SRP om monoklonale antistoffer til bekæmpelse af kræft i Bioteknologi A

Side 1

Studieretningsprojekt i Bioteknologi

MONOKLONALE ANTISTOFFER

STX 3.g

Side 2

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

1

ABSTRACT

This paper examines how monoclonal antibodies are a part of the fight against cancer diseases. The focus will be on how the monoclonal antibodies work and how they are produced and used against cancer diseases. Through research in scientific articles, approved books and authorized websites, the paper will furthermore give a thorough examination of how cancer occurs and how the immune system reacts to unknown organisms. Through a laboratory experiment, the paper determines how the monoclonal antibodies’ glycosylation profiles and amount of glycation are affected by fermentation with a high level of glucose.

This will be analyzed via ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry). Additionally, advantages and disadvantages of monoclonal antibodies as a treatment for cancer diseases will be discussed. The paper determines that the amount of glycation of the monoclonal antibodies is affected by the concentration of glucose that the monoclonal antibodies are produced in. Furthermore the experiment does not show any correlation between the concentration of glucose and the glycosylation profiles of the monoclonal antibodies.

Side 3

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

2

INDHOLDSFORTEGNELSE

Abstract ...................................................................................................................................... 1

1. Indledning ............................................................................................................................... 3

2. Baggrund ................................................................................................................................ 3

3. Cancercellen ........................................................................................................................... 5

4. Behandling af cancer .............................................................................................................. 6

4.1 Kirurgi .............................................................................................................................. 7

4.2 Strålebehandling ............................................................................................................... 7

4.3 Kemoterapi ....................................................................................................................... 8

5. Immunsystemet ...................................................................................................................... 8

5.1 Det uspecifikke immunforsvar ......................................................................................... 9

5.2 Det specifikke immunforsvar ......................................................................................... 10

6. Antistoffer ............................................................................................................................ 12

6.1 Monoklonale Antistoffer ................................................................................................ 13

6.2 Antistoffets kulhydrater .................................................................................................. 14

7. Effekt af fermentering af antistoffer i medie med højt glukoseindhold ............................... 15

7.1 Formål ............................................................................................................................. 15

7.2 Metoder ........................................................................................................................... 15

7.3 Materialer og forsøgsopstilling ....................................................................................... 19

7.4 Forsøgsbeskrivelse.......................................................................................................... 20

7.5 Resultater ........................................................................................................................ 23

7.6 Databehandling ............................................................................................................... 25

7.7 Vurdering af usikkerheder og fejlkilder ......................................................................... 25

7.8 Forsøgskonklusion .......................................................................................................... 26

8. Anvendelse af monoklonale antistoffer ....................................... 26

9. Konklusion ........................................................................................................................... 28

10. Litteraturliste ...................................................................................................................... 30

11. Bilag ................................................................................................................................... 33

Side 4

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

3

1. INDLEDNING

Kemoterapi, kirurgi og strålebehandling, er gennem længere tid kendte behandlingsformer mod cancersygdomme. Behandlingen resulterer dog ofte i, at cancerpatienterne, oplever en række bivirkninger, der blandt andet kan omfatte hårtab, træthed eller blodmangel. Desuden er disse former for behandling ikke altid effektive og det er langt fra alle, der bliver helbredt.

Der forskes aktivt og intenst i nye og forbedrede behandlingsformer mod cancersygdomme.

En af de behandlingsformer, som medicinalindustrien har stor fokus på, er anvendelse af specifikke proteiner, kaldet monoklonale antistoffer. Anvendelsen og forskningen i antistoffer er kun i startfasen, men det anslås at cirka 30 % af al den medicin der lanceres gennem det næste århundrede, vil være baseret på monoklonale antistoffer. [1]

Men hvordan vil et lille specifikt mikroskopisk protein, kunne helbrede en sygdom som cancer, der har eksisteret så længe og været årsag til så mange dødsfald? Dette vil blive beskrevet, analyseret og diskuteret i denne opgave.

Arbejdet omfatter en bioteknologisk gennemgang, laboratorieforsøg og analyser af dette, samt en afsluttende diskussion om hvordan monoklonale antistoffer, kan være et led i bekæmpelsen af cancersygdomme.

I det følgende vil der blive redegjort for hvordan en cancercelle er opbygget og de mest anvendte behandlingsformer mod cancersygdomme, vil blive beskrevet. Dernæst vil opbygningen af kroppens immunsystem og dets funktion beskrives, efterfulgt af en redegørelse for hvad et antistof er og hvordan det fremstilles i medicinalindustrien. Derefter vil et laboratorieforsøg, blive udført og beskrevet. Dette forsøg er et led i fremstillingen af monoklonale antistoffer hos medicinalvirksomheden Symphogen. Til sidst, vil det blive diskuteret hvordan monoklonale antistoffer kan bruges som en behandlingsform mod cancersygdomme og hvilke fordele og ulemper der vil være ved denne type af behandling.

2. BAGGRUND

De fleste personer i den vestlige verden bliver i dag, på den ene eller den anden måde, berørt af cancersygdomme. Omkring hver fjerde dansker får selv cancer inden 75-års alderen. [2] Eftersom den gennemsnitlige levealder stiger og risikoen for at få cancer øges med alderen, vil antallet af cancerpatienter stige. Men også yngre personer bliver ramt af cancersygdomme.

Arvelige forhold, samt levevis og miljøfaktorer er forhold der påvirker forekomsten af cancer.

1

Jefferis, Roy, 2009 s. 226

2

Kristjansen, Paul S. 9

Side 5

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

4

Cancer er ikke noget nyt fænomen. 100 millioner år gamle fossiler af dinosaurer har haft cancerlignende knuder, og menneskelige knogler fra 100.000 år tilbage har vist tegn på knoglecancer. [3] Cancer er en sygdom, eller en lang række af sygdomme, der har eksisteret længe og det ser heller ikke ud til, at de kommer til at forsvinde i den nærmeste fremtid.

Cancersygdomme kan opstå i næsten alle typer af kroppens væv. De navngives efter hvor i kroppen de opstår og spredes fra, men alle cancersygdomme har det til fælles, at de uden behandling fører til død, som følge af spredning i kroppen. [4]

I dag findes der behandlingsformer der gør det muligt for cancerpatienter, enten at kunne leve med sygdommen eller i bedste fald, blive helbredt fra sygdommen. Kemoterapi, kirurgi og strålebehandling er kendte former for behandling, der kan anvendes mod næsten alle typer af cancersygdomme. Disse behandlingsformer har dog mange bivirkninger og desuden kan de være for uspecifikke, hvis målet er helbredelse. Forskning og udvikling går derfor mod nye behandlingsformer, hvor målet er at finde mere specifikt virkende stoffer.

Et eksempel på en behandlingsform der vinder frem, er brugen af monoklonale antistoffer, også kaldet mAbs. Monoklonale betyder, at antistofferne er producerede af produktionsceller der alle nedstammer fra samme celle. Produktionscellerne er identiske efterkommere af den første celle hvilket vil sige at de tilhører en klon. Det at produktionscellerne er identiske er vigtigt, da kun en lille variation i antistoffet, kan forårsage en anderledes behandlingseffekt.

Det er kompliceret at få dannet identiske antistoffer, eftersom der er mere end 5.000 led i produktionen af mAbs. Selv den mindste ændring i antistoffets struktur, kan ændre sammensætningen af lægemidlet og dermed ændre ved den måde det virker på. [5] De første mAbs blev produceret i 1975. To forskere formåede her at sammensmelte en celle, der producerede antistoffer og en cancercelle, der havde mistet evnen til kontrolleret celledeling.

Dermed havde de produceret en lille ”antistoffabrik” hvor cellekopierne var identiske kloner af de oprindelige sammensmeltede celler.

Som behandlingsmetode mod cancer, er de monoklonale antistoffers opgave, at binde sig til cancercellens antigener og sende en immunrespons ud til kroppens immunsystem om, at det skal slå cancercellerne ihjel. [6] Disse monoklonale antistoffer dyrkes i dyreceller og produceres i store mængder i medicinalindustrien. Udfordringen ved at producere monoklonale antistoffer i storskala er, at antistoffer er meget komplekse i deres opbygning og struktur.

Derudover er mAbs per definition ustabile og processen i produktionen af monoklonale antistoffer er en uforudsigelig kemisk proces, eftersom der er tale om en unik levende cellelinje. Det er derfor svært på forhånd at karakterisere slutproduktet. [7]

3

Kristjansen, Paul s. 10

4

Kristjansen, Paul s.13

5

https://www.pharmadanmark.dk/aktuelt/pharma/Documents/2014-april/Pharma04-2014_s22-25.pdf

6

http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/Therapy/biological

7

https://www.pharmadanmark.dk/aktuelt/pharma/Documents/2014-april/Pharma04-2014_s22-25.pdf

Side 6

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

5

3. CANCERCELLEN

Kroppen består af billioner af celler, der er opdelt i forskellige celletyper. Langt de fleste af disse almindelige celletyper kan udvikle sig til cancerceller. Derfor er den eneste forskel på kroppens naturlige celler og cancerceller der forårsager cancer, at der i cancercellens cellekerne sker en lille ændring i dens DNA, hvilket kan give fatale følger. Hvordan det sker og hvorfor det sker, forklares i følgende afsnit.

