SRO om enzymkinetik og mindste kvadraters metode i Bioteknologi A og Matematik A

Side 1

Side 1 af 22

SRO for 2. y 2012

Opgaveformulering:

Med udgangspunkt i enzymet catecholase, som du har lavet to forsøg med, skal du lave enzymkinetiske undersøgelser.

Du skal redegøre for centrale begreber i enzymkinetik, idet du, i den udstrækning det er muligt, både redegør for den biokemiske og den matematiske betydning af begreberne.

Du skal beskrive den teoretiske baggrund for den enzymatiske proces og herunder komme ind på enzymers opbygning og funktion, temperatur og pH afhængighed samt inhibitorer.

Efterfølgende skal du opstille en matematisk model der kan beskrive de fundne data.

Denne model skal efterprøves med brug af regression.

Modellens beregninger og de fundne data skal sammenlignes og du skal prøve at redegøre for evt. forskelle.

Du skal redegøre for de anvendte eksperimentelle metoder, herunder hvorfor de er valgt og for fejlkilder, og du skal vise de relevante beregninger.

Du skal forklare princippet i mindste kvadraters rette linje. Du skal herunder give en

redegørelse/bevis for, hvorledes stigningstal og konstantled i en lineær regression

beregnes. Illustrer med et lille selvvalgt datasæt bestående af tre talsæt metoden ved håndkraft og sammenlign med resultatet ved brug af IT-værktøj.

Side 2

Side 2 af 22

Indhold

Opgaveformulering: ................................................................................................................................................ 1 Abstract ................................................................................................................................................................... 3 Indledning ................................................................................................................................................................ 4 Enzymer og enzymkinetik .......................................................................................................................................... 4 Forsøg med catecholase ............................................................................................................................................ 7 Analyse af forsøgsdata ............................................................................................................................................... 9 Lineær regression ved mindste kvadraters metode ............................................................................................... 10 Mindste kvadraters metode på forsøgsdata .......................................................................................................... 11 Konklusion .............................................................................................................................................................. 13 Kildehenvisning .................................................................................................................................................... 13 Bilag 1: Forsøgsdata .............................................................................................................................................. 14 Bilag 2: Lineweaver-Burk plot over forsøgsdata ................................................................................................... 15 Bilag 3: Michaelis-Menten plot over forsøgsdata ................................................................................................. 16 Bilag 4: Graf over absorbans pertid med inhibitor ............................................................................................... 18 Bilag 5: Graf over absorbans per tid uden inhibitor.............................................................................................. 19 Bilag 6: Forsøgsvejledning ..................................................................................................................................... 19

Side 3

Side 3 af 22

Abstract

This paper combines mathematics and biotechnology in the attempt to shed light on how mathematical methods can be useful in the analysis of information from a biotechnical experiment. The paper describes the function and structure of enzymes and how enzymes are influenced by temperature, acidity and inhibitors. The paper will furthermore account for enzyme kinetics and the important concepts V and K and how these are connected in Michealis-Menten’s equation and Lineweaver-max M,

Burk’s equation. The paper will include an example of how these two equations are being used to find V og KM. Additionally the paper illustrates how to do linear regression and determine the best max straight line by using the least squares method. The least squares method will be used to find the best linear expression for the graph made by the Lineweaver-Burke equation. At last the paper sums up what have been examined and concludes that IT-tools are probably using the least squares method and that the inhibitor used in the experiment is an uncompetitive inhibitor.

Side 4

Side 4 af 22

Indledning

Denne opgave vil beskæftige sig med emnerne enzymkinetik, og hvorledes mindste kvadraters metode benyttes i arbejdet med lineær regression.

Der vil være et redegørende afsnit, hvor der især lægges vægt på enzymers opbygning og funktion, samt hvilke faktorer der påvirker enzymer.

Dernæst vil det vises, hvorledes lineær regression kan benyttes til at analysere biokemiske forsøgsdata. Da mindste kvadraters metode kan bruges forskelligt, vil her blive fokuseret på sumformler. Herunder vil også være en forklaring af mindste kvadraters metode samt en kort gennemgang af et forsøg med enzymet catecholase.

Til arbejdet med forsøgsdataene vil Michaelis-Mentens ligning og Lineweaver-Burks ligning blive brugt.

Enzymer og enzymkinetik

Overalt i og omkring os sker der biokemiske reaktioner. Mange af disse biokemiske processer forløber meget langsomt eller slet ikke, hvis ikke de katalyseres af en katalysator, som oftest et enzym.

Når en proces katalyseres af et enzym nedsættes den mængde energi, der kræves for at processen forløber, kaldet aktiveringsenergien. På denne måde kan enzymer øge hastigheden af kemiske reaktioner med faktorer

fra 50 til 10^{24}.

