme lurer gendoping nemlig. En metode, der gennem genmanipulation, kun kræver én eneste indsprøjtning, og nyrerne vil danne en unaturlig stor mængde EPO resten af livet. Dette vil blive en stor udfordring for dopingbekæmperne, der er nød til at finde på nye testmetoder. Derfor vil jeg vurdere de indirekte tests til at være vejen frem, hvis dopingproblemet skal til livs, og vi skal have en ren sport, hvor idrætsudøvere på ærlig vis bliver hurtigere, højere og stærkere.

Side 21

Side 20 af 24

8. Litteraturliste

Bøger

• Bidstrup, Bodil Blem m.fl.: Fysiologibogen – den levende krop. 1. Udgave. Nucleus, 2007

• Bremer, Jens: Biokemi og molekylærbiologi. 1. Udgave. Nucleus, 1995 (Bremer, 1995)

• Christoffersen, Gert m.fl.: Fysiologi – kroppens funktioner. 2. Udgave. Nucleus 2001

• Falkenberg, Henrik m.fl.: Fysiologi – fra molekyle til individ. 2. Reviderede udgave. Systime, 2000

(Falkenberg m.fl., 2000)

• Gjerset, Asbjørn m.fl.: Idrættens træningslære, på dansk ved Eva og Jørn Wulff Helge. 1. Gad, 1995

• Larsen, Vagn Juhl m.fl.: Biologisk Minilex. 1. Udgave. Gyldendal, 2000 (Larsen m.fl.,2000)

• Mathiasen, Preben Lund m.fl.: Livet skal leves. 2. Oplæg. Nucleus, 1991

• Mygind, Helge: Kemi 2. 5. Oplæg. Haase, 1992 (Mygind, 1992)

• Mygind, Helge: Kemi 3. 1. Udgave. Haase, 1990 (Mygind, 1990)

• Nielsen, Johs. Thorkildsen: Det levendes kemi. 1. Udgave. Systime 2004 (Nielsen, 2004)

• Torp, Kresten Cæsar: Biokemibogen – liv, funktion, molekyle. 1. Udgave. Nucleus, 2007 (Torp, 2007)

• Tybjerg-Pedersen, Erik og Lotte: Krop og træning. 3. Udgave, Gyldendal, 1999

• Wolf, Troels: Kulhydrater og sundhed. 1. Udgave. Systime, 1996 (Wolf, 1996)

Artikler

• Belalcazar, Viviana m.fl.: “Clarification on the detection of Epoetin Delta and Epoetin. Omega using

isoelectric focusing.” Wiley InterScience. 16/5 2008 (Belalcazar, 2008)

• Ekblom, BjörnT: “Effects of Eryhtropoietin administration”. 1991 (Bilag 2)

• Nielsen, Ole Bækgaard: ”Mælkesyre giver ikke trætte muskler”. Århus Universitet. 30/8 2004 (Nielsen,

2004)

• Saltin, Bengt: ”Hæmatokrit, hvad er det?”, 2000 (Saltin, 2000)

• Sawka M N m.fl.: “Blood Volume: importance and adaptions to exercise training, environmental steesses,

and trauma/sickness” Med. Sci. Sport Exerc., Vol. 32, No. 2, 332-348 (2000)
• WADA: “WADA technical document TD2007EPO”. 31/5 2007 (WADA, 2007)

Internetadresser

• Andersen, Morten: ”Gendoping er mulig, men yderst risikabel.” Ugeskrift for læger. 2006;168(51):4496

http://www.ugeskriftet.dk/portal/page/portal/LAEGERDK/UGESKRIFT_FOR_LAEGER/TIDLIGERE_
NUMRE/2006/UFL_EKCMA_2006_51/UFL_EKCMA_2006_51_51284 (Andersen, 2006)

• Andreasen, Jan: “Paskontrol for idrætsudøvere”. Ugeskrift for læger. 2003

http://www.ugeskriftet.dk/portal/page/portal/LAEGERDK/UGESKRIFT_FOR_LAEGER/TIDLIGERE_
NUMRE/2003/UFL_2003_11/UFL__2003_11_41898 (Andreasen, 2003)