Kroppens naturlige celler gennemgår en livscyklus hvor de vokser, deler sig og dør for at gøre plads til de nye celler. [8]

Dette sker under regulerende processer, der findes i kroppen. De regulerende processer indebær cellevækst, celledeling, celledød og celledifferentiering.

Cancer kan opstå hvis reguleringen af disse processer forstyrres.

Cellens evne til at dele sig og dø er kontrolleret af cellens egen kerne, kaldet nukleus. Nukleus indeholder kromosomer og kromosomerne indeholder gener, der er bygget op af DNA. I visse tilfælde kan der ske en tilfældig ændring i en lille del af DNA’et, hvilket påvirker kernen til at sende uvante signaler ud til cellen. Disse signaler kan få cellen til at dele sig ukontrolleret.

Alle celler, der opstår ud fra celledeling skabt af den ukontrollerede celle, vil indeholde samme gener og dermed samme DNA fejl. Dette betyder at cellen vil indeholde egenskaber for ukontrolleret cellevækst og celledeling. Når der sker nok celledelinger, uden at cellen bekæmpes, vil de ukontrollerede celler danne en svulst, også kaldet en tumor. Det kan tage op til 30 år fra den første fejl sker i cellens DNA til en tumor på 1 kubikcentimeter er dannet.

Der findes både godartede tumorer, også kaldet benigne tumorer, der ikke skader organismen og ondartede tumorer, også kaldet maligne tumorer, der kan forårsage cancer. [9]

Tumoren danner blodkar for at overleve. Blodkarrene forsyner tumoren med oxygen og næringsstoffer så den er i stand til at leve og vokse. Denne proces kaldes for tumor angiogenesis. [10] Den maligne tumor bliver først farlig når cancercellerne fra tumoren begynder at trænge ind i blodkarrene og ud til de omkringliggende organer. [11] Derfra kan cancercellerne metastasere, hvilket vil sige at de invaderer andre dele af kroppen. Hvis cellen metastasere, vil den foretage sig celledelinger i andre områder af kroppen, og dermed forårsage dannelsen af dattersvulster, også kaldet metastaser. [12] Det kan derfor være altafgørende, at behandlingen mod cancer sker i et så tidligt stadie som muligt. Når cancercellerne har spredt sig fra den oprindelige tumor, vil det være svært og mange gange umuligt at fjerne alle metastaserne.

Yderligere vil der være cancerceller i store dele af kroppens væv og disse er næsten også

8

http://www.cancer.org/cancer/cancerbasics/what-is-cancer

9

Sørensen, Annette B. m.fl. s. 198

10

http://www.sciguru.org/newsitem/5082/Daring-Tumors-Tumor-Cells-Make-Their-Own-Blood-Vessels

11

http://en.sanofi.com/event/Sanofi_TV_Cancer.aspx

12

Kristjansen, Paul s. 16

Side 7

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

6 umulige at fjerne. Derimod kan den rette behandling holde spredningen af cancer nede, hvilket, i mange tilfælde, gør det muligt at leve med cancer. [13]

Det er, som nævnt tidligere i afsnittet, en af kroppens egne normale celler der kan blive til en cancercelle. Der kan være flere grunde til, at en normal celle bliver til en cancercelle. For eksempelvis kan udsættelse for radioaktivitet, solstråling, kemikalier og virusser, som HIV og Hepatitis B være årsager til at der sker en ændring i cellekernens DNA og cellen kan dermed miste sin evne til kontrolleret celledeling. Hvis mutationen i DNA’et der medfører ukontrolleret celledeling og cellevækst, nedarves kan det også medføre øget risiko for udvikling af cancer. Derudover er en usund kost, for meget alkohol eller for meget tobak også hyppige årsager til cancersygdomme, og det er netop den usunde levemåde, der forårsager størstedelen af alle cancerformer. [14] Som nævnt i afsnit 2 findes der dog behandlingsformer der gør det muligt at få patienter til at leve med cancer og i bedste fald helbrede sygdommen.

4. BEHANDLING AF CANCER

Der findes mange former for behandling af cancersygdomme, og de tre mest anvendte former for behandling er kirurgi, strålebehandling og kemoterapi. Målet med disse behandlingsformer er at fjerne tumoren eller forhindre tumoren i at sprede sig yderligere.

Stråling og kemoterapi bygger på at påvirke cancercellerne til at foretage sig apoptose, dvs.

begå selvmord. [15] Strålebehandling og kirurgi kaldes lokal behandling, da disse former for behandling er begrænset til, at omfatte enkelte veldefinerede områder af legemet. Kemoterapi eller medicinsk behandling er en systematisk behandlingsform hvor den cancercelledræbende behandling gives så den virker i hele kroppen. I dag anvendes, så hvidt det er muligt, en kombination af kirurgi, strålebehandling og kemoterapi som behandling. Dette samspil

                                                   16
mellem flere behandlingsformer kaldes multimodal behandling.

13

http://www.cancercenter.com/what-is-cancer/

14

http://www.ssi.dk/~/media/Indhold/DK%20-
%20dansk/Sundhedsdata%20og%20it/NSF/Registre%20og%20kliniske%20databaser/Registre/Cancerregisteret

%202013.ashx
15

Skadhede, Thomas m.fl. s. 203

16

Kristjansen, Paul s. 76-77

Side 8

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

7

4.1 KIRURGI

Kirurgi indebærer fjernelse af det cancersyge organ eller væv ved operation. Kirurgi anvendes også til at diagnosticere cancer og til at finde ud af om sygdommen har spredt sig, og i så fald hvor til. Der anvendes mange forskellige former for kirurgi. Laserkirurgi indebærer at lægen anvender en tynd stråle af højt intensivt lys, til at fjerne det syge væv. [17] Ved endoskopi, også kaldet en kikkertundersøgelse, kan lægen, ved hjælp af en tynd kikkertslange, opdage og fjerne små cancerknuder i mange organer. [18]

Ved en primær operation, anvender lægen en skalpel eller lignende til at fjerne tumoren og omkringliggende sygt væv. Dette er den mest anvendte form for cancerkirurgi. [19] Disse er kun nogle af de metoder, der anvendes inden for cancerkirurgi.

Ved et kirurgisk indgreb er kroppens indre udsat for bakterieinfektioner. Der kan derfor let opstå betændelse hvis ikke såret beskyttes og renses. Derudover skal man ofte faste op til en operation, hvilket kan forårsage træthed i tiden efter operation. Smerte er også en faktor der er meget almindelig efter en operation. Tumoren medfører et stort pres på kroppen og hvis den ligger omkring et organ, kan den udstrække organet, hvilket forårsager smerte når tumoren

      20
fjernes.

4.2 STRÅLEBEHANDLING

Strålebehandling kaldes også radioterapi og til denne form for behandling anvendes ioniserende stråling, som kan være enten elektromagnetisk stråling eller partikelstråling.

Strålingen beskadiger DNA’et i cellen enten ved direkte beskadigelse eller ved indirekte beskadigelse. Ved direkte beskadigelse rammer strålingen cancercellen, og dermed dens kerne, der går i stykker og dør. Ved indirekte beskadigelse, vil vandmolekyler opløses og danner frie radikaler som for eksempel et hydroxylradikal der vil ramme DNA’et i cellen. Ved at DNA’et går i stykker vil cancercellen miste sin evne til at vokse og dele sig, og over tid vil

den dø.^{21}

Problemet med strålebehandling er, at strålingen ikke kun virker på cancercellerne, men også på de normale celler, da cancercellerne, som tidligere nævnt, dannes ud fra de normale celler.

Dermed beskadiges de omkringliggende raske celler også ved strålingen, hvilket medfører skade på cellernes DNA, som vil forårsage en række bivirkninger. Bivirkningerne afhænger af

17

http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/surgery/what-cancer-surgery

18

http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/behandlingsformer/operation/

19

http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/surgery/what-cancer-surgery

20

http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/surgery/side-effects-surgery

21

Kristjansen, Paul s. 86-90

Side 9

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

8 hvilket område der bestråles, men kunne være slimhindeirritation, hudreaktion eller øget

                22
bindevævsdannelse.

4.3 KEMOTERAPI

I kemoterapi anvendes forskellige cellegifte, kaldet cytostatika, der har den funktion at dræbe cancercellerne så effektivt som muligt, uden samtidigt at ødelægge kroppens normale celler.

Cytostatika beskadiger cellers evne til at dele sig og påvirker også cellers evne til at danne nødvendige proteiner. Ligesom ved strålebehandling, er det vigtigste mål for medicinen at

                                  23
beskadige DNA’et i den cancerramte celle.

Kemoterapi kan også hæmme og beskadige de normale celler. Kemoterapi beskadiger cancercellernes evne til at dele sig, og jo oftere en celle deler sig jo større sandsynlighed er der for at medicinens virkning træder i kraft. Dermed er det ikke udelukkende cancercellerne der dør ved kemoterapi, men også nogle typer af de raske celler og især dem der foretager sig celledeling ofte. Celler som hårceller, blodceller og hudceller er celletyper der ofte deler sig og de er derfor raske celler der er udsat ved kemoterapi. [24] Virkningen af den kemoterapeutiske medicin mod disse raske celletyper, forårsager en lang række bivirkninger.