Hvad der er i stand til at øge hastigheden i så stor grad, vil det næste afsnit fortælle om.

Enzymer er proteiner der er sammensat af to dele. Det samlede enzym kaldes holoenzym og består af en cofaktor og et apoenzym.

Apoenzymet er selve proteindelen og har i sig selv ingen katalytisk evne.

En cofaktor er en ikke-protein forbindelse, der er nødvendig for at enzymet kan fungere. Cofaktorer kan være flere forskellige ting blandt andet metalioner eller vitaminer. Er cofaktoren en organisk forbindelse, kaldes det et coenzym. (Bruun & m.fl., 2010)

Når man beskriver enzymers struktur, gøres det på fire niveauer: primær, sekundær, tertiær og kvartær struktur.

Enzymer er som alle andre proteiner opbygget af aminosyrer, der danner polypeptidkæder, og aminosyresekvensen er det, der kaldes den primære struktur. Aminosyresekvensen er unik for hvert enzym og bestemmes af generne.

Polypeptidkædernes form, som α-helixer eller ß-foldebladsstruktur, er den sekundære struktur. Den sekundære struktur bestemmes af hvilke aminosyrer, der indgår i aminosyreskevensen.

Den tertiære struktur er måden disse polypeptidkæder ligger placeret i forhold til hinanden.

Den kvartære struktur er ikke at finde hos alle enzymer, da det er hvorledes enzymets subunits er placeret i

Side 5

Side 5 af 22 forhold til hinanden. Denne struktur afhænger af om enzymet indeholder flere undergrupper. (Bruun & m.fl.,

2010)

Når et enzym skal katalysere en proces, foregår det i to trin.

Først skal enzymet (E) genkende substratet (S), binde sig hertil og danne et enzymsubstratkompleks (ES).

Substratet binder til enzymets aktive center, der i de fleste tilfælde vil ændre form, når det bindes til substratet.

Dette gøres for at sikre, at komplekset er lukket tæt sammen, så der ikke kan komme vand ind. Modellen kaldes induced fit.

Alle enzymer er specifikke for en bestemt proces, da deres struktur passer til netop ét substrat.

Derefter går selve katalysen i gang, og substratet omdannes til et produkt (P).

Efterhånden som enzymet omdanner substratet til produkt, vil mængden af substrat blive mindre og mængden af produkt blive større, men enzymerne forbruges ikke.

Processen ses her som en reaktionsligning:

Her er k, k og k hastighedskonstanter der beskriver, hvor hurtigt

1 -1 2 enzym og substrat bindes (k

1 -1

) og spaltes igen (k

), og hvor hurtigt katalysen foregår (k).

2

Da k

1 -1 2 og k som regel er større end k

, vil det katalytiske trin være det hastighedsbegrænsende trin. Den maksimale hastighed afhænger altså af k. (Sigurskjold)

2

Da enzymer er biologiske molekyler, er der forskellige faktorer, der påvirker enzymers arbejde, heriblandt temperatur og surhedsgrad.

Da enzymer er proteiner, vil de denaturere og udfoldes, hvis de befinder sig i det forkerte miljø. Dette resulterer i det, der kaldes temperatur- og pH-optimum.

                                                                o
De fleste enzymer har temperaturoptimum omkring kropstemperatur, altså ved 35-40

C, men der findes også termofile og psykrofile enzymer, der kan arbejde ved henholdsvis langt højere temperaturer og lavere.

Er temperaturen lavere end det optimale, sænkes reaktionshastigheden uden at ødelægge enzymet, mens enzymet vil miste sin tredimensionale struktur ved for høje temperaturer.

Hvis enzymet befinder sig i et miljø, der er for surt eller basisk, vil nogle af aminosyrerne skifte ladning, og det vil påvirke enzymets rumlige struktur. (Blicher, Proteinstruktur, 2011)

En anden faktor, der kan påvirke enzymers arbejde, er inhibitorer. Der findes tre forskellige slags inhibitorer, der virker på hver sin måde, men fælles for dem er, at de hæmmer enzymaktiviteten ved at binde sig til enzymet uden at blive omsat.

Den mest udbredte form for inhibering er kompetitive inhibitorer. De konkurrerer så at sige med substratet om pladsen i enzymet, ved at binde sig til samme aktive center som substratet, og hermed forhindre binding Kilde: Sigurdskjold side 1

Side 6

Side 6 af 22 af substrat.

Ved kompetitiv inhibering forøges K

M max M max

, mens V forbliver det samme. Hvad K og V er, vil jeg komme ind på senere i opgaven.

I modsætning til kompetitive inhibitorer, vil nonkompetitive inhibitorer ikke binde samme sted som substratet. En non-kompetitiv inhibitor vil altså ikke konkurrere med substratet, men i stedet hæmme ved at forplante sin virkning gennem proteinstrukturen, ofte med deformering til følge. Dette vil nedsætte den katalytiske hastighed. Nonkompetitive inhibitorer kan derfor genkendes på at V sænkes, mens K er max M uændret.

