SRP om genmodificering af planter i Bioteknologi og Matematik

Side 1

Bioteknologi og naturstoffer i planter

STUDIERETNINGSPROJEKT I BIOTEKNOLOGI/ MATEMATIK

Side 2

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

2

Abstract

The purpose of this project is to examine how the plant is affected by the natural products, how the subculture of DNA is proceeding in a PCR (polymerase chain reaction), how you transform genes into a plant. Furthermore this paper includes a discussion that includes the perspectives in gene modifications of plants. Through research in approved books and authorized websites with knowledge above common average, the paper will give a thorough answer to the questions about the construction and use of natural products along with their effect on the plant. In addition to this, the models for the multiplication of DNA in a PCR will be made with the results from an experiment. Finally a discussion will explain the many different aspects of whether gene modified plants can lead to positive or negative results. The study shows that the natural products play a huge part in how a plant survives continuous attacks from foreign organisms. Furthermore this project shows that PCR is an effective method to determine if a gene has been successfully transformed into a plant and then quality-PCR

(qPCR) can reveal how much. Conclusively, the paper can’t reach a precise conclusion whether we should, or should not, use gene modified plants. This is due to the many different aspects there is to be taken into consideration.

Side 3

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

3

Indledning

Igennem mange år har man udnyttet planternes egenskaber og uden at vide det, har man udnyttet de naturstoffer, som planterne indeholder til f.eks. medicin og gift. I dag ved man dog langt mere om planterne og de mekanismer, der ligger bag disse vigtige stoffer.

Naturstofferne har både gavnlige og skadelige effekter, og gennem de seneste årtier er forskerne begynd at få en bedre forståelse for, hvilken rolle naturstofferne spiller for planten. Antioxidanter og forsvarsstoffer er to grupper af stoffer, der er essentielle for planten. Uden disse ville planten ikke have en chance for at klare sig. Men hvorfor er det, at disse to grupper af stoffer er så vigtige for planten? Hvordan kan det være, at man kan ændre på, hvor stort udtrykket af et bestemt naturstof i en plante er? Dette vil blive diskuteret i følgende opgave, hvor en bioteknologisk gennemgang tjener til forståelse af de mekanismer, der ligger til grund for nogle af plantens vigtigste naturstoffer. I det følgende vil begrebet naturstoffer blive undersøgt ved hjælp af en grundig redegørelse for opbygningen og funktionerne af antioxidanter og forsvarsstoffer, hvorefter deres betydning for planten vil blive gennemgået. Derefter vil opgaven beskrive, hvordan gener med nye egenskaber kan overføres til andre planter og derefter vise, hvordan man kan undersøge om det nye gen virker, og i hvor høj grad det bliver udtrykt. Efter dette opstilles matematiske modeller for udviklingen af mængden af DNA i et qPCR-forsøg, og der vil med udgangspunkt i det udførte forsøg, blive stillet modeller op for netop disse data. Til slut vil der blive diskuteret, hvorvidt overførsel af gener imellem planter er godt eller dårligt, med en vurdering af perspektiverne af denne overførsel.

Side 4

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

4

Indholdsfortegnelse

Abstract ................................................................................................................................................ 2 Indledning ............................................................................................................................................ 3 Hvad er et naturstof? ........................................................................................................................... 5 Antioxidanter og forsvarsstoffer .......................................................................................................... 5 Antioxidanters og forsvarsstoffers opbygning ................................................................................. 5 Antioxidanter ............................................................................................................................... 5 Forsvarsstoffer ............................................................................................................................. 6 Stoffernes virkemåde ....................................................................................................................... 8 Antioxidanter ............................................................................................................................... 8 Forsvarsstoffer ........................................................................................................................... 11 Stoffernes betydning for planten ....................................................................................................... 11 Overførsel af gener mellem planter................................................................................................... 12 Detektion af nye gener ...................................................................................................................... 14 Detektion af gener ......................................................................................................................... 14 Måling af geners aktivitet .............................................................................................................. 16 Modeller for DNA-opformering i PCR-forsøg ..................................................................................... 18 Standartkurve ................................................................................................................................. 21 Afvigelser - residualværdier ........................................................................................................... 21 Perspektiverne i overførsel af gener .................................................................................................. 22 Diskussion....................................................................................................................................... 22 Vurdering ....................................................................................................................................... 25 Konklusion .......................................................................................................................................... 25 Bilag .................................................................................................................................................... 26 Litteraturliste ..................................................................................................................................... 28

Side 5

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

5

Hvad er et naturstof?

Begrebet naturstoffer dækker over de mange forskellige slags stoffer, der findes i planterne. De kan dog overordnet inddeles i to forskellige hovedgrupper; primære og sekundære

          1
naturstoffer.

De primære naturstoffer er de stoffer, som er essentielle for planten, hvilket betyder

                                                                        1
de er livsvigtige. Her er der tale om f.eks. kulhydrater, aminosyrer, proteiner, ligning osv. Disse

stoffer er nødvendige for, at planten kan vokse og sprede sig.