Træthed, nedsat immunforsvar og blodmangel er nogle af de bivirkninger, der skyldes at de normale celler dør som følge af medicinen. [25]

Derudover er hårtab en kendt bivirkning ved kemoterapi, da medicinen påvirker cellerne i hårrødderne. [26]

5. IMMUNSYSTEMET

Cancersygdomme kan, som nævnt i kapitel 3, skyldes mange forskellige ydre årsager. Men uanset de forskellige ydre forårsagende faktorer, er der nogle indre fællestræk ved langt de fleste cancersygdomme, som gør sig gældende for at cancer opstår. Disse fællesstræk er mutationer, eller ændringer, i bestemte gener. Cancer er derfor en vanskelig sygdom, da kroppens eget forsvar, kaldet immunsystemet, ikke forsvarer sig imod kroppens egne celler, men kun imod fremmede celler. Det vil i følgende afsnit blive beskrevet, hvordan immunsystemet er opbygget og hvordan immunsystemet fungerer, når udefrakommende fremmede organismer trænger ind.

22

http://www.caigrau.dk/temp/mpl_intro.pdf

23

Kristjansen, Paul s. 98-99

24

http://ed.ted.com/lessons/how-do-cancer-cells-behave-differently-from-healthy-ones-george-zaidan

25

http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/behandlingsformer/kemoterapi/bivirkninger-kemoterapi/

26

http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/bivirkninger-senfolger/gode-raad-ved-haartab/aarsager-

til-haartab/

Side 10

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

9

Immunsystemets primære funktion er at beskytte organismen mod sygdomsfremkaldende mikroorganismer, også kaldet patogene mikroorganismer. Immunsystemet er derfor i stand til at skelne indtrængende fremmede celler, fra kroppens egne celler. Det vil sige, at når en sygdomsfremkaldende bakterie trænger ind i kroppen, vil den registreres som fremmed og immunsystemet vil derfor begynde at bekæmpe bakterien. I forsvaret mod en indtrængende

                                                27
mikroorganisme, er mange forskellige celletyper involveret.

De organer der udgør immunsystemet kaldes, de lymfoide organer, som indebær knoglemarven, thymus, lymfeknuderne, mandlerne, milten, polypperne og blindtarmen.

Immunsystemet er inddelt i det uspecifikke, medfødte forsvar og det specifikke, tillærte forsvar.

5.1 DET USPECIFIKKE IMMUNFORSVAR

Det uspecifikke forsvar er rettet mod alle typer af mikroorganismer, og opdeles i en passiv og en aktiv del. Det passive forsvar, forhindrer langt de fleste patogene mikroorganismer i at trænge ind i kroppen.

På huden og slimhinderne lever der en lang række ufarlige mikroorganismer, der konkurrerer om plads og næringsstoffer og de er derfor med til at holde de udefrakommende patogene mikroorganismer nede. Huden består af flerlaget epitel, hvilket er uigennemtrængeligt for de fleste mikroorganismer. Endvidere har huden en lav pH-værdi på 4-5, da nogle af de bakterier der lever på huden danner frie fedtsyrer, og dette er med til at beskytte kroppen mod andre bakterier. Slimhinderne danner slim i svælg, kønsorganer og luftveje og fanger udefrakommende organismer og skubber dem ned i mavesækken, hvor mavesyren slår dem ihjel. Tårevæske, spyt og slim indeholder desuden lysozymer, som er bakterienedbrydende enzymer.

I det aktive forsvar, angriber fagocytterne, eller ædecellerne, som tilhører de hvide blodlegemer, mikroorganismerne, hvis det alligevel lykkes for disse at trænge igennem huden eller slimhinderne. [28] Makrofager, neutrofile granulocytter og dendritceller er fagocytter der optager mikroorganismerne ved fagocytose. Ved fagocytose optager en fagocyt en bakterie via en transportform kaldet endocytose. Fagocytten indeholder lysosomer, som indeholder fordøjelsesenzymer. Disse fordøjelsesenzymer nedbryder, sammen med andre cellegifte, bakterierne. [29] Derudover udstiller makrofagen antigener, som er nogle af den patogene mikroorganismes overfladestoffer, på sin egen overflade. Herved signalerer makrofagen til immunsystemet, at der er fremmede mikroorganismer i kroppen og de skal bekæmpes.

27

Bruun, Kim m.fl. s. 161

28

Skadhede, Thomas m.fl. s. 61-62

29

Bruun, Kim m.fl. s. 165

Side 11

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

10

Endvidere udskiller makrofagen interleukiner, som er signalstoffer der tiltrækker andre makrofager, som kan hjælpe med at bekæmpe infektionen.

Når makrofagerne udstiller antigener og udskiller signalstoffer, aktiveres komplementsystemet, som er en lang række proteiner på inaktiv form. Disse komplementmolekyler hæfter til den patogene mikroorganisme og danner nogle effektive nedbrydende enzymer, der danner en pore i membranen, hvorved bakterien sprænges. [30] Hvis infektionen endnu ikke er blevet bekæmpet af makrofagerne eller af komplementsystemet, kan det uspecifikke immunforsvar forsinke infektionen, imens det specifikke forsvar aktiveres.

5.2 DET SPECIFIKKE IMMUNFORSVAR

Det specifikke forsvar aktiveres langsommere end det uspecifikke forsvar, og man kan derfor nå at blive syg inden det træder til. Det specifikke forsvar består ligeledes af to dele: det antistofbasserede forsvar og det cellulære forsvar. På figur 1 ses hvordan det specifikke forsvar virker ved et virusangreb, hvilket også forklares i nedenstående tekst.

Figur 1 – Immunreaktion ved virusangreb.^{31}

30

Bidstrup, Bodil Blem m.fl. s. 24-25

31

Bidstrup, Bodil Blem m.fl. s. 27

Side 12

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

11

Som nævnt i afsnit 5.1, udstiller makrofagen fremmede antigener, når den møder en fremmed mikroorganisme. Ved at makrofagen udstiller fremmede antigener, aktiveres T-hjælpecellerne. T-hjælpecellerne har to slags receptorer, kaldet CD4-receptorer og T-cellereceptore, TCR, som kan binde sig til det udstillede antigen på makrofagen. [32] Antigenet er udstillet på makrofagens MHC II-protein (Major Histocompatibility Complex), hvilket gør at T-hjælpecellen ved, at antigenet befinder sig på en makrofag og ikke på en anden celle. På de fleste celler sidder proteinet MHC I på overfladen, mens det kun er på de antigenpræsterende celler, så som makrofager, at MHC II-proteinet sidder. MHC I viser endogene, indre, antigener fra en celle der er blevet inficeret af en patogen mikroorganisme, hvor MHC II viser exogene, ydre, antigener der er optaget fra omgivelserne.

Når T-hjælpecellen opdager, at der er en infektion, aktiverer den en anden af kroppens immunforsvarsceller, der kaldes en B-lymfocyt. Når B-lymfocytten aktiveres, deler den sig til to andre celler, nemlig en B-huskecelle og en plasmacelle. Plasmacellen kan producere et protein, som kaldes et antistof. Antistoffet passer til de antigener som de patogene mikroorganismer udstiller. Når antistoffet binder sig til antigenet, kan antistoffet pacificere den patogene mikroorganisme, hvilket gør det muligt for fagocytterne, at lave fagocytose. B-huskecellen husker de udefrakommende antigener, og kan beskytte personen mod en eventuel fremtidig infektion, med samme mikroorganisme.

Virus bevæger sig ind i kroppens naturlige celler og overtager deres stofskifte. Antistofferne kan ikke angribe virus, når den er inde i cellen. Derfor aktiveres T-dræbercellen, som også er en immunforsvarscelle. Den virusinficerede celle udskiller signalstoffer, der aktiverer T-dræbercellen. Når T-dræbercellen aktiveres, binder den sig til den virusinficerede celles MHC I-protein med udstillet antigen, via sin TCR og CD8-receptor. Hvis T-dræbercellen aktiveres

                              33
dræber den, den virusinficerede celle.

Antistofferne er en vigtig del i det specifikke immunforsvar og de kan have en afgørende virkning for, om en person bliver rask. Antistoffer produceres naturligt i kroppen, men kan ved hjælp af bioteknologiske processer, også fremstilles kemisk, hvor de kaldes monoklonale antistoffer. I følgende afsnit vil antistoffers gennerelle opbygning blive beskrevet. Derudover vil det forklares hvad monoklonale antistoffer er, og hvordan de kan fremstilles.

32

Bruun, Kim m.fl. s. 174

33

Bidstrup, Bodil Blem m.fl. s. 25-27

Side 13

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

12

6. ANTISTOFFER

Antistoffer, også kaldet immunglobuliner, cirkulerer i blodplasma. De forkortes Ig og opdeles i fem forskellige klasser: IgM, IgG, IgD, IgE og IgA (figur 2).

