SRP om bakterier i biofilm i Bioteknologi A

Side 1

Biofilm

Bioteknologi A

Side 2

Abstract:

This paper examines the phenomenon biofilm and how it affects the hospital service with the problem secondary infections. There will therefore be a review about biofilm and its qualities, among these the communication system quorum sensing. In the paper there will be an explanation to the problem biofilm causes in the hospital service, with an example in cystic fibrosis, because of the growing resistance towards antibiotics caused by the biofilm. Afterwards the value of present treatments, including physical treatment, disinfectants and antibiotics, will be discussed; in this part of the assignment the treatments will be described. At the end of the paper an evaluation of the possibilities that research in biofilms will lead to new and improved treatments will be presented. In this section new treatments will be described and evaluated.

The examination and research in biofilms shows that there is a significant connection between biofilms and resistant bacteria, which makes the biofilm an enormous problem in the hospital service, and especially in secondary infections. Antibiotics have a decreasing effect on the bacteria due to resistance in the microorganism. This makes it vital to discover new kinds of treatments.

Scientist has found two solutions; antibacterial surfaces and chemical “jamming stations”, which seems rather promising.

Side 3

Indholdsfortegnelse

Abstract .............................................................................................................................................................. 2 Indledning .......................................................................................................................................................... 4 Biofilm ................................................................................................................................................................ 4 Introduktion til biofilm ................................................................................................................................... 4 Fasthæftning og udvikling af biofilm på en overflade ................................................................................ 6 ”Quorum sensing”....................................................................................................................... 8 Biofilm i sekundære infektioner i hospitalsvæsenet ...................................................................................... 10 Introduktion til problemet ............................................................................................................................ 10 Biofilm i cystisk fibrose ............................................................................................................................. 11 Behandlingsformer til rådighed i dag .............................................................................................................. 12 Antibiotika .................................................................................................................................................... 12 Bakteriernes forsvarsmekanismer ............................................................................................................ 13 Nye behandlingsmuligheder............................................................................................................................ 16 Antibakterielle overflader............................................................................................................................. 16 Kemiske Støjsendere ................................................................................................................................ 17 Konklusion ........................................................................................................................................................ 18 Sidste Kommentarer ........................................................................................................................................ 19 Litteraturliste ................................................................................................................................................... 20

Side 4

Indledning:

Normalt tænker vi på en bakterie som flydende frit i en planktonlignende tilstand. Dette er dog langtfra tilfældet for alle bakterier. Bakterier foretrækker nemlig at leve i det, der kaldes en biofilm.

Biofilm er det, man kan se som plak på tænderne eller den der klamme slimede substans, der sidder i dit afløbsrør. Det, man ikke kan se, er, at biofilmen er en samling af en hel masse bakterier, som har formet et helt samfund, hvor hver bakterieart har hver sin funktion.

Denne biofilm er i midlertidig meget hårdfør, hvilket er et problem i hospitalsvæsenet, da biofilmen ikke bare lader sig bekæmpe af diverse antibiotika. Hvis bakterierne kommer ind i kroppen via eksempelvis et kateter, og disse begynder at danne en biofilm, så er spillet stort set tabt, og det vil være svært at bekæmpe den infektion, der dannes. Men hvis man ikke kan bekæmpe biofilmen effektivt med antibiotika, hvordan kan man da bekæmpe biofilmen?

I dette studieretningsprojekt vil der startes ud med en redegørelse af bakterier i en biofilm og biofilmens funktioner. Efterfølgende vil der være en forklaring for, hvilken betydning biofilm har i forhold til det problem, sekundære infektioner udgør i hospitalsvæsenet med cystisk fibrose som eksempel. I denne forbindelse vil der være en diskussion, der omhandler værdien af de behandlingsformer, man har til rådighed i dag. Til slut vil der gives en vurdering af mulighederne for, at forskningen i biofilm vil føre til nye og forbedrede behandlingsformer.

Biofilm:

Introduktion til biofilm:

Biofilm er fysiologisk en modsætning til den panktoniske celle, da denne flyder frit, hvorimod bakterierne i en biofilm sidder fast i en matrix.

Som nævnt før, kan biofilm findes mange steder bl.a. i form af plak på tænderne eller slimet i afløbsrør sågar den tynde hinde, man kan mærke på vandhanehovedet.

Biofilmen dannes ved, at mikroorganismer sætter sig fast på en overflade og udskiller en matrix.

Disse miljøer kan være stort set over det hele så længe det overholder følgende kombination: mikroorganismer (bakterier men også svampe, alger, protozoer og andre mikroorganismer),

Side 5

fugtighed, næring og en fast overflade. Da bakterierne i biofilmen er gode til at tilpasse sig, kan biofilm stort set leve overalt.

Biofilm kan bestå udelukkende af en art bakterie, men i naturen vil en biofilm højst sandsynligt bestå af flere forskellige arter bakterier. Disse bakterier bliver holdt sammen ved hjælp af ekstrapolymert stof (ESP), som er sukrede molekylære tråde sammensat af polysakkarider, proteiner, nukleinsyrer (DNA og RNA) og amfifile polymere forbindelser. EPS bliver udskilt af organismerne selv, og gør det muligt for organismerne at forme komplekse tredimensionelle kolonier (se kilde nr. 15), der er meget robuste. DNA og RNA er rigtig gode bestanddele i EPS, da disse klistrer godt til både overflader og andre bakterieceller. DNA’et og RNA’et bliver udskilt af nogle af bakterierne, som dør pga. dette, men de ofrer sig for, at de andre bakterier i biofilmen kan holde sammen.

Biofilmens form afhænger af livsforholdene for bakterierne, altså afhængigt af miljøet kan biofilmen være få cellelag tyndt eller flere cm tykt.

Biofilm har mange forskellige egenskaber både biokemiske og fysiske. Dette varierer fra biofilm til biofilm, da der er en stor variation af arter i de forskellige biofilm. Selvom der er forskellige egenskaber for forskellige biofilm, er der også mange fællestræk for disse.

Hovedfællestrækkene for biofilm er: – biofilm kan tilpasse sig ændringer i miljøet, – mikrobielle celler i biofilmen kan løsrive sig fra biofilmen enten individuelt eller i ”klumper”, – hvis cellen, der løsriver sig, er en individuel celle, er det nemmer at dræbe denne, end dem der er i biofilmen, – hvis cellerne løsriver sig i klumper, er det sværere at dræbe disse, da de har nogle af de defensive egenskaber fra biofilmen, – i det rette miljø kan biofilm ”vandre” henover en overflade på forskellige måder (se bilag 1).