Den sidste form for hæmning er den ukompetitive inhibitor, der ligesom den nonkompetitive inhibitor binder sig til et andet sted end substratet, og sænker den katalytiske hastighed. Ukompetitive inhibitorer kan dog først binde sig til enzymet, efter at substratet er bundet og har åbnet for bindingen af inhibitoren.

Ved ukompetitiv inhibering sænkes K

M dog også, da der kræves mindre substrat at nå det halve af den maksimale hastighed. (Sigurskjold)

I arbejdet med enzymer er det også væsentlig at have kendskab til enzymkinetik, altså læren om enzymers bevægelse og deres reaktionshastigheder.

Indenfor enzymkinetik beskæftiger man sig især med de to størrelser K og V.

M max

V er den maksimale hastighed hvormed enzymer kan omdanne substrat til produkt, og da k er en max 2 konstant, og som sagt er det hastighedsbegrænsende trin, vil den maksimale hastighed være proportional med

mængden af enzym V_{max} = 𝑘_{2} ∙ [ 𝐸].

Hastigheden hvormed enzym omdanner substrat til produkt vil stige, når substratkoncentrationen stiger, og nærme sig den maksimale hastighed. Den maksimale hastighed nås, når alle enzymer er ”mættet” af substrat.

På billedet ses hastigheden afbilledet ved Michaelis-Mentens ligning, som jeg vil komme ind på senere, hvor V max max max.

dog er en asymptote, så hastigheden vil kun nærme sig V

, men aldrig nå V

K er en konstant kaldet Michaelis-konstanten. Den er sammensat af hastighedskonstanterne k, k og k i M 1 -1 2

                  𝑘
                   −1
sammenhængen 𝐾  =       .
              𝑀

+𝑘_{2}
𝑘_{1}

K

M M er et udtryk for enzymets evne til at binde substrat. Jo mindre K er, jo bedre er enzymet til at genkende substratet. Dette ses ved, at K

M er den substratkoncentration, hvor enzymet arbejder med halvdelen af den

                                    1
maksimale hastighed. Det vil sige, at hvis 𝑣 = 𝑉 vil [ 𝑆 ] = 𝐾 . Enzymet vil altså hurtigere nå den
                                      𝑚𝑎𝑥          𝑀
                                    2

maksimale hastighed, jo mindre K

M er, og grafen vil da være stejlere i begyndelsen.

Er enzymet påvirket af en inhibitor der sænker K og/eller V, skrives dette som K^{app} og V^{app}, da det er

M max M max den tilsyneladende K og V.

M max

Kilde: Sigurskjold side 3

Side 7

Side 7 af 22

                                            𝑉
                                             𝑚𝑎𝑥
Der er følgende sammenhæng mellem V og K at 𝑣 =   . Dette kaldes Michaelis-Menten
                                            𝐾  +[𝑆]
                                             𝑀

max M

∙[𝑆] ligningen. Ved at benytte Michaelis-Menten ligningen fås en hastighedsgraf, der viser hastigheden som funktion af substratkoncentrationen.

Michaelis-Menten ligningen kan matematisk omskrives til en ret linje, ved at bruge de reciprokke værdier.

                                              1   𝐾    1    1
                                                   𝑚
Dette kaldes et Lineweaver-Burke plot og fås ved ligningen = ∙ + .
                                              𝑣  𝑉    [𝑆] 𝑉
                                                  𝑚𝑎𝑥      𝑚𝑎𝑥

Man kan da aflæse_{𝑉_{𝑚𝑎𝑥}}^{𝐾_{𝑀}} som grafens hældning og_{𝑉_{𝑚𝑎𝑥}}^{1} som konstantleddet, skæringspunktet med y-aksen.

Lineweaver-Burks plot anvendes ofte til at analysere eksperimentelle data, da det er nemt at aflæse data herfra. Michaelis-Mentens plot er dog mere præcist, da eventuelle små usikkerheder vil blive mere udtalte ved den reciprokke værdi. (Sigurskjold)

Forsøg med catecholase

Catecholase er et enzym, der findes naturligt i alle planter og indgår i plantens forsvarssystem. Catecholases substrat er catechol, der omdannes til det beskyttende og antibakterielle o-benzoequinon.

I forsøget med catecholase, blev enzymaktiviteten undersøgt både med og uden inhibitor. Dette er gjort ved at opstille to fortyndingsrækker, for at finde hastigheden ved forskellige substratkoncentrationer. Inihibitoren benyttet i dette forsøg er phenylthiocarbamid (PTC). Herefter er der målt på enzymaktiviteten ved hjælp af et spektrofotometer. Dette kan lade sig gøre, idet substratet catechol er farveløst, mens produktet o-benzoequinon har en gulbrun farve. Ved forsøg med forskellig bølgelængde, er det blevet bestemt, at lys med bølgelængden 540 nm absorberes bedst af o-benzoequinon.