Figur 2 – De fem forskellige antistofklasser. [34]

Immunsystemet producerer antistofferne, som et svar på en antigenstimulering. Antistoffer er proteiner, der er koblet sammen med kulhydrater og de er derfor glykoproteiner. [35] Et antistof ligner et Y (figur 3) og består af to dele, der er symmetriske omkring midten. Hver del består af en tung kæde og en let kæde, der hænger sammen ved hjælp af disulfidbindinger på samme måde som de to symmetriske dele hænger sammen. [36]

Antistoffet er også delt op i to variable områder, kaldet F (antigen-binding fragment), der er ab det yderste af de to grene på Y’et, og resten er konstante områder, kaldet F (krystalliserbar c fragment). [37] Det yderste af de to variable områder, er antigenbindingssteder.

Figur 3 – Grundformen af et antistof med bundet antigen. [38]

Antistoffer frigives, som tidligere nævnt, som en reaktion på en fremmed mikroorganisme.

Det er IgM antistofferne der frigives først og disse antistoffer er pentamer, hvilket vil sige at de hver består af fem antistoffer og principielt har ti bindingssteder. Dog binder IgM ikke så godt til antigenerne, da affiniteten af stofferne er lav.

34

http://www.mcqbiology.com/2013/01/mcq-on-immunology-antibodies-or.html

35

Falkenberg, Henrik m.fl. s. 170

36

Shade, King-Ting C., m.fl. s. 392-394

37

Jefferis, Roy, 2009 s. 226

38

Bruun, Kim m.fl. s.168

Side 14

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

13

Det næste antistof, som frigives er IgG. IgG er det antistof der findes i størst koncentration i blodet. IgG findes kun som monomer, hvilket gør at det har to bindingssteder. Derfor er affiniteten høj og det medfører at IgG binder godt til det pågældende antigen. [39] IgD er let nedbrydeligt og findes derfor i lav koncentration i blodet. IgD er bundet til overfladen af B-celler, som ikke er præsenteret for antigener.

IgE aktiverer fagocytter kaldet mastceller, som udskiller inflammatoriske stoffer. Derudover er IgE involveret i immunreaktionen mod parasitter. [40]

IgA findes overvejende i sekreter, hvor det hjælper med at beskytte mod indtrængen af patogene mikroorganismer, ved at det får disse til at klumpe sig sammen, så de ikke kan trænge igennem slimhinden. [41] IgA og IgG er også inddelt i henholdsvis fire (IgG1-4) og to

(IgA1-2) underklasser, der alle har forskellige egenskaber. [42]

Ovenstående sker naturligt i kroppen. Det er dog, som tidligere nævnt, muligt at fremstille antistoffer via bioteknologiske processer. En af de type antistoffer, der kan fremstilles ved bioteknologiske processer, kaldes monoklonale antistoffer og denne type af antistoffer bruges aktivt, som behandlingsform mod cancer.

6.1 MONOKLONALE ANTISTOFFER

Monoklonale antistoffer, forkortes mAb og er antistoffer, der er ens og dannede ud fra samme oprindelige hybridcelle. Ved cellehybridisering dannes en hybridcelle, som er en blanding af celler fra to arter. For at producere mAb anvendes B-lymfocytter og cancerceller. B-lymfocytterne er i stand til at producere antistoffer og cancercellerne foretager sig hyppigt celledeling og har gode overlevelsesevner. Dermed er resultatet en hybridcelle, der har alle egenskaber fra begge celler. [43] Antistoffer varierer dog i forskellige kemiske strukturer selvom de kommer fra samme celleklon. Hvordan det enkelte antistof ser ud, afhænger i høj grad af hvordan hybridcellen trives, når den danner antistoffet. Derfor skal ordet ”klon” eller ”ens” tolkes lidt løst, men er bedre end for eksempelvis ordet ”identiske”.

Symphogen er en medicinalvirksomhed, der i dag anvender CHO celler (chinese hamster ovary cells) til at producere deres antistoffer. CHO celler anvendes i størstedelen af produktionen af antistoffer. Grunden til at CHO celler anvendes er at de er relativ lette, at dyrke i kulturer og derudover er de generelt bedre til at overleve, end for eksempel

39

Jefferis, Roy, 2005, s. 14

40

Bruun, Kim m.fl. s. 168-169

41

Falkenberg, Henrik m.fl s. 171-172

42

Shade, King-Ting C., m.fl. s. 393-394

43

Skadhede, Thomas m.fl. s. 107

Side 15

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

14 menneskeceller, eftersom CHO celler deler sig hyppigere. [44]

CHO celler er også i stand til at optage fremmed genetisk materiale og endelig er disse celler ikke skadelige for mennesker, hvilket er vigtigt hvis menneskelig medicin skal produceres i sidste ende. [45]

Når Symphogen har produceret antistofferne i en samlet væske, som også indeholder cellerne, skal antistofferne oprenses. Det gøres ved hjælp af proteiner og efterfølgende ved kromatografiske metoder. Ved søjlekromatografi føres antistofopløsningen gennem en søjle, hvor materialet af søljen er afgørende for, at det ønskede antistof adskilles fra resten af væsken. [46] Når det ønskede antistof er oprenset, foretager Symphogen analytiske behandlinger af dette. Denne proces er vigtigt for at teste om antistoffet er sikkert og virksomt og om det ligner det forventede produkt.

6.2 ANTISTOFFETS KULHYDRATER

På antistoffets konstante F del sidder der kulhydrater. Disse kulhydrater varierer fra antistof c til antistof og findes i et utal af kombinationer. For eksempelvis er der på det menneskelige IgG, fastgjort et kulhydrat, en sakkarid-polymer, kaldet et oligosakkarid, et sted på hver af de to tunge kæder. Disse kulhydrater er afgørende for den måde de monoklonale antistoffer virker på og effektiviteten kan variere alt afhængig af hvilket specifikt oligosakkarid, der sidder på antistoffet.

I produktionen af mAbs, anvendes der i dag metoder, der gør det muligt at fremstille disse med homogene oligosakkarider, også kaldet glykoformer. Humant IgG er sammensat af flere forskellige glykoformer på grund af tilføjelsen af forskellige komplekse ’diantennary’ oligosakkarider, dvs. oligosakkarider der har to manose ’arme’, til Fc delen af antistoffet.

Tilstedeværelsen eller fraværet af IgG Fc oligosakkarider, har ikke en effekt på antigenbindingen, men har en afgørende virkning på de biologiske mekanismer, der aktiveres af de dannede immunkomplekser.

Forskning har muliggjort dannelsen af en række homogene antistof-glykoformer og forsøg har vist, at der er stor forskel i effektiviteten af disse glykoformer. [47]

Medicinalindustrien forsker aktivt i, hvordan de bedste monoklonale antistoffer, til behandling af forskellige cancersygdomme, fremstilles. Målet er at mAbs kan anvendes som en endnu mere effektiv og smertefri behandlingsform i fremtiden.

44

Chung, Shan m.fl. s. 326-327

45

http://www.aiche.org/sites/default/files/docs/pages/CHO.pdf

46

Bruun, Kim m.fl. s. 57-58

47

Jefferis, Roy, 2009 s. 226

Side 16

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

15

En parameter, der kan ændres på og som der forskes intenst i, med henblik på forbedring af antistofferne, er antistoffernes glykoformer, som kan aflæses på antistoffernes glykosyleringsprofiler. Antistoffernes glykosyleringsprofiler opnås ved at anvende en

                                 48
analysemetode kaldet massespektrometri.

I det følgende afsnit vil det beskrives, hvordan man kan undersøge om fermentering af antistoffer i medie med høj glukose, har en indflydelse på deres glykosyleringsprofiler eller mængden af glykering. Dette forsøg er en lille del af en lang proces, som gennemføres på Symphogen med henblik på, at producere de bedst mulige og mest effektive antistoffer.

7. EFFEKT AF FERMENTERING AF ANTISTOFFER I

MEDIE MED HØJT GLUKOSEINDHOLD

7.1 FORMÅL

Formålet med forsøget er, at undersøge om fermentering af antistoffer i medie med et højt glukoseindhold, har en indflydelse på antistoffernes glykosyleringsprofiler eller mængden af glykering. Dette undersøges ved hjælp af en kombination af højtryksvæskekromatografi og massespektrometri (HPLC-MS).

7.2 METODER

48

Putnam, Wendy S., m.fl., s. 509-510

Side 17

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

16

For at forstå hvad forsøget indebærer og hvad formålet med forsøget er, vil jeg beskrive og forklare en række begreber, samt beskrive en række processer og metoder der er anvendt i forsøget.

En glykering er en ikke-enzymatisk reaktion, hvor kulhydrater, som for eksempel glukose, bindes via en kovalent binding, til proteiner, DNA, lipider eller som i dette forsøg,

         49
antistoffer.

En glykosylering, er en proces hvor kulhydrater, bindes til proteiner, DNA, lipider eller som i

                   50
dette forsøg, antistoffer.

Metoder der anvendes i forsøget:

ESI-MS (ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry) er en vigtig teknik for kvantitative målinger af metabolitter i en kompleks biologisk prøve, i det kliniske laboratorium.

Under ESI (figur 4) bliver små dråber af prøven der ønskes undersøgt, ledt ind i et tyndt rør sammen med en forstøvningsgas. Prøven bliver ’sprayet’ ud af røret og gennemgår en forstøvningsproces hvor prøvemolekylerne bliver opvarmet af N, hvilket forårsager at

2 dråberne bliver mindre og mindre. Dette sker under vakuum og resulterer i, at kun de positive ioner er tilbage af molekylerne. Nogle af de positive ioner farer ind i et kapillarrør der skaber en stråle af positive ioner. Resten af ionerne transporteres videre som affald. Efter at ionerne forlader kapillarrøret, gennemgår de en proces kaldet CID (Collision-Induced Dissociation), der skaber fragmenter af de molekylære ioner.