Bakterier kan slukke eller tænde for funktioner i deres DNA for at bruge så lidt energi som muligt.

Her kan man se, at funktionerne, der bliver brugt af en bakterie i den planktoniske tilstand er anderledes end de funktioner, der bliver brugt af en bakterie i en biofilm. Altså er det genetiske udtryk forskelligt fra en bakterie i biofilm til en planktonisk bakterie.

Side 6

For at kommunikere med hinanden udskiller bakterier kemiske signaler. Bakterier i en planktonisk tilstand vil ikke kunne sende disse kemiske signaler ud i en så koncentreret mængde, at der vil ske nogle ændringer i de genetiske udtryk i bakteriecellerne. Derimod kan EPS (ekstrapolymert stof) muliggøre, at signalmolekylerne kan opnå en så tilstrækkelig høj koncentration, at de genetiske udtryk ændres i bakterierne. Dette sker, da bakterierne først vil aktivere for en bestemt funktion i deres gener, når populationen er stor nok til, at det enten er fordelagtigt for cellerne at aktivere denne funktion, eller det er sikkert i forhold til evt. forsvar fra værten de lever i (fx kroppen) (se kilde nr. 2). Dette kaldes på engelsk ”quorum sensing” og betyder oversat ”fornemmelse for beslutningsdygtigt antal”.

Fasthæftning og udvikling af biofilm på en overflade

Som nævnt tidligere er der kun få krav til, at en biofilm kan dannes, nemlig tilstedeværelsen af følgende: en fugtig overflade, næring og tilstedeværelsen af mikroorganismer.

Når en væske flyder hen over et objekt eller en overflade vil molekyler sætte sig på overfladen og derved danne en kemisk film. Denne kemiske film indeholder ofte stoffer, som bakterierne kan bruge til næring eller som en form for ”fasthæftningsmolekyler”.

Først binder bakterierne sig kort til denne kemiske film og vil så ”flyde videre”, denne fase kaldes for den reversible vedhæftning.

Efter et stykke tid vil bakterierne dog binde sig permanent til overfladen og den kemiske film, denne fase kaldes den permanente vedhæftning. Udover at bakterierne udskiller EPS, som er med til at ”klistre” til overfladen, hæfter bakterierne sig også fast til overfladen vha. amyloide fibriller.

Disse proteiner er særdeles gode til fasthæftningen. De selvsamme proteiner findes også i edderkoppespind. Mikroorganismerne der er hæftet fast på overfladen begynder nu at dele sig og danner mikrokolonier af små ubevægelige celler. Andre bevægelige celler bevæger sig rundt oppe på overfladen for, at hele overfladen kan koloniseres.

Efter et stykke tid vil cellerne vokse sig og skabe disse meget komplekse strukturer, som nævnt i indledningen. Disse strukturer bliver eksempelvis af pseudomonas aeruginosa og andre bakteriearter formet som i en næsten paddehattelignende struktur. Disse strukturer bliver bl.a.

dannet på denne måde af rhamnolipider (bliver brugt i cellernes overflade, strukturen består af et hydrofilt hoved og en hydrofob hale), som primært bliver produceret af de bakterieceller, som

Side 7

sidder i ”stilken” af disse paddehatte. Herefter vil de bevægelige bakterier danne ”hovedet” i paddehattene. Denne strukturform er meget praktisk for biofilmen, da der på denne måde kan strømme næring til hele strukturen i stedet for kun i de øverste lag. Altså i stedet for, at bakterierne aktivt skal flytte næring rundt til hele kolonien, kommer næringen direkte hen til alle bakterierne i biofilmen.

Til sidst vil der opstå en ligevægtstilstand mellem de voksende bakterier, bakterierne der sætter sig fast og bakterierne, der løsriver sig (se bilag 2). Efter den ”grundlæggende” biofilm er dannet, kan den begynde at etablere andre arter af mikroorganismer ind i biofilmen. De nye arter mikroorganismer er enten kommet tilfældigt ind i biofilmen (den har ramt ind i biofilmen og er derefter begyndt at dele sig) eller de udvælges specifikt for at øge styrken i biofilmen og dennes funktion.

Hvis der efter et stykke tid ikke er nok næring eller levevilkårene ikke er optimale for biofilmen eller dele af denne, vil, som nævnt tidligere, individuelle celler eller klumper af biofilmen løsrive sig og bevæge sig henover overfladen med strømmen. Dette kan gøres på forskellige måder (se bilag 1). Det kan være ved, at biofilmen gradvist udbreder sig i ”bølger” henover overfladen. Hele kolonien kan også følge strømmen og på denne måde, flytter biofilmen hen, hvor der er mere næring, eller den rammer et større område. Den kan også rulle henover overfladen, eller den kan løsne sig, som nævnt tidligere, i klumper af biofilm. Til sidst, kan nogle bakterier løsrive sig ”individuelt”. Ved denne form for løsrivning producerer nogle bakterier enzymet alginatlyase, som hydrolyserer matrixen (EPS), som bakterierne lever i, hvor det indvendige af en mikrokoloni bliver flydende, og til sidst kommer de, nu planktoniske bakterier, til yderste lag af mikrokolonien og kan etablerer sig andre steder, hvor der måske er mere næring eller det på anden måde er mere fordelagtigt.

Man kan se forskellige vækstfaser for biofilmen ved funktionen af log til levedygtige cellekoncentration som funktion af tiden. Her kan man se fem forskellige faser: Den første fase er latensfasen, hvor bakterierne har fasthæftet sig til overfladen, og her vokser bakterierne ikke i særlig høj grad, da bakterierne her skal vænne sig til omgivelserne i miljøet. Herefter begynder fase to, den eksponentielle vækstfase, hvor bakterierne har vænnet sig til omgivelserne og begynder at vokse eksponentielt med tiden. Efter dette begynder fase tre, decelerationsfasen,

Side 8

hvor enten manglen på næring eller ophobning af giftstoffer gør, at væksten i bakterierne aftager.