De sekundære naturstoffer er alle de stoffer, der er specielle for hver enkelt plante, det skal dermed siges, at forskellige planter godt kan producere de samme naturstoffer. Her er der f.eks. tale om forsvarsstoffer, pigmenter, alarmstoffer, duftstoffer, giftstoffer osv.

Antioxidanter og forsvarsstoffer

Antioxidanters og forsvarsstoffers opbygning

Antioxidanter

Stofgruppen Antioxidanter er en af plantens vigtigste grupper af stoffer. Disse stoffer sørger for, at alle de skadelige radikaler som planten indeholder ikke skader vitale stoffer som f.eks. cellemembraner og de omkringliggende stoffer ved oxidation. Definitionen af antioxidanter er: Stoffer, som selv i lave koncentrationer sammenlignet med det oxidérbare substrat, forsinker

                                2
eller forhindrer oxidation af et substrat.

Antioxidanter findes i mange forskellige afskygninger. Der vil blive taget udgangspunkt i de to antioxidanter catechin og ascorbinsyre (vitamin C).

Catechin tilhører gruppen af polyphenoliske flavonoider og har molekyleformlen

C H O. [3] Strukturformlen for catechin er:

15 14 6

                                   4
Figur 1 viser strukturformlen for catechin.

1

http://www.denstoredanske.dk/It,_teknik_og_naturvidenskab/Kemi/Fysisk_kemi_og_fysisk_elektrokemi/naturstoffer
2

Marianne Linde Damstrup m.fl., år 2001, Sammenligning af assays for antioxidativ effekt, p. 7

3

http://en.wikipedia.org/wiki/Catechin

4

Marianne Linde Damstrup m.fl., år 2001, Sammenligning af assays for antioxidativ effekt, p. 10

Side 6

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

6

Catechin er en flavanol, da molekylet har en hydroxygruppe på position 3 i C-ringen, men ingen oxogruppe på position 4 i samme ring. [5]

Hvad der gør catechin til et effektiv antioxidant er, at den har hydroxylgruppe på position 3 i C-ringen, hvilket øger den antioxidative effekt. Derudover er den også i besiddelse af to hydroxylgrupper på position 3’ og 4’ i B-ringen. Dette giver den optimale effekt af stoffet, i forhold til, hvis der kun havde været én hydroxylgruppe i B-ringen. [6]

I samme kilde er det samtidig blevet påvist, at det er vigtigt med hydroxyliseringen i A-ringen, da flavanoler uden en hydroxylgruppe på position 5 ikke har nogen antioxidativ effekt.

Ascorbinsyre (vitamin C) er ligeledes en antioxidant, men har molekyleformlen

C H O [7] og dens strukturformel er:

6 8 6

                                      8
Figur 2 viser strukturformlen for ascorbinsyre.

På figur 2 ses det, at ascorbinsyre består af en lactonring, hvorpå der sidder to hydroxyl-grupper, som gør, at den opfører sig og defineres som en syre. Som radikal på lactonringen har man en enediol-gruppe som medfører, at molekylet er i stand til, at resonansstabiliserer sig. Denne betydning vil blive forklaret længere nede, i afsnittet ”ascorbinsyres virkemåde”.

Forsvarsstoffer

Forsvarsstofferne kan opdeles i to grupper: fytoanticipiner og fytoalexiner.

Fytoanticipiner er stoffer som konstant ligger klar i planten til, at angribe indtrængende bakterier og insekter. Der er dermed et konstant depot af disse forsvarsstoffer. Fordelen med disse stoffer er, at fra en bakterie eller et insekt angriber planten til, at planten forsvarer sig, går der næsten ingen tid. Det er dog energikrævende, at have disse stoffer liggende i planten hele tiden, da det koster energi, at lave dem, hvilket er spildt energi hvis de ikke bruges. Fytoanticipiner er giftstoffer

5

http://nfscfaculty.tamu.edu/talcott/Food%20Chem%20605/Class%20Papers%202010/Review-Structure%20AOX.pdf

p. 6 tabel 3
6

http://nfscfaculty.tamu.edu/talcott/Food%20Chem%20605/Class%20Papers%202010/Review-Structure%20AOX.pdf

p. 7
7

http://en.wikipedia.org/wiki/Ascorbic_acid

8

Marianne Linde Damstrup m.fl., år 2001, Sammenligning af assays for antioxidativ effekt, p.13

Side 7

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

7 som ligger i vakuoler i plantevævet, hvor de her har en passiv form og dermed ikke er giftige. Når vakuolen brydes bliver stofferne omdannet til den aktive form som er giftig. [9]

Fytoalexiner er derimod stoffer som ikke ligger klar i planten til eventuelle angreb. De bliver først dannet, når planten er blevet angrebet, hvilket betyder, at planten sparer energi.

Derudover kan planten producere de fytoalexiner, som er bedst egnet til, at bekæmpe den angribende organisme.

Fytoalexiner kan dermed være mere specifikke end fytoanticipiner.