49

Goetze, Andrew M., m.fl. s. 221

50

Putnam, Wendy S., m.fl., s. 510-511

Side 18

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

17

Figur 4 – Elektrospray Ionization processen.

51

Efter ElektroSpray Ioniseringsprocessen fortsætter ionfragmenterne ind i massespektrometeret. [52] Masse spektrometri er en analytisk metode der kan give både kvalitative, strukturen, og kvantitative, molekylærmassen eller koncentrationen, informationer om molekyler efter de er omdannede til ioner. Der findes flere typer af massespektrometer. I dette forsøg anvendes TOF-MS.

TOF-MS (Time-of-flight massespektrometri) er en type af massespektrometri. I denne metode af massespektrometri opnås et massespektrum, ved at se på ionens hastighed i forhold til dens masse (figur 5). [53] Ioner accelereres gennem et elektrisk felt og dette resulterer i, at ioner med samme ladning opnår samme kinetiske energi. Den hastighed ionen opnår, afhænger af dens masse-ladnings forhold.

Den tid det tager for ionen at nå detektoren, vil derfor også afhænge af ionens masse og ladning. Dette kan måles eftersom eksempelvis tungere ioner flyver langsommere end lettere ioner. Med kendskab til den tid det tager for ionen at nå detektoren, kan man bestemme

ionens masse-ladnings forhold, som betegnes m/z, og dermed danne et massespektrum.

Massespektrummet viser en graf, der viser signalernes relative hyppighed afhængig af deres

m/z forhold. Jo større forekomst af et molekyle med en bestemt masse, jo højere vil søjlen på
grafen være.^{54}

Figur 5 – TOF-MS – Tiden det tager for ionerne at nå detektoren afhænger af deres masse. [55]

51

Dr. Bill Lutrell – Oklahoma Christian University

52

http://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Instruments-Systems/Mass-Spectrometry/6500-Series-

Accurate-Mass-Quadrupole-Time-of-Flight-(Q-TOF)-LC-MS/Pages/gp57723.aspx
53

Spengler, B. m.fl.

54

Ferrer, Imma, m.fl.

55

http://www.kore.co.uk/ms-200_principles.htm

Side 19

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

18

Når ESI-MS kombineres med en anden metode kaldet HPLC (High-Pressure Liquid

Chromatography), der anvendes til at separere komponenter, kan denne analysere både store og små molekyler med forskellige polariteter i en kompleks biologisk prøve. Denne proces

kaldes LC-MS.^{56}

HPLC (High-Pressure Liquid Chromatography) (figur 6), er en metode der anvendes til at separere forskellige komponenter fra hinanden og karakterisere forskellige proteiner.

En solvent, kaldet den mobile fase, og en prøve, der ønskes undersøgt, føres igennem en søjle, kaldet den stationære fase. Ved HPLC føres solventerne og prøven gennem søjlen ved hjælp af højtrykspumper. For at opnå den ønskede separation anvendes solventer der har en passende polaritet. Indholdet af disse solventer varierer, da succesen af separationen afhænger af at solventerne har den rette polaritet for netop denne separation. Pumperne i HPLC’en producerer et tryk på 15.000 kilopascal hvilket er grunden til at processen kaldes højtryksvæskekromatografi.

Når komponenterne er separererede i søjlen ved hjælp af solventerne, føres de videre ind i en detektor, hvor en stråle af ultraviolet lys skinner igennem dem. Det ultraviolette lys er sat til en bølgelængde der absorberes af alle komponenterne, der skal separeres. Komponenten eller komponenterne der absorberer UV-lyset passerer, derefter gennem detektoren. Den tid det tager for komponenten at komme af søjlen, kaldes retentionstiden. Retentionstiden af komponenterne udarbejdes som en graf og denne bruges til at identificere komponenterne.

Det resterende produkt transporteres videre til en separat beholder, som affald. [57] Figur 6 – HPLC processen hvor en prøve separeres. [58]

56

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1853331/

57

Moldovenau, Serban C., mfl.

58

http://www.pharmacelsus.de/uploads/pics/hplc.jpg

Side 20

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

19

7.3 MATERIALER OG FORSØGSOPSTILLING

6 mAb-prøver

Buffer (20mM NaAcet, 150 mM NaCl, pH 5.3)

Mikropipetter af forskellige størrelser – 5 µl og 100µl

Pipettespidser

Eppendorfrør

Mixer

Inkubator

Centrifuge

HPLC-vials

HPLC (High-Pressure Liquid Chromatography)

Solvent A -Acetonitrile med 0,1 % formic acid (Myresyre, CH O)

2 2

Solvent B - H O med 0,1 % formic acid (Myresyre, CH O)

2 2 2

5 % isopropanol, C H O

3 8

ESI MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry)

Figur 7 – Figuren viser de 6 forskellige prøver, henholdsvis med og uden enzym. Til venstre på billedet, ses bufferen, der anvendes til at fortynde prøverne.

Side 21

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

20

7.4 FORSØGSBESKRIVELSE

Til forsøget anvendes to forskellige antistoffer. Medicinal firmaet oplyser ikke hvilke specifikke antistoffer der er tale om, da dette er en firmahemmelighed. Derfor har jeg valgt at kalde de to forskellige monoklonale antistoffer for mAb1 og mAb2.

I forsøget anvendes tre forskellige mAb1 og tre forskellige mAb2 med forskellige mængder glukose.

De seks forskellige prøver ser således ud:

1. mAb1 – reference – fermentering under normale forhold så koncentration er 6 mg/ml
2. mAb1 – tilsat glukose så koncentrationen er 10mg/ml
3. mAb1 – tilsat glukose så koncentrationen er 16 mg/ml
4. mAb2 – reference – fermentering under normale forhold så koncentration er 6 mg/ml
5. mAb2 – tilsat glukose så koncentrationen er 10 mg/ml
6. mAb2 – tilsat glukose så koncentrationen er 16 mg/ml

Derudover har jeg 6 prøver yderligere, der anvendes som kontrol.

100 µl mAb-prøve fortyndet til 1 mg/ml i Tris buffer forberedes, så den samlede mængde

væske i hver eppendorfrør er 100µl.

Prøve Antistof Buffer Koncentration 100µg µl buffer

nr. (mg/mL)
1 Reference Antistof #1 20mM NaAcet, 150mM NaCl, 13,2 100/13,2= 100-7,6=

Fermentering under | pH5.3 | 7,6µl | 92,4µl

normale betingelser.

6 mg/ml glukose
2 Antistof #1 20mM NaAcet, 150mM NaCl, 8,11 100/8,11= 100-12,3=

Ekstra Glukose under | pH5.3 | 12,3µl | 87,7µl

fermentering

10 mg/ml
3 Antistof #1 20mM NaAcet, 150mM NaCl, 7,69 100/7,69= 100-13,0=

Ekstra Glukose under | pH5.3 | 13,0µl | 87,0µl

fermentering

16 mg/ml
4 Reference Antistof #2 20mM NaAcet, 150mM NaCl, 10,8 100/10,8= 100-9,3=

Fermentering under | pH5.3 | 9,3µl | 90,7µl

normale betingelser.

6 mg/ml glukose
5 Antistof #2 20mM NaAcet, 150mM NaCl, 7,61 100/7,61= 100-13,1=

Ekstra Glukose under | pH5.3 | 13,1µl | 86,9µl

fermentering

10 mg/ml

Side 22

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

21

6 Antistof #2 20mM NaAcet, 150mM NaCl, 6,32 100/6,32= 100-15,8=

Ekstra Glukose under pH5.3 15,8µl 84,2µl fermentering

16 mg/ml

Til en af hver af prøverne tilsættes 1µl enzym (N-glycanase-plus fra prozyme [59]). Nu indeholder seks af prøverne enzym og seks af prøverne indeholder ikke enzym. Ved at anvende seks prøver uden enzym vil jeg efter MS’en kunne sammenligne de deglycosylerede prøver med de oprindelige prøver. Prøverne rystes i mixeren for at blande antistofferne, bufferen, og i halvdelen af tilfældene, enzymet. Herefter sættes prøverne i inkubatoren hvor de inkuberes og rystes stille ved 37 °C i 3 timer. Her deglycolsylerer de seks prøver, hvor der er tilsat enzym. Efter de 3 timer centrifugeres prøverne, ved 14.500 rpm i 10 minutter hvorefter de tilsættes til HPLC-vials for videre analyse via LC-MS.

I HPLC systemet (High-Pressure Liquid Chromatography) er der følgende solventer.

Solvent A, Acetonitrile med 0,1 % FA (Myresyre), anvendes for at eluere, ”vaske”, prøven fra søjlen.

Solvent B, H O med 0,1 % FA (Myresyre), anvendes for at prøven binder sig til søjlen.

2

Som rensevæske til sprøjte og nål anvendes 5 % isopropanol, C

3 8

H

O, som bruges efter hver injektion for at mindske ”carry over” væske.