Enzymaktiviteten kan altså nu måles som ændring i absorbans per tid, da en stigning i produkt vil resultere i en stigning i absorbans. Ved undersøgelse af enzymaktivitet benyttes ofte spektrofotometri, da det er en nem, billig og sikker metode at måle aktiviteten præcist.

Der skal dog tages højde for, at da enzymopløsningen i dette forsøg er kartoffelekstrakt, kan opløsningen indeholde en smule catechol i sig selv, hvilket der ikke tages højde for i substratkoncentrationerne.

Endvidere kan der som i alle former for eksperimentelle øvelser ske fejl ved afvejning og afmåling.

Med inhibitor

Uden inhibitor

Side 8

Side 8 af 22

Ved at udføre lineær regression på disse grafer fås hastighed som ændring i absorbans per tid som hældning,

    Δ𝐴
𝑣 =   . Disse værdier kan ved hjælp af Lambert-Beers lov omregnes til hastighed i ændring af
    Δ𝑡

substratkoncentration per tid, der kan benyttes til at lave en hastighedsgraf med Michealis-Menten ligningen.

Lambert-Beers lov foreskriver, at absorbansen er proportional med stoffets absorptionskoefficient (Ɛ) ved den givne bølgelængde, i dette forsøg 540 nm, stoffets molære koncentration (c) og lysvejens længde, tykkelsen

af kuvetterne, (l), altså 𝐴 = 𝜀 ∙ 𝑐 ∙ 𝑙

For at få udtrykt hastigheden som ændring i koncentration per tid omregnes således:

    Δ𝑐   Δ𝐴 1
𝑣 =   =    ∙
    Δ𝑡  Δ𝑡∙𝑙 𝜀

Da lysvejens længde er 1cm, er det muligt at se bort fra at gange med l, og man kan da omregne ved at gange

                        1
                                                           -1     -1
hældningerne fra graferne med . De resterende enheder vil da være mM, mM , cm, cm og sekunder,
                        𝜀

hastigheden vil derfor automatisk komme ud i sekunder, derfor regnes her uden enheder. (Forsøgsvejledning) Absorptionskoefficienten findes ved:

    𝐴   0,834
𝜀 =   =     = 0,1158333
    𝑐∙𝑙

7

Hastighederne i ændring i substratkoncentration per tid beregnes således:

        Δ𝐴 1               1
Run 3: =  ∙  = 0,002719 ∙       = 0,023
        Δ𝑡∙𝑙 𝜀          0,1158333

Fravær af inhibitor

Run [S] ΔA/Δt Δc/Δt ΔA/Δt Δc/Δt
mM s^{−1} mM s^{−1} s^{−1} mM s^{−1}

3 1,800 0,002719 0,130

4 0,900 0,002358 0,454

5 0,450 0,001936 0,907

6 0,225 0,001270 0,878

Run [S] mM

8 3,600 0,0007384 0,6261

9 1,800 0,0006553 0,6189

10 0,900 0,0006803 0,3527

11 0,450 0,0005174 0,2591

12 0,225 0,0004765 0,9066

Tilstedeværelse af inhibitor

Side 9

Side 9 af 22

Ud fra disse oplysninger tegnes nu to hastighedsgrafer med hastigheden i ændring af koncentration per tid op af andenaksen, og substratkoncentrationen hen af førsteaksen.

Ved at udføre non-lineær regression med Michaelis-

Menten ligningen fås at

𝐾_{𝑀}^{𝑎𝑝𝑝} = 0,1457 𝑚𝑀 𝑉_{𝑚𝑎𝑥}^{𝑎𝑝𝑝} = 0,0064

𝑚𝑀 𝑠𝑒𝑘

Både K og V sænkes altså af inhibitoren, der

M max derfor må være en ukompetitiv inhibitor.

Denne hastighedsgraf kan som tidligere omtalt omskrives til en lineariseret form, Lineweaver-Burk plottet:

Også her kan V og K aflæses, men der vil være en max M smule usikkerhed i disse værdier, da Lineweaver-Burk plot som tidligere omtalt ikke er ligeså præcist somMichaelis-Menten plot.

𝐾_{𝑀} = 0,3602 𝑚𝑀 𝑉_{𝑚𝑎𝑥} = 0,02884

𝑚𝑀 𝑠𝑒𝑘

𝐾_{𝑀}^{𝑎𝑝𝑝} = 0,1300 𝑚𝑀 𝑉_{𝑚𝑎𝑥}^{𝑎𝑝𝑝} = 0,006303

𝑚𝑀 𝑠𝑒𝑘

Analyse af forsøgsdata

Ved analyse af forsøgsdata, er det ofte en god idé at bruge regression. På den måde kan man få et udtryk, der kan forudsige udfald, samt en mulighed for at undersøge, om der er en sammenhæng mellem forsøgsdataene.