Et eksempel på en fytoanticipin er stoffet dhurrin, som har molekyleformlen

C H NO^{9} og har strukturformlen:

14 17 7

                                  10
Figur 3 viser strukturformlen for dhurrin.

Vi brugte dhurrin i vores overførsel af gener på LIFE, og dhurrin hører under gruppen

cyanogene glykosider^{11}.

Et eksempel på en fytoalexin er resveratrol som findes i druer [12], som har molekyleformlen C H O og strukturformlen:

14 12 3

                                     13
Figur 4 viser strukturformlen for resveratrol.

9

http://www.suite101.com/content/cyanide-production-for-plant-defense-against-herbivores-a251023

10

http://www.chromadex.com/chemicals/Dhurrin_RG.html

11

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/EfterOevelsen48/naturstoffer.ashx dias 23 & 25

12

http://www.ajevonline.org/cgi/content/abstract/43/1/49

13

The American Phytopathological Society, Induced Plant Defenses Against Pathogens and Herbivores, år 1999, p. 59

Side 8

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

8

Som det ses på figur 4 så er resveratrol en stilbenoid [14], hvilket er en afledt version af stofgruppen (E)-Stilben(engelsk), idet den er blevet hydroxyleret med 3 hydroxylgrupper. Stoffet hører under gruppen phenoler, som er det mest almindelige fytokemikalie. [15] Stoffet består af en dobbeltbinding imellem to C-atomer, hvorpå der, til hvert af disse C-atomer, er bundet en phenylring. På disse ringe sidder der henholdsvis 1 og 2 hydroxylgrupper.

Som det ses af de to eksempler og andre eksempler fra bogen ” Induced Plant

                                     13
Defences Against Pathogens and Herbivores”,

så består fytoanticipiner og - alexiner af steroid

ringe og de fleste har mindst én OH^{-} -gruppe. Dette vil blive forklaret i næste afsnit.

Stoffernes virkemåde

Antioxidanter

Antioxidanter virker som tidligere nævnt ved, at de forhindrer skadelige radikaler i, at oxidere lipiderne i cellemembranen og de omkringliggende stoffer. For at få en forståelse af, hvordan antioxidanterne virker, ser man først på, hvordan en oxidation forløber. Oxidationen har

3 trin.

Trin 1 er initationsfasen, hvor der dannes frie radikaler ved tilstedeværelsen af overgangsmetaller(som virker katalyserende), lys eller andre radikaler der er dannet ved nedbrydningen af hydroperoxid.

Trin 2 er propagationsfasen, hvor de dannede radikaler reagerer med det tilstedeværende oxygen, og danner nye radikaler, som kan holde kædereaktionen af oxidation i gang.

Trin 3 er terminationsfasen, hvor frie radikaler reagerer med hinanden, og danner stabile produkter, som ikke længere er i stand til oxiderer forbindelser i planten. [16]

Antioxidanterne inddeles i 2 kategorier: primære (PA) og sekundære antioxidanter

(SA). De primære antioxidanter kan forhindre denne oxidation på 3 måder.

1) Radikal scavenging. Ved radikal scavenging fanger antioxidanter radikalerne, hvorefter de reagerede med dem, hvorved der dannes mere stabile produkter. Dette kan ske ved enten, at

14

http://www.ars.usda.gov/research/publications/publications.htm?seq_no_115=256900

15

The American Phytopathological Society, Induced Plant Defenses Against Pathogens and Herbivores, år 1999, p. 150

16

Marianne Linde Damstrup m.fl., år 2001, Sammenligning af assays for antioxidativ effekt, p. 5

Side 9

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

9 antioxidanten fungerer som en hydrogendonor eller som radikal acceptor. [17] Der vil blive kigget nærmere på hydrogendonoren længere nede under i afsnittet med catechin.

2) Metalchelering. Ved metalchelering kan antioxidanter fungerer som chelerende stoffer, der ”fanger”, hvorved der dannes chelater. Chelater er ringsluttede kompleksforbindelser mellem en metalion og et eller flere organiske stoffer. Metalchelering har den effekt, at det forhindrer eller forsinker dannelsen af frie radikaler, da metalionerne som kan virke som katalysator for dannelsen af radikaler bindes i et kompleks og uskadeliggøres. Ascorbinsyre er et eksempel på en antioxidant som er i stand til, at chelere metaller. [17]

3) Quenching af oxygen. Ved quenching af oxygen fanger antioxidanten en singlet oxygen, og omdanner det til triplet oxygen uden at ilten forbruges under processen. Det er ønskværdigt, at omdanne singlet oxygen til triplet oxygen, da singlet oxygen reagerer med fedtsyrer og danner hydroperoxid som fungerer oxiderende. Omdannelsen af singlet oxygen til triplet oxygen forgår ved en exitering, hvor elektronerne i oxygens yderste skal springer ned i en anden skal og dermed går ned i energiniveau.