Derefter begynder fase fire, som er den stationære fase, hvor summen af nye celler, der produceres og celler, der dør, er lig nul. Til slut er fase fem, dødsfasen, hvor mikroorganismerne dør som følge af næringsmangel, ophobning af toksiner eller virusinfektioner. De nedbrydes herefter enzymatisk eller ved osmotiske processer (se bilag 3).

”Quorum sensing”:

Man har i forskning fundet ud af, at bakterier kommunikerer med hinanden. Denne kommunikation kaldes quorum sensing. Denne form for ”kemisk sprog” er praktisk for bakteriekolonierne, da de på denne måde kan finde ud af, hvor mange de er i kolonien og her ”tænde” for funktioner, der er mest praktisk ved store samlinger af bakterier.

Den bedst dokumenterede form for quorum sensing er den, der er fundet i gramnegative bakterier, som er N-acyl-L-homoserine lactone (AHL)-baserede signaleringssystemer (se bilag 4).

Bakterier, der er grampositive, gør også brug af quorum sensing, disse bruger dog i stedet små peptider, der normalt har en længde på 5-17 aminosyrer. Et sidste system, der findes, er Autoinducer-2-systemet (AI-2), signalstofferne her kaldes autoinducers (se kilde nr. 6).

I denne opgave, vil der blive fokuseret på det AHL-baserede signaleringssystem, da det er det bedst dokumenterede, og da det har størst relevans for opgaven.

For at bakterien kan finde ud af, hvor mange ”naboer” den har, udsender den kemiske signaler ved hjælp af et signalproducerende protein, som tilhører proteiner i LuxI-gruppen (se kilde nr. 10).

Disse kemiske signaler bliver da opfanget af et receptorprotein, LuxR, hvorefter det genetiske udtryk ændres, hvis der er nok bakterier til at udskille signalmolekylerne. Quorum sensing i Pseudomonas aeruginosa er baseret på to signaleringssystemer, som er beskrevet som LasI,R og rhlI,R, hvor I og R er henholdsvis det signalproducerende protein og receptorproteinet. Det genetiske udtryk ændres ved, at koncentrationen af signalstofferne når en tærskel, hvorpå det bliver opfanget af receptorproteinet, som derefter arbejder sig hen imod det gen, der skal

”tændes”; målgenet. Når signalstof/receptor-komplekset binder sig til målgenet, vil der dannes et

mRNA, som så kan ændre det genetiske udtryk (se bilag 5). Ved LasI produceres 3-oxo-C12-HSL

Side 9

(homoserine lactone), som passer til LasR receptoren og RhlI producerer C4-HSL, som er specifikt for RhlR receptoren.

Man har fundet ud af, at alle bakterier gør brug af quorum sensing. Bakterierne har forskellige kemiske signaler fra art til art (se eksempler, bilag 6). Hvad der er fælles for alle bakterier er

starten på deres signalstof, som er^{NH}. Altså N-AHL (se bilag 4). Det, som er

O

O

R

O forskelligt fra bakterieart til bakterieart, er den acyl sidekæde, der er tilknyttet N-AHL. Disse former for kemiske signalstoffer bruges til at kommunikere til egen art. Altså sender bakterierne ”private” beskeder til deres egen art vha. det signalmolekyle, som passer lige præcis til deres art, så de i en biofilm ved, hvor mange af egen art, der er til stede. Disse signalmolekyler er amider.

Amider dannes ved, at primære og sekundære aminer (henholdsvis R – NH og R^{1} – NH – R^{2}) kan

2 kondensere med carboxylsyrer og derved danne N-substituerede amider, som har enten en eller to alkylgrupper (se bilag 7). Da molekylerne er for store til at diffundere gennem cellevæggen, transporterer cellerne signalmolekylerne ud af cellerne ved hjælp af effluxpumper (effluxpumper er en mekanisme i cellen, der pumper toksiner ud af cellen gennem cellemembranen). Herefter skabes en ligevægt af signaleringsmolekyler uden- og indenfor cellen.

Men bakterier sender ikke udelukkende beskeder via kemiske signalstoffer internt i sin egen art.

De kan også producere signalstoffer eksternt, altså til andre arter bakterier. Den før omtalte kommunikation kaldes intra-kommunikation, hvor kommunikationen mellem forskellige arter kaldes inter-kommunikation (se bilag 8). Her kan bakterierne altså finde ud af, hvor mange af en anden art, der lever i biofilmen. Altså, som B. Bassler siger det: ”Hvor mange af mig og hvor mange af dig?” (se kilde nr. 3) (for molekylærstruktur af eksternt signalstof se bilag 9). Det eksterne signalstof er en keton, hvilket vi kan se ved oxygenatomet og dets placering. En

ketonforbindelse beskrives ved R^{1} – CO – R^{2} eller R^{1} COR^{2}, hvor R^{1} og R^{2} ikke må være

hydrogenatomer. Ketongrupper har meget tilfælles med aldehyder (R – CHO), dog oxideres ketoner ikke ligeså let, som aldehyder.

Fordelen for bakterierne ved at kommunikere på denne måde er, som tidligere nævnt, at kunne ændre i genudtrykket, altså ”slukke” eller ”tænde” for forskellige funktioner i generne. På denne

Side 10

måde, kan de bl.a. vælge først at udskille giftige stoffer, når bakterierne i en biofilm er talrige nok til at forsvare sig mod antistoffer i en vært.

Biofilm i sekundære infektioner i hospitalsvæsenet

Introduktion til problemet:

Bakterier er i forvejen et problem i hospitalsvæsenet grundet infektioner, der er forårsaget af disse, men når bakterier lever i en biofilm bliver det et endnu større problem. Man kan ved de planktoniske celler nedkæmpe disse med antibiotika relativt enkelt (hvis da ikke disse har udviklet resistens i den planktoniske tilstand), men ved biofilm kan man ikke bare nedkæmpe dem ved hjælp af antibiotika eller andre former for biocider, da den matrix, bakterierne lever i, er svær at trænge igennem, og bakterierne ofte er i en dvalelignende tilstand med begrænset celledeling. Og hvis biocidet trænger igennem biofilmen, er det tit, at det ikke får ram på alle bakterierne. De bakterier, der ikke er blevet dræbt, er højst sandsynligt mutanter, som er blevet resistente overfor biocidet. Ved en længerevarende behandling med biocidet vil biocidet til sidst dræbe mutantbakteriens konkurrenter. Herefter er det stort set umuligt at fjerne infektionen fra patienten.