Ved arbejde med enzymkinetik kan man som tidligere omtalt komme frem til et lineært Lineweaver-Burk plot, derfor vil kun lineær regression blive omtalt her.

Ud over lineær regression findes der forskellige former for nonlineær regression, blandt andet eksponentiel regression og potens regression.

                              Δ𝑐
Michealis-Menten plot der viser 𝑣 =
                               𝑡

Rød (øverst) uden inhibitor Blå (nederst) med inhibitor

Lineweaver-Burk plot

Orange (øverst) med inhibitor Grøn (nederst) uden inhibitor

Side 10

Side 10 af 22

Lineær regression ved mindste kvadraters metode

Ved lineær regression undersøger man om en række punkter ligger på en ret linje og dermed har

sammenhængen 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏.

En række punkter kan godt have en lineær sammenhæng uden at ligge præcis på en ret linje, men hvis dette er tilfældet, hvordan skal linjen så lægges?

Det kan man finde ud af ved hjælp af mindste kvadraters metode.

Ved mindste kvadraters metode laver man et kvadrat fra hvert punkt lodret op eller ned til den rette linje, og den bedste rette linje er da den, hvor summen af kvadraternes areal er mindst.

Grunden til, at man benytter arealet af kvadrater og ikke bare afstanden, er, at man da undgår problemer med negative værdier, der ellers vil fremkomme, eftersom punkterne ligger både over og under linjen. (Carstensen & Frandsen, MAT 1, 1997) Afstandskvadratet findes da ved:

𝐷 = 𝑑_{1}^{2} + 𝑑_{2}^{2} + ⋯𝑑_{𝑛}^{2}.

Eller ved at benytte sumformler:

∑ ( 𝑎 ∙ 𝑥_{𝑖} + 𝑏 − 𝑦_{𝑖})^{2}

𝑛

𝑖=1

Hvor n er antallet af værdier, her punkter, i løber fra 1 til n, a er hældningskoefficienten og b er konstantleddet, skæringspunktet med y-aksen.

Ud fra denne definition på afstandskvadratet, kan a og b isoleres til følgende formler:

Hvordan a og b beregnes ved hjælp af disse to formler vil her demonstreres med datasættene fra forsøget med catecholase.

Side 11

Side 11 af 22

Mindste kvadraters metode på forsøgsdata

Ved at kigge på Lineweaver-Burk plottet ses det tydeligt, at punkterne ikke ligger præcist på de to rette linjer, der er tegnet. Om den valgte linje så er den bedste rette linje, kan undersøges ved at bruge mindste kvadraters metode.

Jeg får brug for at kende summen af x-værdierne, summen af y-værdierne, summen af x- og y-værdiernes produkt og summen af x-værdierne kvadreret.

Uden inhibitor:

x y xꞏy x^{2}

0,556 42,6014466 23, 0,308642

1,111 49, 54, 1,234568

2,222 59,8312672 132,9583716 4,938272

4,44444 91, 405,3659958 19,753086

Sum 8,333 242,7636139 616,573561 26,234568

Her benyttes 4 punkter, altså er:

Det ses i skemaet at:

Tallene kan nu indsættes i formlerne, og hældningskoefficienten og konstantleddet kan beregnes.

Den bedste rette linje for disse tal har altså følgende forskrift:

𝑦 = 12,49 ∙ 𝑥 + 34,67

Side 12

Side 12 af 22

For at kunne sammenligne med hældningen og konstantleddet fra grafen, må disse værdier først omregnes, da LoggerPro viser K og V og ikke hældningen og konstantled.

M max

                                                𝐾     0,3602𝑚𝑀
                                                 𝑀
Hældningen i Lineweaver-Burke plottet er som tidligere nævnt = = 12,49.
                                                           𝑚𝑀
                                                𝑉
                                                𝑚𝑎𝑥   0,02884
                                                           𝑠𝑒𝑘

Konstantleddet i Lineweaver-Burk plotter findes som tidligere nævnt ved

1 1

𝑉_{𝑚𝑎𝑥}

=         = 34,67.
       𝑚𝑀
  0,02884
       𝑠𝑒𝑘

Forskriften fundet ved hjælp af mindste kvadraters metode er altså magen til forskriften fundet af LoggerPro, og herfra kan det konkluderes, at den af LoggerPro valgte linje er den bedste rette linje.

De samme beregninger kan gøres på Lineweaver-Burke plottet for enzymaktivitet med inhibitor.