Før prøverne kan analyseres skal massespektrometeret kalibreres. Til dette anvendes ESI lav koncentration Tuning Mix.

Prøverne analyseres via et automatisk WorkFlow. Først laves der et prøveark i Excel, hvor information om prøvens navn, injektionens volume, de teoretiske masser, osv. skrives ind. [60] Excel-arket bliver uploadet til en CompassOpen Acess server, hvor metoden der skal anvendes til analysen vælges. Metoder, der anvendes, består af flere dele.

1. En HPLC metode med gradient.

2. En Q-TOF (Quadrupole-Time-of-Flight) metode, som er en metode, der beskriver indstillingen af massespektrometeret.

3. En data-, analyse- og afrapporteringsmetode, som dekonvoluterer rå data, dvs.

omregner rå data ved hjælp af en matematisk algoritmebaseret funktion, og bearbejder en PDF rapport med resultater.

59

Bilag 1

60

Bilag 3

Side 23

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

22

Når Excel-arket er uploadet og analysemetoderne er klargjorte på computeren, placeres prøverne i HPLC’ens autosampler. Når prøverne er indsat i HPLC’en indstilles den via computeren, så de rigtige HPLC-vials med prøverne bliver valgt. Herefter startes programmet og dette kører automatisk. Når programmet kører prøverne igennem maskinen separerer den de monoklonale antistoffer via højtrykssøjlekromatografi (figur 8) og analyserer ionerne via ESI-MS (figur 9). Når analysen af prøverne er færdige får jeg et massespektrum for hvert af antistofferne.

Figur 8 – Den anvendte HPLC er Ultimate 3000 LC System fra Dionex. [61]

Figur 9 – Det anvendte MS er micrOTOF-Q II fra Bruker Daltronic.^{62}

61

Billede taget på Symphogen

62

Billede taget på Symphogen

Side 24

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

23

7.5 RESULTATER

Figur 10 – mAb1 med 6 mg/ml glukose – uden og med enzym

Figur 11 – mAb1 med 16 mg/ml glukose – uden og med enzym

Side 25

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

24

Relative inensitet (%)

Sample ID Antibody [glucose] 0 glycation 1 glycation 2 glycation 3 glycation

RM40 9006 6 mg/mL 100.0 16.8 4.5 0
4360 9006 10 mg/mL 100.0 25.0 6.6 0
4361 9006 16 mg/mL 100.0 35.3 10.9 2.7
RM41 9338 6 mg/mL 100.0 17.3 4.5 0
4358 9338 10 mg/mL 100.0 22.3 5.3 0
4359 9338 16 mg/mL 100.0 34.3 10.1 2.0

Relative intensitet (%)

Sample Antibod [glucose Man5- A1G0F/G G0F/G0 G0F/G1 G1F/G1 G1F/G2 G2F/G2

ID y] Man5 0F F F F F F

RM40 9006 6 mg/mL 2.1 15.9 100.0 74.8 40.2 12.4 3.3

4360 | 9006 | N.D. | 13.5 | 100.0 | 72.8 | 34.1 | 11.0 | 2.3

10

mg/mL

4361 | 9006 | 1.6 | 15.9 | 100.0 | 70.6 | 32.1 | 10.6 | 2.7

16

mg/mL
RM41 9338 6 mg/mL 18.1 33.6 100.0 34.7 10.5 2.3 0

4358 | 9338 | 10.9 | 29.5 | 100.0 | 56.1 | 20.2 | 4.7 | 0

10

mg/mL

4359 | 9338 | 11.8 | 34.0 | 100.0 | 58.7 | 22.0 | 6.7 | 0.4

16

mg/mL

Figur 12 – Graf over Glykering 1 og glykering 2 for de tre mAb1 antistoffer.

Tabel 1 – Prøver med tilsat enzym

Tabel 2 – Prøver uden enzym

Side 26

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

25

7.6 DATABEHANDLING

Graferne viser massespektrummerne for de testede prøver. Hver top på graferne repræsenterer en masse, som svarer til et bestemt molekyle. Den øverste graf på figur 10 og 11, viser

henholdsvis mAb1 med 6 mg/ml uden enzym og mAb1 med 16 mg/ml uden enzym. De viser

derfor de forskellige glycoformer, som indgår i antistoffets struktur. Den nederste graf på figur 10 og 11, viser prøverne, hvor enzymet er tilsat. Eftersom disse prøver er deglycosylerede, viser graferne antallet af glykeringer, som er blevet dannede under forsøget.

Ved at måle intensiteten af hver top, kan man beregne deres relative intensitet. Den mest intense top sættes derfor til at være 100 %. Tabellerne viser den relative intensitet af de forskellige graftoppe.

I tabel 1 kan det aflæses, at glykeringen stiger når glukosekoncentrationen stiger. For eksempel stiger intensiteten af graftoppen, svarende til en glykering, fra 16,8 % til 35,3 % for

mAb1, når der tilsættes 16 mg/ml under fermenteringen i stedet for 6 mg/ml. Figur 12 viser

procentdelen af 1. og 2. glykering, som funktion af glukosekoncentrationen. Det er her

tydeligt at både 1. og 2. glykering er mere markante for mAb1 med 16 mg/ml glukose end for
mAb1 med 10 mg/ml glukose og endnu mere markante, end for mAb1 med 6 mg/ml glukose.

I tabel 2, og i det øverste af figur 10 og 11, aflæses antistoffernes glykosyleringsprofiler. Det er her svært at se om der er en sammenhæng mellem antistoffernes koncentration af glukose og deres glykosyleringsprofiler. Nogle graftoppe stiger og nogle falder uden at vise noget

tydeligt mønster. I tabel 2 kan det for eksempelvis aflæses, at intensiteten for G0F/G1F falder

når koncentrationen af glukose stiger for mAb1, men stiger samtidigt med at koncentrationen af glukose stiger for mAb2. I bilag 4 ses de resterende grafer med glykeringer og glykosyleringsprofiler for hver af prøverne.

7.7 VURDERING AF USIKKERHEDER OG FEJLKILDER

Ved anvendelse af måleinstrumenter og apparaturer vil der altid forekomme visse unøjagtigheder. Disse unøjagtigheder kan komme til udtryk på graferne, der udarbejdes på computeren, efter prøverne har været igennem massespektrometeret. Unøjagtighederne er en parameter, der ikke kan gøres noget ved.

En stor del af forsøget indebærer opmålinger og blanding af forskellige komponenter. Dette gøres i åbent rum og der kan derfor ske en uforskyldt tilsætning af uønskede stoffer når proppen er taget af eppendorfrørene, hvilket kan have en effekt på indholdet.

Side 27

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

26

Derudover kan der være opstået luftbobler i eppendorfrørene, hvis ikke pipetten har været håndteret korrekt, hvilket er svært når der arbejdes med så små mængder af væske. Dette kan medføre, at den totale mængde væske i eppendorfrøreren ikke stemmer overens med den ønskede. Derudover kan det påvirke LC-MS’en så uklare resultater opnås.

En anden parameter, der kan have indflydelse på resultatet af forsøget, er ændringen i temperatur. Nogle kemiske komponenter reagerer, som følge af ændringer i temperatur. Da prøverne er blevet flyttet mellem forskellige rum, kan de have været udsat for temperaturskift hvilket kan have en indflydelse på resultatet.

En eventuel forbedring af forsøget, kunne dermed være at udførslen skete under endnu mere kontrollerede forhold. Dette er dog højst sandsynligt ikke en faktor der ville ændre på forsøgsresultaterne, eftersom Symphogens laboratorielokaler er sterile og der på forhånd er taget forbehold for disse mulige fejlkilder.

7.8 FORSØGSKONKLUSION

Det er tydeligt at fermenteringen af antistofferne i medie med høj glukosekoncentration, har en effekt på mængden af glykering. Dette ses tydeligt ud fra massespektrummerne som graferne viser. Derimod kan vi ikke se en fast sammenhæng i prøvernes glykosyleringsprofiler i tabel 2. Vi må derfor konkludere at der ikke er nogen klar korrelation mellem koncentrationen af glukose og antistoffernes glykosyleringsprofiler.

Det næste skridt i den analytiske proces af fremstillingen af monoklonale antistoffer, ville være at undersøge om den øgede glykering påvirker antistoffets biologiske effekt. Hvis dette er tilfældet, så er glukose koncentrationen og dermed glykeringen, en kritisk parameter, som skal kontrolleres nøje i produktionen af monoklonale antistoffer.

8. ANVENDELSE AF MONOKLONALE ANTISTOFFER TIL

BEKÆMPELSE AF CANCER

Monoklonale antistoffer er ideelle som medicin til behandling af en lang række cancersygdomme. Grunden til dette er at de, som tidligere nævnt, kan binde sig til meget specifikke strukturer og dermed være et vigtigt led i bekæmpelsen af uønskede bakterier og

                              63
celler som for eksempel cancerceller.

Monoklonale antistoffer produceres så de ligner de antistoffer immunsystemet selv producerer mest muligt.