Catechin virker som en hydrogendonor ved scavenging af radikaler. Dette skyldes at den afgiver to hydroner og to elektroner til radikalerne og derved neutraliserer dem. På figuren nedenunder ses reaktionen for oxidation af catechin:

                              18
Figur 5 viser oxidationen af catechin.

Ascorbinsyre er ligesom catechin en meget effektiv hydrogendonor. Oxidationen for ascorbinsyre er afbilledet nedenunder:

                                  19
Figur 6 viser oxidationen af ascorbinsyre.

Når ascorbinsyre har afgivet sin første elektron til bekæmpelsen af et radikal, så befinder den uparrede elektron sig i det konjugerede(sammenhængende) system i lactonringen. Dette system består af danner oxogruppen på position 1og dobbeltbindingen mellem 2.- og 3. position. Da den uparrede elektron spreder sig ud over 3 C-atomer, har den mange muligheder for, at lokalisere sig.

17

Marianne Linde Damstrup m.fl., år 2001, Sammenligning af assays for antioxidativ effekt, p. 8 - 9

18

http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S00011&script=sci_arttext

19

Marianne Linde Damstrup m.fl., år 2001, Sammenligning af assays for antioxidativ effekt, p. 14

Side 10

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

10

Dette betyder, at molekylet har mange resonansformer, hvilket gør den stabil - deraf

               20
resonansstabilitet.

Ascorbinsyre kan også fungere prooxiderende, den kan reagere med overgangsmetallerne jern og kobber, som ellers ville sætte gang i dannelsen af skadelige

        20
oxidanter.

Sekundære antioxidanter virker primært ved, at nedbryde hydroperoxider, og danne stabile produkter ved andre måder end ved kædebrydende mekanismer. [21]

Effekten af antioxidanter kan dog variere, hvilket afhænger af, hvordan sammenspillet mellem de forskellige antioxidanter er. Der findes tre former for effekter: synergisme, additiv effekt og antagonistisk effekt.

En synergisk effekt opstår når to eller flere antioxidanter fremmer hinanden, så summen af den samlede antioxidante effekt er større end den additive effekt. Synergisme kan opstå på to måder. De kan udøve hver deres beskyttende effekt, én laver scavenging og den anden laver quenching af oxygen, hvilket giver en forøget effekt, da de yder en bred beskyttelse. Den anden måde er, at de begge virker som radikale acceptorer, hvilket betyder, at den ene regenererer den anden, når den er blevet oxideret. [22]

Der opstår f.eks. en synergisk effekt, hvis det er den svageste af to antioxidanter der regenerer den stærkeste. Dermed får den stærke lov til at udøve sin beskyttende virkning to gange, hvilket er mere end, hvis de to oxidanter begge havde udøvet deres virkning én gang hver.

Den additive effekt opstår, når to eller flere antioxidanter, hverken fremmer eller hæmmer hinanden, dermed er den samlede antioxidative effekt summen af den additive effekt af de enkelte antioxidanter.

Den antagonistiske effekt opstår når to eller flere antioxidanter ophæver eller hæmmer hinanden. [21] Et eksempel på dette kan være det modsatte af eksemplet for synergisme ovenover. Hvis den stærkeste antioxidant nu regenerer en svagere antioxidant, så vil man få en mindre antioxidativ effekt. Dette skyldes, at den svageste har udøvet sin effekt to gange, hvilket vil give en mindre effekt, end hvis de begge havde udøvet deres effekt én gang.

20

Marianne Linde Damstrup m.fl., år 2001, Sammenligning af assays for antioxidativ effekt, p. 15

21

Marianne Linde Damstrup m.fl., år 2001, Sammenligning af assays for antioxidativ effekt, p. 8

22

Marianne Linde Damstrup m.fl., år 2001, Sammenligning af assays for antioxidativ effekt, p. 18-20

Side 11

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

11

Forsvarsstoffer

Hvilke forsvarsstoffer der bliver udskilt imod de forskellige angribere, hænger meget sammen med, hvem der angriber. Igennem forskning er der blevet fundet tegn på, at reaktionen

på angriberen hænger meget sammen med alderen af den angribende organisme, race osv.^{23}

Forsvarsstoffer virker meget på samme måde, der er derfor ikke forskel på, om man snakker om fytoanticipiner eller – alexiner.

Når et insekt angriber planten, ødelægges vakuolerne i plantevævet, hvorved f.eks.

fytoanticipinen dhurrin bliver omdannet til p-hydroxybenzaldehyd og HCN. Dette sker ved, at de to enzymer β-glukosidase og α-hydroxy-nitrilase over to omgange omdanner dhurrin til HCN. HCN er giftigt, og dræber uønskede indtrængere ved, at hæmme deres respirationsproces, hvilket kvæler dem. [24] Det er dog ikke den samme reaktion for alle fytokemikaler, da der vil indgå forskellige enzymer og stoffer i de forskellige reaktioner.

Stoffernes betydning for planten

Naturstofferne har som helhed en kæmpe betydning for planten. Uden disse stoffer vil planten ikke kunne overleve i lang tid uden, at blive spist eller inficeret af andre organismer.