Med inhibitor:

x y xꞏy x^{2}

0,277778 156,8707 43,5752 0,07716

0,555556 176,7638 98,20212 0,308642

1,111111 170,268 189,1867 1,234568

2,222222 223,8758 497,5018 4,938272

4,444444 243,092 1080,409 19,75309

Sum 8,611111 970,8703 1908,875 26,31173

Da der her er et talsæt mere, er

Ellers udføres beregningerne på nøjagtig samme måde:

Side 13

Side 13 af 22

Forskriften for den bedste rette linje bliver da 𝑦 = 20,3 ∙ 𝑥 + 158,65.

For at sammenligne med den af LoggerPro fundne linje må værdierne K og V igen omregnes til

M max hældning og konstantled:

          𝑎𝑝𝑝
         𝐾
          𝑀
Hældning =    =          = 20,63
          𝑎𝑝𝑝
                      𝑚𝑀
         𝑉
                0,006303
          𝑚𝑎𝑥
                      𝑠𝑒𝑘

0,13 𝑚𝑀

            1
Konstantled =  =          = 158,65
            𝑎𝑝𝑝
                       𝑚𝑀
           𝑉
                 0,006303
            𝑚𝑎𝑥
                       𝑠𝑒𝑘

1

LoggerPro har altså igen fundet den bedste rette linje.

Konklusion

Efter besvarelse af den givne opgaveformulering kan en række konklusioner drages. Ved hjælp af matematiske værktøjer som Michaelis-Mentens ligning, Lineweaver-Burks ligning og lineær regression kan enzymkinetiske værdier bestemmes. Ved at bestemme K

M max og V for enzymet catecholase, har det været muligt at bestemme, at PTC er en ukompetitiv inhibitor. Det må formodes, at IT-værktøjer benytter mindste kvadraters metode til bearbejdning af data ved lineær regression, da der opnås de samme resultater ved at bruge IT-værktøjer og beregne hældningskoefficient og konstantled ved mindste kvadraters metode.

Kildehenvisning

Blicher, T. (13. Juni 2011). Proteinstruktur. Hentede 16. Marts 2012 fra Biotech Academy:

http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/amp/teori/proteinstruktur.aspx

Blicher, T. (13. Juni 2011). Enzymer. Hentede 17. Maj 2012 fra Biotechacademy:

http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/enzymer/teori/enzymer.aspx

Side 14

Side 14 af 22

Bruun, K., & m.fl. (2010). Enzymer. I K. Bruun, & m.fl., Bioteknologi 1 (s. 134-151). Gyldendal.

Carstensen, J., & Frandsen, J. (1997). MAT 1.

Viborg: Systime.

Carstensen, J., Frandsen, J., & Sutdsgaard, J.

(2006). MAT A2. Viborg: Systime.

Forsøgsvejledning. (u.d.). Enzymkinetik med catecholase.

Sigurskjold, B. W. (u.d.). Kompendie: Enzymkinetik.

Vaiana, M. (10. Oktober 2010). 4.2 Summation Formulas and Sigma Notation. Hentede 15. Marts 2012 fra

Youtube: http://www.youtube.com/watch?v=oSgTjkr8o8A&feature=related

Wolf, T., & m.fl. (2008). Biologi C+B. Århus: Systime.

Bilag 1: Forsøgsdata

[S] = substratkoncentration

U = uden inhibitor

I = med inhibitor

[S] U I 1/[S] 1/U 1/I

3,6 0,006375 0,277778 156,8707

1,8 0,023473 0,005657 0,555556 42,60145 176,7638

0,9 0,020357 0,005873 1,111111 49,12355 170,268

0,45 0,016714 0,004467 2,222222 59,83127 223,8758

0,225 0,010964 0,004114 4,444444 91,20735 243,092

Side 15

Bilag 2: Lineweaver-Burk plot over forsøgsdata
1/I   1/U
250 200 150 100 50
1/[S]
1 2 3 4
(0,775, 123,60)

Linear Fit for: Data Set | 1/I
1/I = mx+b
m (Slope): 20,63
b (Y-Intercept): 158,7
Correlation: 0,9389
RMSE: 14,79

Auto Fit for: Data Set | 1/I
1/I = b/ax+1/a
b: 0,1300 +/- 0,02752
a: 0,006303 +/- 0,0003979
RMSE: 14,79

Linear Fit for: Data Set | 1/U
1/U = mx+b
m (Slope): 12,49
b (Y-Intercept): 34,67
Correlation: 0,9967
RMSE: 2,133

Auto Fit for: Data Set | 1/U
1/U = b/ax+1/a
b: 0,3602 +/- 0,02065
a: 0,02884 +/- 0,001525
RMSE: 2,133
Side 15 af 22