63

http://www.morphosys.com/sites/default/files/annual_reports/morphosys-2003-annualreport-04-Magazine.pdf

Side 28

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

27

Et monoklonalt antistof kan være et led i bekæmpelsen af en cancercelle på flere forskellige måder. Overordnet er monoklonale antistoffers funktion at vedhæfte sig til en cancercelle. Når det har vedhæftet sig til cancercellen, kan det have flere forskellige effekter.

Det monoklonale antistof kan gøre cancercellen, der er dannet ud fra en af kroppens egne celler, mere synlig til immunsystemet. De monoklonale antistoffer kan dannes så de vedhæfter sig på en bestemt del af cancercellen. For eksempel kan det monoklonale antistof Rituximab, vedhæfte sig til et bestemt protein kaldet CD20 der kun findes på B-celler.

Dermed gør det monoklonale antistof kroppen opmærksom på, at der er en cancercelle i kroppen, der skal bekæmpes. Derfra tager immunsystemet over og bekæmper cancercellerne som beskrevet i afsnit 5.2 om det specifikke immunsystem. Rituximab vil dermed sænke antallet af B-celler i kroppen, men kroppen vil producere nye raske B-celler og der vil være mindre sandsynlighed for, at cancer B-cellerne vil forekomme.

Et andet eksempel på et monoklonalt antistof, der kan være et led i bekæmpelsen af cancer er Cetuximab. Cancercellen har mistet evnen til kontrolleret celledeling, som nævnt i afsnit 3 om cancercellen. Dette skyldes, udover ændringen i DNA’et, at celler har nogle vækstfaktorreceptorer der fortæller cellen hvornår den skal dele sig. Nogle cancerceller laver ekstra kopier af vækstfaktorreceptorerne, hvilket er med til at forårsage at cancercellen deler sig ukontrolleret. Cetuximab er i stand til at blokere vækstfaktorreceptorerne hvilket gør at signalet om celledeling ikke når ind til cancercellens cellekerne. Dette kan medføre at cancercellen ikke fortsætter sin celledeling, og det kan derfor stoppe cancer fra at sprede sig til resten af kroppen.

Som tidligere nævnt behøver en malign tumor næringsstoffer og oxygen for at overleve og vokse, kaldet angiogenese. For at få de nødvendige næringsstoffer og den nødvendige ilt, udsender cancercellerne signaler om at den skal vokse, hvilket tiltrækker blodkar. Det monoklonale antistof Bevacizumab kan blokere de voksesignaler, cancercellen sender ud.

Dermed kan tumoren ikke få de nødvendige næringsstoffer og den nødvendige ilt, og dette resulterer i at tumoren stopper med at vokse og i nogle tilfælde begynder den at skrumpe.

Som et sidste eksempel på hvordan monoklonale antistoffer kan virke som et led i bekæmpelsen af cancer, nævnes de to typer monoklonale antistoftyper, Ibritumomab og Ado-trastuzumab emtansine. Disse to typer af monoklonale antistoffer kan transportere henholdsvis stråling og kemoterapi, direkte til cancercellen. Dette sker ved, at de monoklonale antistoffer, som indeholder henholdsvis stråling og kemoterapi, vedhæfter sig på cancercellens receptorer. Cancercellen optager antistoffet og antistoffet udskiller derefter enten den kemoterapeutiske medicin eller stråling, hvilket slår cancercellen ihjel. Ved at behandle cancerpatienter med kemoterapi og stråling på denne måde, skades de omkringliggende celler ikke, som de ellers ville blive, hvis den typiske form for kemoterapi

                            64
og strålingsbehandling anvendtes.

64

http://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/cancer/in-depth/monoclonal-antibody/art-

Side 29

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

28

Dette er blot nogle af de monoklonale antistoffer, der er på markedet i dag og anvendes til bekæmpelse af cancer. Der forskes hele tiden i hvordan bivirkningerne kan mindskes og effektiviteten af behandlingen kan forbedres. Ved antistofbehandling indsprøjtes disse i kroppen. Når en cancerpatient behandles med monoklonale antistoffer, kan der opstå en allergisk reaktion som kan forårsage feber, kvalme, opkast, kløe, udslæt osv. Disse bivirkninger kan forsvinde forholdsvist hurtigt, men hvis kroppen reagerer kraftigere på det ukendte stof, kan det forårsage astmaanfald, hævelse i ansigt og hals og fald i blodtrykket.

Risikoen for disse bivirkninger kan mindskes, ved at man før injektionen med det monoklonale antistof, indsprøjter antihistamin og i visse tilfælde også binyrebarkhormon i den cancerramte patient. [65] Bivirkningerne opstår når kroppen reagerer på at den modtager et stof som den ikke kender til eller som den er overfølsom over for. [66] Generelt er de bivirkninger, som de monoklonale antistoffer forårsager, forholdsvis milde i forhold til andre behandlingsformer, som dem nævnt i kapitel 4.

Et overordnet problem, med mange af disse nuværende anvendte behandlingsformer med monoklonale antistoffer, er at tumoren hurtigt udvikler resistens mod et enkelt antistof. Derfor er en enkel behandling ikke nok, og cancerpatienter skal derfor ofte være i behandling i lange perioder. Desuden er en stor del af de kemisk fremstillede antistoffer, meget forskellige i deres struktur, i forhold til de antistoffer, der findes naturligt i kroppen og dette kan medføre adskillelige bivirkninger.

Symphogen har udviklet en blanding af monoklonale antistoffer. Her indgår flere forskellige antistoffer, der kan binde sig på flere forskellige steder på cancercellens receptorer og dermed forstærke virkningen af alle antistofferne, så tumoren med mindre sandsynlighed udvikler resistens. Antistofferne, kan ved at samarbejde, danne tværbindinger, der fjerner receptorerne fra cancercellens overflade. Dette medfører at cancercellen ikke er i stand til at dele sig eller vokse, hvilket resulterer i at tumoren skrumper og i sidste ende forsvinder. Udviklingen af denne blanding af antistoffer, har været et stort skridt i retningen af bekæmpelsen af cancersygdomme, og Symphogen forsker fortsat i hvordan de kan optimere deres produkt og dermed komme nærmere en endnu mere effektiv behandling. [67]

9. KONKLUSION

En af grundene til, at cirka 30 % af al den medicin der lanceres gennem det næste århundrede vil være baseret på antistoffer, er at indsprøjtning med monoklonale antistoffer, er blevet en

65

http://www.cancer.dk/non-hodgkin-lymfom-lymfekraeft/behandling-nonhodgkin-lymfom/antistof-non-

hodgkin/
66

http://www.apoteket.dk/Laegemidler/Bivirkninger/Generelt%20om%20bivirkninger/Hvorfor%20har%20medic

in%20bivirkninger.aspx
67

http://www.symphogen.com/da/frontpage

Side 30

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

29 velanset behandlingsmetode. Dette skyldes antistoffernes specificitet, effektivitet og de forholdsvis få bivirkninger de kan medføre, i forhold til andre behandlingsmetoder.

Det at fremstille monoklonale antistoffer er en lang og kompliceret proces. Monoklonale antistoffer stammer fra en levende cellelinje og der er dermed stor risiko for at de varier i deres opbygning og struktur. Når antistofferne er forskellige i deres struktur, har de også forskellige virkninger. De monoklonale antistoffers struktur er derfor en af de kritiske parametre, eftersom strukturen er altafgørende for antistoffernes virkning og dermed for behandlingsresultatet.

En af de faktorer der spiller ind på det monoklonale antistofs struktur, er hvordan det produceres. I forbindelse med produktionen af monoklonale antistoffer, er glukosekoncentrationen en vigtig parameter. Koncentrationen af glukose under fermentering af antistoffer, har stor indflydelse på antistoffets mængde af glykering. Det er derfor vigtigt, at produktionen af monoklonale antistoffer sker under kontrollerede forhold.

Symphogen er en medicinalvirksomhed, der med deres mAb blanding, har fremstillet et produkt, der ligger utroligt tæt på den naturlige antistofrespons, som sker i kroppen. Et produkt bestående af flere antistoffer, der dermed har evnen til at behandle flere steder i kroppen på en gang, gør det muligt at behandle komplekse sygdomme som for eksempel cancer.

Selvom monoklonale antistoffer har været en anvendt behandlingsform i mange år, er en stor del af udviklingen stadig i startfasen. Der er et utal af muligheder med monoklonale antistoffer og medicinalvirksomheder forsker aktivt i, at finde det bedst egnede produkt til bekæmpelsen af cancer. Der går højst sandsynligt mange år endnu, før et endeligt medicinsk produkt, der med garanti kan helbrede alle cancersygdomme, er på markedet. Men hvis det er en mulighed, at en sygdom som cancer, med garanti, kan helbredes i fremtiden, ved at indsprøjte små, specifikke, Y-formede proteiner i kroppen, så er den aktive og intense forskning nået langt.

Side 31

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

30

10. LITTERATURLISTE

Videnskabelige artikler:

Chung, Shan, Valerie Quarmby, Xiaoying Gao, Yong Ying, Linda Lin, Chae Reed, Chris Fong, Wendy Lau, Zhihua J. Qiu, Amy Shen, Martin Vanderlaan and An Song, 2012, Quantitative evaluation of fucose reducing effects in a humanized antibody on Fcγ receptor binding and antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity activities, San Francisco.