I hospitalsvæsenet er det især blevet et stort problem med hensyn til patienter der får sekundære infektioner (se bilag 10). Man skal forstå en sekundær funktion ved, at en person, før den omtalte infektion, har et svækket immunsystem på grund af en anden form for sygdom eller infektion. Det kan være noget så ”fredeligt” som en forkølelse, men det er dog et særligt stort problem, hvis det er en patient med cystisk fibrose, HIV, cancer, en patient, der gennemgår en strålebehandling m.m.. Hvis der så opstår en bakteriel infektion, kan infektionen hurtigt udvikle sig uden de store problemer, da immunsystemet er optaget andre steder eller ikke virker i det inficerede område, og her kan mikroorganismerne udvikle sig til en veludviklet biofilm.

Disse infektioner kan opstå på flere måder: enten ved at bakterierne får adgang til kroppen via et kateter (fx dialysepatienter), hvor kateteret er inficeret med bakterierne, eller ved, at patienten får sat et kunstigt organ ind i kroppen (fx en kunstig hofte). Bakterierne kan også komme ind i kroppen via et sår (fx under operation, hvis der ikke er blevet desinficeret ordentligt inden proceduren). Bakterierne har også mulighed for at komme ind i kroppen gennem luftvejene, som

Side 11

dråbesmitte eller støvbårent. I værste tilfælde vil bakterierne kunne få adgang til blodet, og er der nok bakterier kan de måske forårsage en blodforgiftning.

Ved en person, som har et optimalt immunsystem, er disse infektioner ikke et særlig stort problem. Hvis immunsystemet virker skal mikroorganismer først trænge igennem kroppens overflade, hvilket kræver et sår el. lign. Inde i kroppen skal der være mikroorganismer nok til at de kan overvælde de første rækker af hvide blodlegemer og kampstoffer og endelig specialiserede blodlegemer, der danner antistoffer. Kroppen klarer dagligt mange småinfektioner uden problemer.

Men hvis en person i forvejen har en sygdom eller infektion, hvor immunsystemet er optaget med at bekæmpe dette, er det især farligt, fordi en biofilm kan nå at dannes, inden bakterierne er uskadeliggjort. Især fordi bakterierne, som nævnt tidligere, gør brug af quorum sensing, er de farlige, da de først udsender toksiner, når de er talstærke. På denne måde kan bakteriekolonien ”gemme sig” for det i forvejen svækkede immunsystem og først gøre sig bemærket, når de er nok til at modstå et angreb.

Biofilm i cystisk fibrose:

Noget man især er opmærksom på er den sekundære infektion som finder sted hos mange cystisk fibrosepatienter. Cystisk fibrose er en arvelig sygdom, som bl.a. består af slimansamlinger i lungerne, vejrtrækningsproblemer og nedsættelse af bugspytkirtlens produktion, hvor der i denne også opstår væskefyldte hulrum og ardannelse.

60 % af patienter med denne lidelse bliver inficeret med bakterien pseudomonas aeruginosa (se kilde nr. 21), der godt kan lide at sidde i det slim, som der bliver dannet ved denne sygdom. På grund af dette seje slim, er det det ideelle sted for p. aeruginosa at danne biofilm, da denne overflade ”overholder” alle kravene nævnt i et tidligere afsnit for at dannelsen af en biofilm kan finde sted.

P. aeruginosa er overalt i vores miljø, dog er dette ikke et problem for raske mennesker, da vi for det første har et raskt immunsystem, men vi har også et form for ”rensningssystem”, som fx i ørerne, hvor der under sådan en infektion bliver produceret slim, som får renset bakterierne væk.

Hos cystisk fibrose patienter, kan de nemlig ikke få renset bakterierne væk via slimet, ligesom når vi hoster slim op.

Side 12

P. aeruginosa er en opportunistisk patogen bakterie, der findes overalt i vores omgivelser. Det faktum, at bakterien er en opportunistisk patogen bakterie, vil sige, at den normalt ikke er sygdomsfremkaldende hos mennesker, der er raske. Bakterierne findes normalt i tarmsystemet og på hudoverflader samt i vore omgivelser. Ved et svækket immunsystemkan kan P. aeruginosa give alvorlige komplicerende infektioner, da bakterien opformeres ”i det skjulte” og først, når det er sikkert for kolonien, begynder at udskille sygdomsfremkaldende toksiner (bruger quorum sensing).

P. aeruginosa er skyld i 10-15 % af alle lunge- urinrørs- og sårinfektioner og 10 % af alle blodforgiftninger (se kilde nr. 21). Patienter med cystisk fibrose er netop en gruppe, der er udsat for opblomstring af P. aeruginosa som sekundær infektion. Patienterne skal altså, udover at skulle behandles for deres primære sygdom, også løbende behandles for komplicerende infektioner med bl.a. P. aeruginosa.

Behandlingsformer til rådighed i dag

Vi har i dag forskellige muligheder for behandling af infektioner, som stammer fra bakterier. Der er bl.a. grundig desinficering af overflader inden operationer eller indsættelse af katetre m.m. for overhovedet at undgå, at bakterierne får adgang til kroppen via fremmedlegemer

(operationsudstyr eller en kunstig hofte).

Man gør også brug af mekanisk rensning, for at fjerne biofilmen. Mekanisk rensning kan være noget så simpelt som at børste sine tænder, men det kan også omhandle skylning af fx øren, kæbehuler, bihuler m.m. Mekanisk rensning er fx blevet brugt ved bronchoskopisk lavage, hvor dele af lungerne bliver skyllet. Den samme metode bruges også til at opsamle prøver fra lungerne for at kunne diagnosticere, hvilken form for infektion, der er til stede i lungerne. Altså sprøjter man en væske ind i en kropshulning (fx ørerne) for at skylle bakterierne ud.

Antibiotika:

For at kunne bekæmpe bakterierne i biofilm i dag, bruger man dog mest biocider, og til behandlinger af infektioner i kroppen bruger vi undergruppen antibiotika.