Side 16

Side 16 af 22

Bilag 3: Michaelis-Menten plot over forsøgsdata

Side 17

I  U
0,020 0,015 0,010 0,005
[S]
1 2 3
(0,627, 0,00933548)

Auto Fit for: Data Set | U
Uden inhibitor = ax/(b+x)
a: 0,02781 +/- 0,0008438
b: 0,3240 +/- 0,03146
RMSE: 0,0005012

Auto Fit for: Data Set | I
Med inhibitor = ax/(b+x)
a: 0,006443 +/- 0,0003300
b: 0,1457 +/- 0,04155
RMSE: 0,0003804
Side 17 af 22

Side 18

Bilag 4: Graf over absorbans pertid med inhibitor
Absorbance at 539,4 nm
0,15 0,13 0,11 0,09 0,07
Time (s)
0 50 100
(21,79, 0,10456)

Linear Fit for: Run 10 | Absorbance at 539,4 nm
Abs-539,4 = mt+b
m (Slope): 0,0006803
b (Y-Intercept): 0,09840
Correlation: 0,9944
RMSE: 0,0004177

Linear Fit for: Run 9 | Absorbance at 539,4 nm
Abs-539,4 = mt+b
m (Slope): 0,0006553
b (Y-Intercept): 0,09827
Correlation: 0,9337
RMSE: 0,001455

Linear Fit for: Run 11 | Absorbance at 539,4 nm
Abs-539,4 = mt+b
m (Slope): 0,0005174
b (Y-Intercept): 0,08998
Correlation: 0,9914
RMSE: 0,0003955

Linear Fit for: Run 8 | Absorbance at 539,4 nm
Abs-539,4 = mt+b
m (Slope): 0,0007384
b (Y-Intercept): 0,08420
Correlation: 0,9825
RMSE: 0,0008099

Linear Fit for: Run 12 | Absorbance at 539,4 nm
Abs-539,4 = mt+b
m (Slope): 0,0004765
b (Y-Intercept): 0,07195
Correlation: 0,9748
RMSE: 0,0006309
Side 18 af 22

Side 19

Side 19 af 22

Bilag 5: Graf over absorbans per tid uden inhibitor

Bilag 6:

Forsøgsvejledning

Side 20

Side 20 af 22

Enzymkinetik med catecholase

I denne øvelse skal vi arbejde med enzymet catecholase (også kaldet catecholoxidase eller polyphenoloxidase).

Enzymet forekommer almindeligt i planterceller i små vesikler og kan udvindes fra f. eks. frisk kartoffelsaft.

Enzymet er en del af plantens forsvarssystem. Enzymets substrater er catechol (også kaldet pyrocatechol eller

1,2-dihydroxybenzen) og dioxygen fra luften. Produktet er o-benzoequinon. Ligevægten er forskudt helt mod højre.

Substraterne er farveløse, mens o-benzoequinon har en gulbrun farve, som kan måles med et spektrofotometer.

Formål:

I dette forsøg undersøges enzymkinetikken for catecholase. Desuden undersøger vi den hæmmende virkning af phenylthiocarbamid.

Materialer:

- Friske mellemstore kartofler

- Kartoffelskræller og kniv

- Blender

- Filter, sugekolbe og Büchnertragt

- Vægt

- 13 Reagensglas

- 500 mL og 250 mL koniske kolber

- 10 mL, 100 mL og 250 mL måleglas

- Prop

- Reagensglasstativ

- Is og isbad

- 1,2-Dihydroxybenzen (catechol)

- Phenylthiocarbamid (PTC)

- Demineraliseret vand

- Pipetter og pipettespidser

- Spektrofotometer

2 + O 2

2

Side 21

Side 21 af 22

- Kuvette

- Computer med LoggerPro til dataopsamling

Fremgangsmåde:

1. Spektrofotometret tændes, og bølgelængden indstilles til 540 nm.

2. Der skal fremstilles 2 fortyndingsserier. To rækker reagensglas med 6 i hver sættes op i et stativ. Glassene i hver serie mærkes 1-6. Den ene serie mærkes yderligere med PTC. I hver række bliver koncentrationen i et reagensglas halvdelen af koncentrationen i det foregående.

3. I glas 2-6 i hver serie påfyldes 5 mL vand.

4. Afvej 159 mg catechol og opløs det i 200 mL vand i en konisk kolbe. Denne opløsning har en koncentration på 7,2 mM.

5. Afvej 230 mg PTC og opløs det i 100 mL vand i en konisk kolbe. Denne opløsning har en koncentration på

15,0 mM.

6. 10 mL af catecholopløsningen hældes i hver af de to glas nr. 1.

7. I begge serier overføres 5 mL fra glas nr. 1 til glas nr. 2, og der blandes. Derefter gentages proceduren med

5 mL fra glas nr. 2 til glas nr. 3 osv., indtil glas nr. 6 indeholder 10 mL. Hermed har vi en to fortyndingsserier, hvor koncentrationen i et glas er to gange mindre end i det foregående.