Goetze, Andrew M, Y Diana Liu, Thomas Arroll, Lily Chu, and Gregory C Flynn, 2011, Rates and impact of human antibody glycation in vivo.

Jefferis, Roy, 2005, Glycosylation of Recombinant Antibody Therapeutics, Birmingham.

Jefferis, Roy, 2009, Glycosylation as a strategy to improve antibody-based therapeutics. Bilag 2) Putnam, Wendy S., Saileta Prabhu, Yanan Zheng, Meena Subramanyam and Yow-Ming C. Wang, Pharmacokinetic, pharmacodynamics and immunogenicity comparability assessment strategies for monoclonal antibodies

Shade, Kai-Ting C. and Robert M. Anthony, 2013, Antibody Glycosylation and Inflammation, Charlestown.

Bøger:

Bidstrup, B. B. & Schou, B., 2011. Bioteknologi 4. 1. red. Århus: nucleus.

Bruun, K., Geertsen, P. B. & Helmig, K., 2011. Grundbog i Bioteknologi 2. 1. red. Århus: Gyldendal.

Side 32

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

31

Falkenberg, H., Gasbjerg, P. K. & Nielsen, L. H., 2008. Fysiologi Fra molekyle til individ. 2. red. Århus:

Systime.

Ferrer, I. & Thurman, E. M., 2009. Liquid chromatography-Time of Flight Mass Spectrometry: Principles, Tools and Applications for Accurate Mass Analysis.. 1. red. New York: Wiley.

Grau, C., 2006. Strålebehandling af kræft. Månedsskrift for Praktisk Lægegerning, Februar, pp. 2-3.

Kristjansen, P., 2001. Kræft -Hvad er det?. 1. red. Viborg: Nyt Nordisk Forlag Arnold Busck A/S.

Moldoveanu, S. C. & David, V., 2013. Essentials in modern HPLC Separations. 1. red. s.l.:Elsevier.

Skadhede, T., Selschau, K. & Abildgaard, K., 2008. Biologiens FG. 1. red. Knebel: Forlaget KATS.

Spengler, B., Kirsch, D., Kaufmann, R. & Cottor, R., 1991. Rapid Comunications in MassSpectrometry. 5. red.

Düsseldorf: Wiley.

Sørensen, A. B., Falkenberg, H., Gasbjerg, P. K. & Jensen, G. S., 2005. Genetik Grundbog. 1. red. Århus:

Systime.

Hjemmesider:

Agilent Technologies, u.d. Agilent Technologies. [Online]

Available at: http://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Instruments-Systems/Mass-
Spectrometry/6500-Series-Accurate-Mass-Quadrupole-Time-of-Flight-(Q-TOF)-LC-MS/Pages/gp57723.aspx

[Senest hentet eller vist den 11. december 2014].

American Cancer Society, 2014. American Cancer Society. [Online]

Available at: http://www.cancer.org/cancer/cancerbasics/what-is-cancer

[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].

Ammundsen, I. N., 2012. Kræftens Bekæmpelse. [Online]

Available at: http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/bivirkninger-senfolger/gode-raad-ved-
haartab/aarsager-til-haartab/

[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].

Ammundsen, I. N. & Pedersen, J. O. B., 2014. Kræftens Bekæmpelse. [Online]

Available at: http://www.cancer.dk/non-hodgkin-lymfom-lymfekraeft/behandling-nonhodgkin-lymfom/antistof-

non-hodgkin/

[Senest hentet eller vist den 10. december 2014].

Brown, D. P., u.d. Doch Brown's Chemistry. [Online]

Available at: http://www.docbrown.info/page04/4_71atomMSintro.htm

[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].

Cancer Treatment Centers of America, 2014. Cancer Treatment Centers of America. [Online]

Available at: http://www.cancercenter.com/what-is-cancer/

[Senest hentet eller vist den 8. december 2014].

cancer.net, 2014. cancer.net. [Online]

Available at: http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/surgery/side-effects-surgery

[Senest hentet eller vist den 14. december 2014].

Cancer.net, 2014. cancer.net. [Online]

Available at: http://www.cancer.net/navigating-cancer-care/how-cancer-treated/surgery/what-cancer-surgery

[Senest hentet eller vist den 8. december 2014].

Side 33

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

32

Genengnews, 2014. genengnews.com [Online]

Available at:

http://www.genengnews.com/media/images/AnalysisAndInsight/UGENWebsitepicturesTopStoriesAnalysisInsig

ht2011Jan31_2011_3398153_AntibodiesRWBCs_BiosimilarAntibodies54.jpg

[Senest hentet eller vist den 17. december 2014]

Hansen, M. T. & Kjems, E., 2011. Kræftens Bekæmpelse. [Online]

Available at: http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/behandlingsformer/kemoterapi/bivirkninger-

kemoterapi/

[Senest hentet eller vist den 14 december 2014].

Hansen, M. T. & Kjems, E., 2013. Kræftens Bekæmpelse. [Online]

Available at: http://www.cancer.dk/hjaelp-viden/kraeftbehandling/behandlingsformer/operation/

[Senest hentet eller vist den 7. december 2014].

Ho, C. et al., 2003. The Clinical Biochemist Reviews. [Online]

Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1853331/

[Senest hentet eller vist den 10. december 2014].

Jayapal, K. P., Wlaschin, K. F., Hu, W.-S. & Yap, M. G. S., u.d. CHO Consortium. [Online]

Available at: http://www.aiche.org/sites/default/files/docs/pages/CHO.pdf

[Senest hentet eller vist den 15. december 2014].

Kore Technology, 2005. Kore Technology. [Online]

Available at: http://www.kore.co.uk/ms-200_principles.htm

[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].

Luttrell, D. B., 2013. Oklahoma City University. [Online]

Available at: https://www.youtube.com/watch?v=VJtd76BI6w8

[Senest hentet eller vist den 14. december 2014].

Mayo Clinic Staff, 2007. Monoclonal Antibody drugs for cancer: How they work. [Online]

Available at: http://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/cancer/in-depth/monoclonal-antibody/art-

[Senest hentet eller vist den 12. decmeber 2014].

MCQ Biology, u.d. MCQ Biology. [Online]

Available at: http://www.mcqbiology.com/2013/01/mcq-on-immunology-antibodies-or.html

[Senest hentet eller vist den 15. december 2014].

Morphosys, u.d. Morphosys. [Online]

Available at: http://www.morphosys.com/sites/default/files/annual_reports/morphosys-2003-annualreport-04-

Magazine.pdf

[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].

National Cancer Institute, 2013. National Cancer Institute. [Online]

Available at: http://www.cancer.gov/cancertopics/factsheet/Therapy/biological

[Senest hentet eller vist den 11. december 2014].

Pharma Celsus, u.d. Pharma Celsus. [Online]

Available at: http://www.pharmacelsus.de/uploads/pics/hplc.jpg

[Senest hentet eller vist den 10. december 2014].

Sanofi, 2014. Sanofi. [Online]

Available at: http://en.sanofi.com/event/Sanofi_TV_Cancer.aspx

[Senest hentet eller vist den 10. december 2014].

SciGuru, 2010. SciGuru. [Online]

Available at: http://www.sciguru.org/newsitem/5082/Daring-Tumors-Tumor-Cells-Make-Their-Own-Blood-

Side 34

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

33

Vessels

[Senest hentet eller vist den 9. december 2014].

Smed, H., 2013. Apoteket.dk. [Online]

Available at:

http://www.apoteket.dk/Laegemidler/Bivirkninger/Generelt%20om%20bivirkninger/Hvorfor%20har%20medici

n%20bivirkninger.aspx

[Senest hentet eller vist den 16. decemeber 2014].

Statens Serum Institut, 2013. Statens Serum Institut - Cancerregisteret. [Online]

Available at: http://www.ssi.dk/~/media/Indhold/DK%20-
%20dansk/Sundhedsdata%20og%20it/NSF/Registre%20og%20kliniske%20databaser/Registre/Cancerregisteret

%202013.ashx

[Senest hentet eller vist den 12. december 2014].

Symphogen, 2014, symphogen.com [Online]

Available at: http://www.symphogen.com/da/frontpage

[Senest hentet eller vist den 17. december]

Symphogen, 2014, symphogen.com [Online]

Available at: http://www.symphogen.com/da/why-mab-mixtures

[Senest hentet eller vist den 17. december]

Thorsted, C. K., 2014. Pharma Danmark. [Online]

Available at: https://www.pharmadanmark.dk/aktuelt/pharma/Documents/2014-april/Pharma04-2014_s22-

25.pdf

[Senest hentet eller vist den 14. december 2014].

Zaidan, G., u.d. TEDEd. [Online]

Available at: http://ed.ted.com/lessons/how-do-cancer-cells-behave-differently-from-healthy-ones-george-zaidan

[Senest hentet eller vist den 10. december 2014].

11. BILAG

Bilag 1:

Bilag 3: Samplesheet

Side 35

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

34

Bilag 4:

mAb1 med 10 mg/ml glukose – uden og med enzym

Side 36

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

35

mAb2 med 6 mg/ml glukose – uden og med enzym

mAb2 med 10 mg/ml glukose – uden og med enzym

Side 37

Studieretningsprojekt Bagsværd Gymnasium [navn fjernet]

36

mAb2 med 16 mg/ml glukose – uden og med enzym