Antibiotikum virker på forskellige måder. Noget antibiotikum som penicillin virker ved, at blokere to proteinkompleksers virkning i at danne bakteriecellens cellevæg, ved at ændre formen på et af proteinkomplekserne, så det andet proteinkompleks ikke kan passe ind i det ændrede

Side 13

proteinkompleks (se bilag 11). Dette gøres ved hjælp af en binding til proteinkomplekset med penicillins karakteristiske firleddede β-lactamring (se bilag 12) (se kilde nr. 16 og 25). Fordi cellerne nu ikke kan danne en sufficient cellevæg, vil bakterien under delingen svulme op på grund af det osmotiske tryk inde i cellen, så den sprænges og dør. Fællesbetegnelsen for disse stoffer kaldes β-lactamer. Altså er disse former for antibiotika midler, som hæmmer cellevægssyntesen.

Andre antibiotika som for eksempel tetracyklin går intracellulært og blokerer bakteriens proteinsyntese ved at binde sig til en del af bakteriens ribosom. Dette vil hæmme væksten af bakterien og bakteriedelingen, så presset på kroppens immunforsvar aftager. Med den aftagende bakteriemængde, kan kroppens immunsystem dræbe de resterende bakterier nemmere.

Nogle antibiotika virker ved at påvirke den cytoplasmatiske membran. I dette tilfælde vil antibiotikummet reagere med lipopolysaccharider (store molekyler bestående af et lipid og et polysaccharid) og fosfolipider på den ydre cytoplasmamembran i gramnegative bakterier. Altså påvirkes transporten over membranen og permeabilitetsbarrieren. Stoffer der hører under disse er bl.a. Polymyxiner.

Andre antibiotika påvirker DNA- eller RNA-syntesen. Ved for eksempel antibiotika tilhørende gruppen Fluorquinoloner, går antibiotikummet direkte ind og hæmmer enzymet DNA-gyrase, der er med til at bringe det dobbeltstrengede DNA i en form, hvor dette kan replikeres og trans-skripteres. Dette går ikke ind og ødelægger det tilsvarende enzym hos mennesker, da cellerne her er ufølsomme over for denne form for antibiotikum. I denne form for antibiotika stopper DNA-syntesen i bakterierne. Stofferne er således også bakteriedræbende.

Der er også nogle antibiotika, der er antimetabolitter. Under gruppen sulfonamider, virker antibiotikummet ved at virke hæmmende på para-aminobenzoesyre (se bilag 13), som er med til opbygningen af folsyre, som er en vigtig del af dannelsen af nye celler. Altså stoppes dannelsen af nye celler ved denne form for antibiotika, og stofferne er bakteriostatiske, altså væksthæmmende.

Bakteriernes forsvarsmekanismer:

Antibiotika er dog ikke specielt effektivt imod biofilmen, for selvom antibiotikummet, i forhold til mange andre biocider, har nemmere ved at trænge igennem det ekstrapolymere stof (EPS), så har antibiotika stadige en begrænset virkning imod bakterierne i forhold til deres virkning på en bakterie i planktonisk tilstand. Det er svært for antibiotikummet at trænge igennem ESP. Man kan

Side 14

relativt ”nemt” undersøge forskellen på biocider på planktoniske bakterier i forhold til bakterier i biofilm. Dette gør man ved at dyrke bakterier i planktonisk tilstand og i en biofilm på vækstmedier, og herefter tilsætte den samme mængde biocid til hvert vækstmedium. Resultaterne er stort set det samme i alle forsøg; det er sværere at slå bakterier i biofilm ihjel end det er at slå planktoniske bakterier ihjel (se bilag 14). Bakterier i en biofilm kan være op til 1500 gange mere resistente end en planktonisk bakterie (se kilde nr. 18)

For at holde biofilmen nede bliver man nødt til at bruge specifikke antibiotika, for at nedkæmpe bakterierne så effektivt som muligt og for at undgå, at bakterierne udvikler resistens. Dog kan antibiotikummet i de fleste tilfælde kun holde infektionen nede, da bakterierne i en biofilm sjældent bliver fuldkomment udryddet. Altså deler de bakterier, der er tilbage efter et antibiotika-angreb, sig, og når disse er en tilpas mængde igen, udskiller de på ny toksiner (quorum sensing).

Bakterierne er oven i købet blevet sorteret, således at de mest antibiotikafølsomme bakterier er dræbt, men de mere resistente er tilbage (selektionstryk).

Som nævnt tidligere, er der i en biofilm nogle statiske bakterier, der hæfter sig fast til overfladen, og der er nogle bakterier, der bevæger sig rundt oven på disse. Altså er problemet med antibiotika også, at det tit kun dræber enten de statiske bakterier eller de bevægelige bakterier. Man har dog fundet ud af gennem forskning, at man kan nedkæmpe biofilmen mere effektivt ved at kombinere to forskellige antibiotika, så de både slår de statiske bakterier ihjel og de bakterier, der bevæger sig ovenpå disse. Man skal da kombinere det på en måde, så stofferne ikke modvirker hinanden.

Hvis man for eksempel kombinerer β-lactamer med tetracyklin, vil de ikke kunne dræbe bakterierne, da β-lactamer kun virker på celler i vækstfasen, mens tetracyklin netop stopper bakterievæksten.

Risikoen ved kombinationsbehandling er imidlertid, at bakterierne relativt hurtigt kan blive resistente overfor antibiotikummet, og så bliver man nødt til at finde ud af, om der er andet antibiotikum, der virker.

Man kan også kombinere behandling med mekanisk rensning og behandling med antibiotika. Her bliver der sprøjtet store mængder antibiotika direkte ind i en kropshulning, som for eksempel en kæbehule eller et mellemøre, ved kroniske betændelsestilstande. Dette er en relativt ny metode.

Side 15

Bakterier kan udvikle resistens på mange forskellige måder indenfor de forskellige grupper af antibiotika. I denne opgave fokuseres på resistensmekanismerne for gruppen β-lactmantantibiotika. Inden for denne gruppe, er der tre resistensmekanismer, bakterierne gør brug af for at forsvare sig:

Enten laver de en enzymatisk nedbrydning af β-lactamringen ved hjælp af enzymer tilhørende gruppen β-lactamase. Det kan for eksempel være penicillinase, som bryder en kulstof-kvælstof forbindelse, der er i den kemiske kerne i penicillinmolekylet, 6-aminopenicillansyre (se bilag 15).

For at undgå, at penicillinase ødelægger denne forbindelse, kan man sætte nogle sidegrupper på penicillinet, så enzymet ikke kan omslutte penicillinmolekylet. Dette er eksempelvis gjort ved det halvsyntetiske penicillin, der kaldes meticillin (se bilag 16) (se kilde nr. 14).