• Anti Doping Danmark: “Dopingregulativet”

http://www.antidoping.dk/Regler/Dopingregulativet.aspx (Anti Doping Danmark 2)

• Anti Doping Danmark: ”Erythropoietin (EPO)”

http://www.antidoping.dk/da/Regler/Dopinglisten_2008/S2%20Hormoner%20og%20lignende%20stoffer
/Erythropoietin%20EPO.aspx (Anti Doping Danmark)
• Berlingske Tidende: ”Rasmussen dopet med ny form for EPO”. 28/9 2007
http://www.berlingske.dk/article//sport// (Berlingske, 2007)

Side 22

Side 21 af 24

• BioNordic: ”Sygdomme og symptomer: Hypertension” 9/9 2003
http://www.bionordic.dk/page.asp?id=166 (BioNordic, 2003)

• Bioportfolio: ”EPOR”

http://www.bioportfolio.com/gene/2057-EPOR.html (Bioportfolio)

• Brandt, Erik: ”Noter til Almen Histologi” 2001

http://www.mdb.ku.dk/manan/notedoktor/erik_celle_histologi.pdf - s. 50 (Brandt, 2001)

• Danmarks Farmaceutiske Højskole: ”EPO – lægemiddel eller dopingmiddel?” 1998

http://hjem.get2net.dk/gulddame/epo.html#Erythropoietins%20fysisk-kemiske%20egenskaber (DFH,

1998)

• Danske Bioanalytikere: ”Spor af EPO”. 5/9 2008
http://www.dbio.dk/forside/fagbladet/tidligere-numre/aargang-2008/blad-nr--9---udkommet-5--
september-2008/spor-af-epo (Danske Bioanalytikere, 2008)
• Hansen, Jens Gjesse: ”Epo-test virker ikke”. 27/6 2008
http://www.dr.dk/sporten/oevrig_sport/doping/2008/06/27/094548.htm

• Høi-Hansen, Thomas m.fl.: ”Pure red cell-aplasi udviklet under erythropoietinbehandling”. Ugeskrift for

læger. 12/2 2003
• Istituts für Biochemie: ”EPO nachtweis – Doping“ 18/2 2002
http://www.dshs-koeln.de/biochemie/rubriken/00_home/00_epo2.html (Institut für Biochemie, 2002)

• Jensen, Ib: ”Hæmatokrit og Træning – Hårde Facts og Myter”

http://www.cykelmotion.dk/Artikler/H%E6matokrit.pdf (Jensen)
• Klaus Bendtzen: ”Immunogenicitet af biologiske lægemidler” Ugeskrift for læger. 2/10 2003
http://www.ugeskriftet.dk/portal/page/portal/LAEGERDK/UGESKRIFT_FOR_LAEGER/TIDLIGERE_
NUMRE/2003/UFL_2003_48/UFL__2003_48_42740 (Bendtzen, 2003)
http://www.ugeskriftet.dk/portal/page/portal/LAEGERDK/UGESKRIFT_FOR_LAEGER/TIDLIGERE_
NUMRE/2003/UFL_2003_19/UFL__2003_19_40535 (Høi-Hansen, 2003)

• Løvschall, Henrik og Erik Christophersen: ”Blodlegemedannelse”

http://molar.odont.au.dk/anatomi/anatomi_dias_programmer/Blodlegemedannelse%20-%20Gml-
filer/frame.htm#slide0008.htm (Løvschall m.fl.)