8. Tilsæt 20 µL PTC-opløsning til hvert glas 1-5 i serien mærket PTC og 40 µL til glas nr. 6 og bland.

9. En kartoffel skrælles, skæres i små stykker og blendes med en smule isvand. Kartoffelsaften filtreres på en

Büchnertragt og sugekolbe. Kartoffelekstraktet (= enzymopløsningen) sættes straks i et tilproppet

reagensglas på is. Der skal være mindst muligt luft i glasset.

10. Tilsæt 1 mL fra glas nr. 1 (uden PTC) til et reagensglas mærket Abs. Tilsæt 2 mL vand og 100 µL enzymopløsning til dette glas, rør rundt, og lad det stå.

11. Tilsæt 3 mL vand og 100 µL enzymopløsning til en kuvette, og bland ved at vende kuvetten et par gange.

Sæt kuvetten i spektrofotometret og nulstil apparatet. Kartoffelekstraktet har en lille absorbans, som vi automatisk korrigerer for ved at nulstille apparatet med en prøve med enzymopløsning uden substrat.

12. Tag kuvetten op, og hæld indholdet ud. Overfør 3 mL fra glas nr. 1 (uden PTC) til den samme kuvette.

Tilsæt 100 µL enzymopløsning til kuvetten, og bland. Sæt kuvetten i spektrofotometret, og start dataopsamlingen (3 min., 30-60 målinger pr. min.).

13. Gentag punkt 12 med glas nr. 2, og fortsæt, indtil alle glas er målt i begge serier.

14. Mål til sidst absorbansen af indholdet i glasset mærket Abs.

Resultater og databehandling:

Find hastigheden af omsætningen for hver måling i den første del af kurven, som er retlinet. Hastigheden kan udtrykkes som ændringen i absorbans ΔA pr. ændring i tid Δt:

Δ A

v =. (1)

Δ t

Ifølge Lambert-Beers lov er absorbansen proportional med stoffets absorptionskoefficient ε ved den givne bølgelængde, stoffets molære koncentration c og lysvejens længde l:

εA c l= ⋅ ⋅. (2)

Ligning (2) kan omskrives til

Side 22

Side 22 af 22 ε ⋅ l

A

c =. (3)

Hvis man har målt en ændring i absorbans, ΔA, vil det svare til en ændring i stofmængdekoncentration: ε ⋅ l

Δ A

Δ= c. (4)

Absorbansen A har ingen enhed, ε har enheden M^{−1} cm^{-1}, c har enheden M (molær = mol/L), og l har enheden
cm. Kuvettens bredde er 1 cm, så l = 1 cm. Hvis absorptionskoefficienten ε for o-benzoequinon kendes, så kan

hastigheden udtrykt i koncentration pr. tidsenhed kan findes som

ΔΔ cA 1

Δ Δ ⋅ tt 1 cm ε

v = = ⋅. (5)

For at bestemme ε har vi lavet en prøve, der får lov til at reagere fuldstændigt til o-benzoequinon (punkt 14).

Omskrivning af ligning (1) giver

ε =. (6)

A cl ⋅

Absorbansen A er målt under punkt 14, c = 7,2 mM (= 0,0072 M), og l = 1 cm. Den fundne værdi for ε anvendes

efterfølgende til at beregne hastighederne som ændring i koncentration pr. tidsenhed.

Både dataopsamling og dataanalyse foregår i LoggerPro. De rå data består af absorbans som funktion af tiden.

I LoggerPro finder man og markerer lineære stykker i begyndelsen af kurverne og fitter rette linjer.

Hældningerne af disse rette linjer er ΔA/Δt, som omregnes til Δc/Δt ved at dividere med ε ifølge ligning (5).

Fremstil ved hjælp af LoggerPro både Michaelis-Menten plots og Lineweaver-Burk plots for begge serier og

bestem henholdsvis K og V (uden PTC) og K^{app} og V^{app} (med PTC). Som substratkoncentrationer bruges

M max M max værdierne for koncentrationen af catechol i fortyndingsserierne.

Ved beregningerne af substratkoncentrationerne skal du huske fortyndingen med enzym- og PTC-opløsningerne.

Spørgsmål til rapporten:

1. Eftervis beregningerne af koncentrationerne af catechol og PTC.

2. Hvilke plots er mest pålidelige – Michaelis-Menten eller Lineweaver-Burk? Begrund dit svar.

3. Hvilken type plot er bedst til at afgøre hvilken type hæmmer, der er tale om?

4. Hvilken type hæmmer er phenylthiocarbamid?

5. Beregn inhiberingskonstanten K.

I

6. Vurdér, om PTC er en god, middelmådig eller dårlig hæmmer?