Bakterierne kan også lave en ændring i de penicillinbindende proteiner, så penicillinen, på grund af mutationen, ikke kan binde sig til et af de to proteinkomplekser, der arbejder sammen i cellevægsproduktionen. På denne måde, kan bakterierne fortsat danne cellevæg.

Bakterierne laver en ændring af efflux- eller transportmekanismer i cellemembranen. I P.

aeruginosa forekommer denne slags ændringer tit.

Man må forestille sig, at bakterier kan blive mindre følsomme overfor et antibiotikum, men vil højst sandsynligt bukke under for store mængder antibiotika. Altså vil en stor koncentration af antibiotika dræbe bakterierne, selv i en biofilm. Dette kan dog udelukkende opnås ved påføring af antibiotikummet direkte på infektionsstedet (altså ved skylning med antibiotika, som beskrevet tidligere), da indtagelse med så store mængder antibiotika via piller eller indsprøjtning vil være i så høje koncentrationer, at det oftest vil være til skade for patienten. Derfor vil det ikke være alle områder i kroppen, der vil kunne behandles på denne måde.

Antibiotika er meget effektive i kampen mod mikroorganismer, især bakterier i en planktonisk tilstand, men: Resistensudvikling er et stort problem, som forstærkes af bakteriers evne til at danne biofilm. Stoffer, som kan angribe biofilmen, eller forstyrre quorum sensing, som er med til at opbygge biofilmen, kan altså have stor værdi for behandlingen af ellers meget komplicerede sygdomme.

Side 16

Nye behandlingsmuligheder

På grund af den nedsatte effektivitet af antibiotikas virkning på bakterier i biofilm, har det også ført til ny tænkning indenfor nye former for biocider. I blandt disse nye behandlingsmuligheder, der forskes i på nuværende tidspunkt er antibakterielle overflader til brug i både det kliniske miljø og det industrielle. Noget andet, man også ser som en god mulighed er at sende ”kemiske støjsendere” (se kilde nr. 22) ind i biofilmen, der forstyrrer bakteriernes kommunikation, altså vil støjsenderne skabe en forstyrrelse af ”quorum sensing” i biofilmen.

Antibakterielle overflader:

Forskningen omkring udvikling af antibakterielle overflader er tænkt af mange, denne opgave fokuserer på forskning, der udarbejdes i et samarbejde mellem iNANO og Teknologisk Institut i Århus (se kilde nr. 9). I dette projekt, vil man forsøge at udvikle nanostrukturerede overflader, som begrænser bakteriernes evne til at hæfte sig til overfladerne. Altså bliver det umuligt for bakterierne overhovedet at danne en biofilm, da disse skal bruge, som tidligere nævnt, en fugtig overflade med næring. Dette vil være praktisk i hospitalsvæsenet mht. indsætning af kunstige led

(fx en kunstig hofte), katetre m.m. I projektet gør man brug af nanoteknologi, som er ”evnen til at observere, manipulere og kontrollere materialer på det molekylære og supramolekylære niveau”

(se kilde nr. 9) (0,1-100 nm (10^{-9} m)).
Man vil bruge en teknik, der kaldes ”sol-gel-teknologi” (solution=sol, geleringsproces=gel) for at

danne en gennemsigtig glaskeramisk-lignende overflade fra en opløsning. Denne opløsning metalorganiske forbindelser. Opløsningen gennemgår en geleringsproces og derefter aggregerer det til nanopartikler. Nå midlet bliver overført til en overflade, fordamper opløsningen, og en hård belægning på overfladen er tilbage. Overfladestrukturen efter påføringen vil altså afspejle formen på nanopartiklerne. Mediet har også en anden egenskab, hvilket er, at de metalorganiske forbindelser kan påsættes funktionelle organiske sidekæder, altså får man en hærdet overflade, som har helt specielle egenskaber. Man har således formået at lave sol-gel-lakker, der er grafitafvisende, kalkafvisende, isafvisende og korrosionsbeskyttende – nu skal man bare have udviklet en overflade, som er bakterieafvisende.

Side 17

Her kan man evt. lave hydrofobe overflader, eller superhydrofobe overflader, så det fugt, der muligvis vil sætte sig på overfladen, vil ”trille” af overfladen og opsamle al snavs og bakterielle organismer på sin vej.

Man forsker i at lave sol-gel overflader med kemiske forbindelser, nanopartikler eller proteiner ind i sol-gelen, der afviser bakterie. Man vil dog højst sandsynligt ikke kunne opfinde en sådan gel, der kan afvise alle arter bakterier, da der er så stor en diversitet i en biofilm. Her bliver man nødt til at vide, hvilke bakterier, der er til stede i det miljø, som overfladen skal i kontakt med, så man kan undgå fasthæftning af lige præcis disse bakterier.

Hvis det lykkes at producere sådanne overflader, vil bakterierne næppe kunne udvikle resistens overfor stoffet, da stoffet ikke dræber bakterierne, men ”kun” forstyrrer deres fasthæftning, så bakterierne ikke vil kunne have adgang til kroppen.

Disse overflader vil dog kun kunne hjælpe ved forebyggelse af infektioner. Teknikken kan altså ikke bruges, når først bakterien og biofilmen er inde i kroppen som ved cystisk fibrose.

”Kemiske støjsendere”:

Men vi skal også bruge behandling, der bekæmper biofilm inde i kroppen, da infektioner ikke udelukkende opstår ved indsættelse af fremmedlegemer i kroppen. Her er der nogle forskere, heriblandt Michael Givskov, der har forsket i nogle ”kemiske støjsendere”, der kan forstyrre kommunikationen imellem bakterierne.

Her har man fundet frem til en tangplante, Delisea pulchra, som har udvikling en teknik til at bekæmpe bakterierne. Tangplanten udskiller stoffer, der ”forvirrer” bakterierne. Stofferne fra denne plante kalder man halogenerede furanoner. Furanonerne ligner de stoffer, som bakterierne bruger ved quorum sensing, og da de ligner disse stoffer, modtager bakteriernes receptorer disse ”falske” signalstoffer og lammer den interne kommunikation. På denne måde tror bakterierne ikke, at de er talstærke nok til at indlede et angreb, altså til at udskille toksiner. Man har ved forskning nemlig bekræftet, at furanonerne rammer generne for bakteriernes signalsystem. Ved nedsættelse af quorum sensing, bliver den strukturelle stabilitet i biofilmen også nedsat. Med varianter af furanonerne kan man højst sandsynligt forhindre bakterierne i at opbygge biofilmen, og når bakterierne ikke er i deres biofilm, er de bakterier, der ellers før var resistente, mere følsomme overfor antibiotika.