Antioxidanter spiller en stor rolle i planten, hvor det er disse stoffer, der uskadeliggører de skadelige oxidanter. Hvis ikke planten indeholdte disse stoffer vil cellemembranen og de omkringliggende stoffer blive ødelagt ved denne oxidation. Det er tidligere blevet vist i opgave, at antioxidanter kan arbejde sammen for, at yde den bedst mulige beskyttelse af planten.

Forsvarsstofferne er et af de andre stoffer som planten er afhængige af. Uden disse stoffer ville planten være chanceløs overfor angreb fra udefrakommende organismer. Det er dog energikrævende for planten at danne disse forsvarsstoffer i store mængder, hvilket er grunden til, at de har udviklet systemet med fytoanticipiner og – alexiner. Dette system er vigtigt for planten,

23

http://shop.elsevier.de/elsevier/journals/files/baecol/top10/Induced_plant_defences_From_molecular_biology_to_e

volutionary_ecology.pdf dias 5 - 6
24

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/EfterOevelsen48/naturstoffer.ashx dias 25

Side 12

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

12 da den sparer energi ved ikke, at have alle stofferne liggende klar til bekæmpelse af fremmede organismer, men kan producerer dem, når den bliver angrebet.

Man har igennem forskning fundet ud af, at planten kan bruge skadelige oxidanter til dens fordel. Når fremmede parasitter angriber planten, kan planten enten vælge, at bekæmpe disse organismer ved hjælp af fytokemikaler eller også sætter den gang i en reaktion som kaldes hypersentivering (HS). [25] HS består i, at planten dræber sine egne celler i det angrebne område, så parasitten ikke kan overtage dem. Dette medfører, at parasitten dør, da den ikke har nogen værtscelle, at overtage. I denne reaktion producere planten oxiderende enzymer, som sætter gang

i dannelsen af oxidanterne H O, OH^{-} og O^{-}. [26] Når disse er dannet, er den oxiderende effekt større

2 2 2 end den antioxiderende effekt, hvilke betyder, at de umættede lipider i cellemembranen bliver oxideret. Da cellemembranen ødelægges, dør cellen, og den fremmede parasit kan ikke længere overtage denne celle. Dette sker ikke bare for en eller to celler, det sker for mange celler i det område, hvor parasitten er. Så ved at bruge stoffer som normalt er skadelige for planten, kan den udnytte deres virkning til sin egen fordel.

Takket være alle de stoffer, systemer og mekanismer planten har, kan den modstå angreb fra både parasitter, bakterier, insekter og mindre pattedyr.

Plantens andre naturstoffer har dog også kæmpe betydning for den, da disse kan tiltrække bestøvere, frøspredere, bekæmpe andre planter osv. [27]

Overførsel af gener mellem planter

Generelt er målet med overførslen af gener mellem planter enten, at få udtrykt et eller flere nye proteiner eller, at fjerne eller formindske udtrykket af et eller flere proteiner. Der er udviklet en række metoder, hvorpå dette kan lade sig gøre. Der er f.eks. gen-kanonen, kemisk eller elektrisk overførsel af gener, overførsel med virus og overførsel med bakterien Agrobacterium Tumefaciens. [28] Under mit ophold på LIFE blev jeg introduceret for sidstnævnte metode.

25

The American Phytopathological Society, Induced Plant Defenses Against Pathogens and Herbivores, år 1999, p. 56

26

The American Phytopathological Society, Induced Plant Defenses Against Pathogens and Herbivores, år 1999, p. 56 -

57
27

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/EfterOevelsen48/naturstoffer.ashx dias 10

28

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/EfterOevelsen48/transformation_srp.ashx dias 1

Side 13

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

13

Denne bakterie bliver kaldt naturens egen gensplejser, da den implementerer en kopi af et stykke af sit eget DNA i værtcellens genom. Dette stykke DNA får cellen til, at danne en svulst, som bakterien lever af.

Metoden, hvorpå man integrer kopien af DNA’et, kaldes transfer-DNA. Metoden udføres ved, at man ødelægger plantens cellevæg, hvorved det fenolholdige stof acetosyringon udskilles. Når dette stof bliver udskilt, aktiveres specielle virulensgener (virgener) på TI-plasmidet.

Den indsatte DNA-kopi kaldes for transfer-DNA (tDNA) og har en promoter og en terminator som planten kan aflæse, hvilket medfører, at genet for tumoren bliver udtrykt via

                              29
transkriptions/translationssystemet.

Når man bruger Agrobacterium Tumefacien som vektor ved transformation har brugen af denne bakterie to ulemper 1) bakterien danner en tumor på værtcellen. Man afhjælper dette problem ved, at fjerne generne som koder for dannelsen af tumoren, og indsætter i stedet de gener, man ønsker udtrykt af den nye plante. Det har vist sig, at hvis blot 25 basepar bibeholdes i hver ende (højre (HG) og venstre grænseregion(VG)), så er bakterien i stand til at

                                      28
overføre hele tDNA’et til plantecellens genom.