• Medicinsk-Anatomisk Institut, København: ”Blodets celler”

http://www.mai.ku.dk/2sem/Noter/Blodets_celler.htm (MAI København)
• Sand, Ole: ”CERA”. 25/10 2008
http://www.pedaleur.dk/debat/viewtopic.php?f=29&t=603 (Sand, 2008)

• Spahlinger, Diana og Lisa King: ”Erythropoietin” 2007

http://biology.kenyon.edu/BMB/Chime2/2004/eryth/FRAMES/start.htm (Spahlinger m.fl., 2007)
• Terney, Ole: ”Hvad er dopingmidlet EPO” 27/7 2007
http://www.nanonyt.dk/2007/07/27/hvad-er-dopingmidlet-epo-2/ (Terney, 2007)

Andet

• Power Point af Eva Horn Møller, adjunkt, Institut for Farmaci og Analytisk Kemi: Fortællinger om EPO,

2007 (Møller, Eva Horn, 2007)

• Radioudsendelse: Videnskabens Verden: Gendoping, 01. marts 2008 kl. 16:03 på P1 (P1, 2008)

Side 23

Side 22 af 24

Bilag 1

http://www.sciprogen.com/en/images/xulie.jpg

Bilag 2

Ekblom, BjörnT: “Effects of Eryhtropoietin administration”. 1991

EFFECTS OF ERYTHROPOIETIN ADMINISTRATION

The progression of cells from the haemopoietic stem cell is controlled and regulated by a complex system of stimulators and inhibitors of which erythropoietin (EPO) is one essential component. It is at present not known how much the whole system can be manipulated by the stimulation of di€erent factors in this system, but it is clear that such stimulation may generate ethical and moral problems in the sporting world.

EPO is a glycoprotein (40% carbohydrate) with a molecular weight of about 34 kDa,

produced mainly in the tubular cells of the kidneys but also ± importantly ± in the

liver. Oxygen availability in the kidneys and liver is the main regulator of EPO production. Hypoxia due to anaemia or low plasma oxygen pressure leads to an increase in EPO secretion. EPO receptors in the bone marrow enhance the mitosis and di€erentiation of the red blood cell precursors, leading to production of red blood cells. Serum EPO concentration, measurable via immunoassays or bioassays, peaks during the day. It is increased in anaemic situations and reduced at polycythaemia.

Strenuous training, transition from sea-level to altitude and other activities may cause complex changes in serum EPO and inter- and intra-individual variations are so great that quantitative determination of EPO for the detection of illegal administration is di•cult. EPO is now available through recombinant DNA techniques and recombinant human EPO (rhRPO) has now become a very important substance for the treatment of

Side 24

Side 23 af 24 di€erent diseases. It has been questioned whether or not injections of rhEPO into normal, healthy subjects would accelerate erythropoiesis, giving higher [Hb] and, thus, increase the possibility of enhancing VO2max and performance. However, two

studies23,24 examining the e€ects of the administration of rhEPO (20±40 IU/kg body

weight three times a week for 7 weeks) in normal young men both at rest and during submaximal and maximal exercise showed:

1. [Hb] at rest increased ± from 152 to 169 g/l. Hct increased from 44 to 49%.

2. BV remained unchanged.

3. VO2max increased from 4.52 to 4.88 l/min with fairly small interindividual variation

(see Figure 3).The increase inVO2maxper gramincrease in [Hb] (about 20 mlO2 per gram Hb) was the same as the corresponding e€ect of reinfusion of whole blood and packed RBCs (see Figure 2).

4. During standardized exercise (200 W) VO2 was unchanged, HR was reduced ( from

144 to 138 beat/min) while [Hla] was unchanged.

The e€ect of rhEPO administration on high-intensity intermittent exercise was also evaluated.25 During a single bout of exercise of a few seconds duration, ATP is resynthesized at ®rst by anaerobic pathways. However, if this type of exercise is repeated i.e. every 30th second, then aerobic metabolism may also become important.

In this study six healthy men performed 15 high-intensity bouts of 6 seconds' duration interspersed with 24 seconds' passive rest before and after a period of rhEPO

administration, during which VO2max increased by 8% ( from 4.76 to 5.14 l/min).

Plasma [Hla] and hypoxanthin concentrations were used as markers of the anaerobic metabolism. Comparison of before and after levels showed a reduction in both [Hla] and [hypoxanthin] after the rhEPO administration period. This indicates that the

94 B. T. Ekblom enhanced oxygen transport capacity improved the recovery process and possibly also increased the aerobic energy yield during the exercise, showing that both the circulation and the arterial oxygen content and transport may play important roles even during short-term, high-intensity exercise such as in most ball sports.