Side 18

Bakterierne kan ikke gøre noget ved denne form for behandling, da de ligesom de antibakterielle overflader, ikke dræber bakterierne, men udelukkende forstyrrer deres kommunikation, quorum sensing. Derfor bliver eventuelle ”furanonresistente” modstandere ikke udryddet, ligesom ved antibiotikaresistens, så disse er de eneste former af bakterien, der er tilbage. Man har fundet ud af, at disse furanoner findes i mange planter, som vi bruger i hverdagen, som fx hvidløg, dog skal der 50 hvidløg til, at der er nok stof til at forstyrre bakteriernes kommunikation, og da hvidløg indeholder nogle stoffer, der ikke er gode for os i for store mængder, ville man forgiftes, hvis man spiste så mange (se kilde nr. 22). Altså skal man først finde en måde, hvorpå man kan isolere disse stoffer, så de kan bruges til medicinsk brug uden, at de skader den inficerede.

For forebyggende behandling af biofilm og for at mindske muligheden for, at der kommer bakterier, der danner biofilm ind i menneskekroppen, vil det være en fordel at fokusere på forskning indenfor antibakterielle overflader ved hjælp af nanoteknologi. Men hvis bakterierne allerede er i kroppen, vil det være en klar fordel at fokusere på forskning inden for kemiske støjsendere, og finde stoffer og organismer, man kan isolere disse furanoner fra. Dette vil kunne føre til langt bedre behandlingsmuligheder end det vi har i dag (antibiotika), da bakterierne ikke vil kunne udvikle resistens, som de er begyndt i stigende grad at gøre overfor antibiotika, og andre biocider.

Konklusion:

I denne opgave kan konkluderes, at biofilm er en samling bakterier, der samler sig i komplekse tre dimensionale strukturer vha. ESP. Disse biofilm er et stort problem i hospitalsvæsenet på grund af biofilmens utrolige antibiotiske tolerance. Biofilmen formår både at virke som forsvarsværk overfor immunsystemet, en god mulighed for bakterierne at kommunikere via quorum sensing og biofilmen gør endda bakterierne, der lever i denne, meget mere modstandsdygtige overfor antibiotikum.

Derfor er der brug for ny forskning inden for behandlingsformer mod bakterier, der lever i en biofilm. Området inden for medicin er stadig meget nyt, og derfor er mange anlæg omkring biofilmen stadig uopklarede. Det er også derfor, der er så lidt forskning omkring nye behandlingsformer, der rammer biofilmen.

Side 19

Der er dog nogle, heriblandt antibakterielle overflader, der ved hjælp af nanoteknologi vil forebygge bakterier i overhovedet at komme ind i kroppen, som der kan risikeres ved indsættelse af en kunstig hofte eller lignende. En anden forskning er, at sende kemiske støjsendere ind i kroppen til bakterierne, hvor den kroniske infektion er lokaliseret, og derved afbryde bakteriernes kommunikation, og på denne måde bremse deres produktion af toksiner.

Det virker altså lovende med den nye forskning, og vi kan højst sandsynligt se frem til nye og forbedrede behandlingsformer i fremtiden, dog er der stadig et stykke vej endnu til, at behandlingsformerne er udviklede og gode nok til, at det kan føres ud i praksis og til, at det er sikkert nok til behandling af patienter, der lider af kroniske infektioner, som fx patienter med cystisk fibrose.

Sidste kommentarer:

Det skal her til sidst siges, at biofilm ikke udelukkende er en ulempe rent medicinsk, det er også en stor ulempe industrielt, da biofilmen kan gå ind og stoppe afløbsrør eller korrodere metal m.m.

Her vil man også til at bruge disse antibakterielle overflader for at mindske disse problemer.

Udover dette er biofilm heller ikke alene et problem for os. Biofilm udgør fx en vigtig del af den flora, der omringer os og på sin vis ”uddanner” immunsystemet, så immunsystemet bliver bedre til at bekæmpe fremmedlegemer. Udover dette, er biofilmen også en vigtig del af vores tarmflora, hvor bakterierne her spiller en vigtig rolle i vores fordøjelse og også er med til at forhindre skadelige mikroorganismer i at sprede sig.

Biofilm bliver også brugt i nogle spildevandreservoirer, hvor biofilmen filtrerer og renser vandet, når vandet løber gennem biofilmen. Mikroorganismerne i biofilmen opsamler eventuelle urenheder og andre organismer i spildevandet.

Side 20

Litteraturliste

1. Biofilm basics. Udgivet af Montana State University. Sidst opdateret: 2008.

Internetadresse:http://www.biofilm.montana.edu/biofilm-basics.html - Besøgt d.

(Internet)

2. Biofilms: The hypertextbook!. Redigeret af: Alfred B. Cunningham m.fl. 4.3. udg. NSF, 2011.

Internetadresse: http://www.hypertextbookshop.com/biofilmbook/v004/r003/index.html - Besøgt

d. 7.12.2011 (Bog)

3. Bonnie Bassle: How Bacteria “talk”. Februar 2009. Internetadresse:

http://www.ted.com/talks/bonnie_bassler_on_how_bacteria_communicate.html (Foredrag)

4. Dr. Pinna: RESVERATROL–WHAT IS IT? Penicillin-core1. Udgivet af Dr. Pinna. Sidst opdateret: 2011.

Internetadresse: http://drpinna.com/resveratrol-what-is-it-5837/penicillin-core1-2 - Besøgt d.

(Internet)

5. Er blindtarmen virkelig overflødig?. I: Illustreret Videnskab nr. 12, 2008, s. 11. Internetadresse:

http://illvid.jmi.meer3-udv.dwarf.dk/spoerg-os/er-blindtarmen-virkelig-overfloedig Besøgt d.