2) Bakteriens plasmid er meget stor, omkring

200.000 basepar, hvilket gør det svært, at arbejde med i laboratoriet. Dette problem kommer man til livs ved, at bruge andre små plasmider til, at overføre generne til den ny plante. Forskning har vist, at selvom virgenerne og tDNA’et er placeret på to forskellige plasmider, så er virgenerne stadig fuldt aktive. Dette betyder, at man kan sætte tDNA’et på små plasmider i nye vektorer og arbejde med dem dér. Dette gør det meget lettere for os, da små plasmider er nemmere at arbejde med i laboratoriet. Derudover kan de små plasmider også opformeres i Ecoli og Agrobacterium. Generne som ligger inde for HG og VG vil blive overført til planten efter de er

                                         14
blevet transformeret ind i Agrobacterium-cellerne.

Sammen med de gener som man ønsker udtrykt i planten, indsættes også et selektionsgen. Dette kan gen f.eks. være et gen for antibiotikaresistent. Dette gen gør, at man kan identificerer de planter, hvor transformationen er lykkedes. Ved at sætte planten over på et selektionsmedium kan man finde de transformerede planter, da de den transgene plante overlever på mediet, hvorimod den normale plante vil dø.

29

http://www.e-pages.dk/ku/271/ p. 22

Side 14

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

14

Blandt de andre metoder, hvorpå man kan overfører gener til en plante, er vha. en gen-kanon. Med en genkanon skyder man bogstaveligt talt gener ind i en plante. Dette udfører man ved, at dække metalpartikler med plasmid-DNA og skyde disse partikler ind i planten vha.

genkanonen. Det er dog meget få af disse partikler, som rent faktisk får ændret plantecellens genom, da metoden er meget upræcis, fordi man ikke er i stand til, at sigte imod en cellekerne.

Derfor er man også nødt til, at indsætte et selektionsgen, så der er muligt, at finde ud af, hvilke celler der har fået tilført cDNA.

Detektion af nye gener

Detektion af gener

Når man skal undersøge, om man har fået overført gener fra en plante til en anden, så er den mest brugte metode til dette, PCR-metoden (Polymerase Chain Reaction). Formålet med PCR er, at opformere en specifik DNA-sekvens, hvilket dog kræver, at man kender baserækkefølgen for det gen, man ønsker, at kigge på. Når man kender denne, kan man udvælge sin primer som er startsekvensen på den basesekvens man ønsker at opformere. En primer har en specifik basesekvens, og vil sætte sig på den skabelons – eller kodende streng som har flest komplementære baser. PCR-metoden har 3 faser; denaturering, annealing og elongering. [30]

I denatureringsfasen varmer man DNA’et op til omkring 94^{o} [31], hvor

hydrogenbindingerne som holder DNA’et sammen brydes. En DNA-streng består af en kodende streng og en skabelonsstreng, hvor disse strenge holdes sammen af hydrogenbindinger. Når man har fået skilt de to strenge af, begynder annealingsfasen.

I annealingsfasen sænker man temperaturen til omkring 60^{o31}, så primerne binder sig

til de to enkeltstrengede DNA-stykker.

I elongeringsfasen hæver man igen temperaturen til omkring 72^{o} [32], hvilket får

polymerasen til, at sætte de komplementære baser på de to enkeltstrengede DNA-stykker. Når dette er sket, begynder cyklussen forfra. Dette bliver normalt gentaget en 20 – 40 gange for, at få

30

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/EfterOevelsen48/PCR_og_RT%20PCR_srp.ashx dias 4

31

http://arep.med.harvard.edu/labgc/estep/longPCR_protocol.html

32

http://biotech.about.com/od/pcr/a/PCRtheory.htm

Side 15

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

15 opformeret DNA’en nok, til at man kan køre prøver og analyser på det. I vores forsøg blev der kørt

40 cyklusser.

Da der blev undersøgt, hvorvidt vores gener var blevet transformeret over i den nye plante, blev der brugt to primersæt. Den ene primersæt var CYP71E1 (C7), og det andet var CYP83B1 (C8).

C7 var primersættet, som genkendte de tre gener, som der blev transformeret over i den nye plante, mens C8 var primersættet der genkendte vildtypegenet i planten.

Til PCR-forsøget skulle der bruges cDNA i stedet for mRNA, hvilket man omdannede ved hjælp af enzymet revers transkriptase. Dette skyldes at mRNA er mere ustabilt end cDNA, hvilket gør det sværere at arbejde med. Revers transkriptase virker modsat af transskriptionsprocessen, så i stedet for, at gå fra DNA til mRNA, går man fra mRNA til DNA, også kaldet cDNA (complementær DNA) [33]. gDNA’et (genomisk DNA) blev oprenset før forsøget, så man havde de to slags DNA, man skulle bruge.

Vi lavede 10 rør med hver sin prøve i som vist i tabellen nedenunder:

                                                                 34
Figur 7 viser en tabel over hvad de 10 rør, der blev lavet i forsøget, indeholdte.

Hvert rør bestod af mastermix, hvilket indeholdte; buffer, nukleotider, sterilt vand og polymerase. Da dette var gjort, satte man dem i PCR-maskinen og lod dem køre 35 cyklusser.

Mens vores 10 prøver kørte i maskinen, lavede man en agarosegel som vores prøver skulle køre igennem, så man kunne bestemme, om vores gener fra blevet transformeret over i planten.

Da gelen var kølet af og hærdet tilsatte man en molekylærvægtsmarkør (MVM) som blev tilsat i første brønd, hvorefter man loadede vores ti prøver i samme rækkefølge som på figur 7 fra brønd 2 til brønd 11. man satte strøm til og DNA’et begyndte nu at vandre mod den negative pol da phosphor er negativt ladet.

Resultatet af vores gel ses på billedet herunder:

33

http://www.maxanim.com/genetics/cDNA/cDNA.htm

34

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/Ovelsesvejledning_2010.ashx p. 17

Side 16

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

16

Figur 8 viser et billede af vores færdige gelelektroforese. I venstre side er der indsat en tabel over, hvor stor de forskellige bånd i markøren er.

Det kan her ses, at genet for vildtype planten er til stede i alle prøverne, hvor der er tilsat C8-primersæt. Der ligger et bånd ved 1100 kb i prøve 6 og 8 (brønd 7 og 9), hvilket er båndet for de transformerede gener. Båndene er kun til stede i disse to prøver da disse var de eneste prøver der både indeholdte C7-primersæt og generne fra den transgene plante. Det er dermed bevist, at man succesfyldt, har fået transformeret nye gener ind i vores plante.

Der ligger også nogle bånd ved omkring 600 kb, hvilket der ikke skulle være. Disse er formentligt blev lavet fordi, der er blevet dannet et uspecifikt produkt af primerne. Dette skyldes formentligt, at primerne har reageret med noget DNA i opløsningen, som det har haft nok komplementære baser med, hvilket har fået dem til at danne dette produkt.

Måling af geners aktivitet

Vi har nu fået påvist, at der med succes er blevet overført gener til den nye plante, og man vil derfor gerne måle disse geners aktivitet. Der findes mange måder, at undersøge, hvorvidt vores overførte gener bliver i udtrykt i planten. Der findes bl.a. Northern Blot, RNA mircoarray, in

                                 35
situ hybridisering, RPA og Real-time PCR.

I vores forsøg brugte man real-time PCR (qPCR) til, at måle aktiviteten af de indsatte gener.

Dette gøres ved, at man laver en opløsning bestående af: forward og revers primere,

SYBR-green (som fluorescerer, når bunden til dobbeltstrenget DNA), nukleotider, buffer, cDNA og primersæt.

35

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/Ovelsesvejledning_2010.ashx dias 14

Side 17

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

17

SYBR-green fluorescerer, når det er bundet til dobbeltstrenget DNA, men det fluorescerer kun lidt som fri SYBR-green, og det binder ikke til enkeltstrenget DNA. Man kan derfor måle fluorescensen af opløsningen efter hver cyklus, som må være proportionalt stigende med koncentrationen af DNA. Dette skyldes, at der kommer flere bindesteder for SYBR-green, jo flere dobbeltstrenget DNA-stykker der er.

Udviklingen af mængden af DNA og dermed styrken af fluorescensen i opløsningen følger en logistisk model, som er beskrevet i næste kapitel.

Som det kan ses på billedet herunder, så fik man opgivet Ct-værdier (cyklus nummer) ud fra qPCR-forsøget. Disse værdier blev bestemt, når fluorescensen ramte en bestemt værdi.

Figur 9 viser hvornår vores Ct-værdier ramte en bestemt værdi for fluorescens.

Ud fra disse værdier kan man se, hvor vidt udtrykket af et gen er blevet større eller mindre i den transgene plante ved, at sammenholde det med udtrykket af genet i vildtypeplanten.

Vi har på billedet en gennemsnitlig Ct-værdi for Wt med actin på 24,15 og en for Wt

med C7 på 30,8, hvilket vil sige at forskellen på disse er 30,8 − 24,15 = 6,65. Man trækker disse

fra hinanden, da actin var et referencegen, hvis udtrykkelse ikke ændrer sig særligt meget, hvilket betyder, at man kan bruge det som en kontrol. På den måde kan man se, om udtrykket er blevet større eller mindre. Derefter ser man på det samme gen i den transgene plante. Her har man en gennemsnitlig værdi for 3x med actin på 26,04 og en for 3x med C7 på 19,1, hvilket vil sige at

forskellen er: 19,1 − 26,04 = −6,94. Man skal nu trække denne værdi fra Wt’s værdi: 6,65 −
( −6,94) = 13,59. Dette gør man fordi, ved at trække de to værdier fra hinanden, kan man se i

hvilken grad vores gen er udtrykt i den transgene plante i forhold til vildtype-planten. Da man teoretisk regner med, at effektiviteten af primeren er 100 %, er udtrykket af genet i den transgene

plante steget med: 2^{13,59} = 12331 gange. Hvis effektivitet af primeren havde været på 93 % i

                                            13,59
stedet for, så vil vores regnestykke i stedet være: 1,93 = 7598,43. Dette lyder af meget, men

Side 18

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

18 er ikke urealistisk, da generne for den transgene plante ikke findes i vildtypeplanten og derfor ikke bliver udtrykt.