(Artikel)

6. Givskov, Michael m.fl: Interference of Pseudomonas aeruginosa signalling and biofilm formation for infection control. I: expert reviews in molecular medicine nr. 12, april 2011, s. 1-12 (Artikel)

7. Hunt, S. M. m.fl: A 3D cellular automata model of biofilm dynamics, 2005. Internetadresse:

http://www.biofilm.montana.edu/resources/movies/2005/2005m02.html (klip)

8. Institut for systembiologi: Mikrobiologer ser bakterier i kortene. Hansen, Anne m.fl.: I:

Nanoteknologiske Horisonter. 1. udg. Danmarks Tekniske Universitet, 2010. side 161-174.

Internetadresse:

http://www.nano.dtu.dk/upload/centre/nanodtu/nanoteknologiske_horisonter/kapitler_pdf/kapit

el%2011%20-%20mikrobiologer%20ser%20bakterier%20i%20kortene.pdf Besøgt d. 4.12.2011

(Afsnit i bog)

9. L. Meyer, Rikke m.fl.: Nanoteknologi til udvikling af antibakterielle overflader. I: Mælketiden nr. 12,

2007, s. 280-282. Internetadresse:

http://www.nano.dtu.dk/upload/centre/nanodtu/nanoteknologiske_horisonter/supplerende%20u
ndervisningsmateriale/kap11/nanoteknologi_til_udvikling_af_antibakterielle_overflader.pdf Besøgt

d. (Artikel)

10. L. Spoering, Amy og Michael S. Gilmore: Quorum sensing and DNA release in bacterial biofilms. I:

Current Opinion in Microbiology nr. 9, 2006, s. 133-137. Internetadresse:

Side 21

ftp://www.daba.lv/grozs/Mikrobiologijas/BiotehIII/Kvorums/Kvorums_pleevees.pdf Besøgt d.

(Artikel)

11. Mads Jørn Stougaard, speciallæge i øre- næse- halssygdomme (samtaler )

12. Natursyn: Slim-samfundet. DR, P

Internetadresse:http://www.dr.dk/P1/Natursyn/Udsendelser/2011/04/htm - Besøgt d.

2.12.2011 (Radioprogram)

13. Oxoforbindelser: Aldehyder og ketoner. Mygind, Helge: I: Kemi 2000 B-niveau. 1. e-bogsudgave.

udg. Haase & Søns Forlag, 2011. side 149-153. (Afsnit i bog)

14. Penicillin i: Lademanns lægeleksikon. side 80-82. Redigeret af: Aage Andresen og Kim Frost-Larsen.

Bind 8, 1. udg. Lademann forlagsaktieselskab, 1977. (Afsnit i bog)

15. Pitts, Betsey og Swogger, Ellen: CSLM 3D view of Pseudomonas aeruginosa biofilm structure, 2005.

Internetadresse: http://www.biofilm.montana.edu/resources/movies/2005/2005m06.html (klip)

16. pro.medicin.dk: Antibakterielle midler til systemisk brug. Udgivet af pro.medicin.dk. Sidst opdateret: 7.7.2011.

Internetadresse: http://pro.medicin.dk/Laegemiddelgrupper/Grupper/315714 - Besøgt d.

(Internet)

17. R. De Kievit, Teresa og H. Iglewski, Barbara. Quorum Sensing, Gene Expression, and Pseudomonas Biofilms. I: Methods in Enzymology. Side 118-118. Redigeret af: Ron J. Doyle. Bind 310, 1. udg.

Academic Press, 1999. (Afsnit i bog)

18. Science Daily: Biofilms: Researchers Discover New Ways to Treat Chronic Infections. Udgivet af Science Daily. Sidst opdateret:

Internetadresse: http://www.sciencedaily.com/releases/2009/12/1327.htm - Besøgt d.

(Internet)

19. Sites of primary and secondary infection. Udgivet af Montana State University. Sidst opdateret:

2008. Internetadresse: http://www.biofilm.montana.edu/resources/images/healthmedical-
biofilms/sites-primary-and-secondary-infection.html - Besøgt d. (Internet)

20. Syrechlorider og amider. Mygind, Helge: I: Kemi 2000 B-niveau. 1. e-bogsudgave. udg. Haase & Søns Forlag, 2011. side 160-160. (Afsnit i bog)

21. Vahle, Gordon: Vi bekæmper bakterierne med deres egne våben. I: Illustreret Videnskab nr. 4, 2002,

s. 58-61. Internetadresse: http://illvid.dk/files/bonnier-ill/pdf/DKIV_7575.pdf Besøgt d.

(Artikel)

Side 22

22. Viden Om: De resistente bakterier. DR,

Internetadresse:http://www.dr.dk/DR2/VidenOm/Programmer/Arkiv/De+resistente+bakterier/200

801.htm - Besøgt d. (Program)

23. Wikipedia: 4-Aminobenzoic acid. Udgivet af Wikipedia. Sidst opdateret:

Internetadresse:http://en.wikipedia.org/wiki/Para-aminobenzoic_acid - Besøgt d.

(Internet)

24. Wikipedia: Amyloid. Udgivet af Wikipedia. Sidst opdateret: Internetadresse:

http://en.wikipedia.org/wiki/Amyloid - Besøgt d. 4.12.2011 (Internet)

25. Wikipedia: Beta-lactam. Udgivet af Wikipedia. Sidst opdateret: Internetadresse:

http://en.wikipedia.org/wiki/Beta-lactam - Besøgt d. (Internet)

26. Wikipedia: Biofilms. Udgivet af Wikipedia. Sidst opdateret: Internetadresse:

http://en.wikipedia.org/wiki/Biofilm - Besøgt d. (Internet)

27. Wikipedia: Efflux (microbiology). Udgivet af Wikipedia. Sidst opdateret: 12.8.2011.

Internetadresse:http://en.wikipedia.org/wiki/Efflux_(microbiology) - Besøgt d.

(Internet)

28. Wikipedia: Folic acid. Udgivet af Wikipedia. Sidst opdateret: Internetadresse:

http://en.wikipedia.org/wiki/Folate - Besøgt d. (Internet)

29. Wikipedia: Lipopolysaccharide. Udgivet af Wikipedia. Sidst opdateret:

Internetadresse:http://en.wikipedia.org/wiki/Lipopolysaccharide - Besøgt d. (Internet)

30. Wikipedia: Phospholipid. Udgivet af Wikipedia. Sidst opdateret: Internetadresse:

http://en.wikipedia.org/wiki/Phospholipid - Besøgt d. (Internet)