Vi ville have gjort det samme for primersættet C8 i begge planter, og derved beregne udtrykket af vildtype genet, men da man ikke fik noget resultat fra testen, har dette ikke været muligt, hvilket også ses på figur 9.

Dette er kun den teoretiske stigning, og det er derfor også det antal gange udtrykket af genet, maksimalt kan stige. man regner dog ikke med at primeren har en effektivitet på 100 %.

Man kan beregne denne effektivitet ved, at se på, hvor meget DNA der bliver dannet efter hver cyklus. Hvis primerne er 100 % effektive fordobles mængden af produkt ved hver PCR cyklus, så:

1,2,4,8,16 osv. - hvis primerne kun er 96 % effektive får man: 1 ; 1,96 ; 3,92 ; 7,84 osv. Dette kræver, at man kender startkoncentrationen af DNA i opløsningen.

Modeller for DNA-opformering i PCR-forsøg

Når man skal lave en model for opformeringen af DNA i et PCR-forsøg skal man se på, hvilke faktorer, der kunne have indflydelse på vores valg af modeller. Man skal blandt andet se på, hvordan DNA’et bliver opformeret, hvad skal der til osv.

Hvis man starter med en enkel dobbeltstrenget DNA-streng og laver en PCR på det, så vil man ende med 2 dobbeltstrengede DNA-stykker, hvis man igen udfører en PCR på det, vil man ende med 4-, 8-, 16-, 32-strenge osv.…

Dette er dog kun den teoretiske model for DNA-opformering, altså en ekspotential

vækst der følger funktionen: 𝑦 = 2^{𝑛}, hvor n betegner det antal gange man har udført PCR på vores

dna.

Vi skal dog også have en måde, hvorpå man kan beregne mængden af DNA, hvor man har taget startmængden af DNA med i betragtning.

Dette kan man gøre ved, at sætte en konstant foran vores 2^{𝑛}. Denne konstant skal være lige så

stor som vores startmængde af DNA. Så hvis man har haft en startværdi på 1000 strenge DNA, så

er konstanten 1000 og formlen kommer til, at se sådan her ud: 𝑦 = 1000 ∗ 2^{𝑛}.
Grunden til, at man sætter denne konstant på er, at ledet 2^{𝑛} betegner, hvor mange strenge DNA

der er blevet duplikeret ud fra én streng til n cyklusser. Dette ganger man så med konstanten, hvor

Side 19

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

19 meget man havde oprindelig og man får dermed, hvor meget DNA man teoretisk ville have efter n cyklusser.

Dette er som tidligere nævnt, kun den teoretiske vækst af mængden af DNA. Dette forudsætter, at der er en uendelige mængde af polymerase og nukleotider til stede, så man er sikre på, at hver gang man har kørt en ny cyklus, så får man den dobbelte mængde dna. Hvis dette var tilfældet, vil overstående model gælde.

Hvis man tager højde for, at DNA’et ikke kan duplikeres pga. manglen på ressourcer til sidst, så vil man skulle lave en logistisk model over DNA-opformeringen. I starten vil DNA’et

kunne dele sig med en tilnærmelse til 2^{n}, men i takt med, at opformeringen skrider frem, så vil der

til sidst ikke være færre nukleotider og delingen vil gå i stå.

                          𝑑𝑦
En logistisk ligning har formlen: = 𝑎𝑦 ( 𝑀 − 𝑦 ) og løsningen til denne er:
                          𝑑𝑥

𝑦 =

𝑀

1 + 𝑐 ∗ 𝑒^{(}^{−𝑎∗𝑀∗𝑥}

)

Valget af lige præcis denne funktion skyldes, at jo flere cyklusser man kører, jo større bliver x. Når

𝑥 → ∞ så vil leddet 𝑒^{−𝑎∗𝑀∗𝑥} → 0 da e bliver opløftet i noget meget stort og negativt. Når hele

                              𝑀
          −𝑎∗𝑀∗𝑚
leddet 𝑐 ∗ 𝑒    → 0 så står 𝑦 = ≈ 𝑦 = 𝑀 tilbage. Dermed er M den maksimale
                              1+0

koncentration af DNA ved en PCR opformering.

Vi vil nu prøve, at lave en model for de data vi fik i mine 12 qPCR-forsøg, hvor det er stadig den samme logistiske formel man bruger. Det vil først blive forklaret, hvad de forskellige værdier betyder: y står for fluorescens, f(x) for fluorescensen til cyklussen x, M er den maksimale mængde dna, c er en konstant og a står for hældningen ved det lange, tilnærmelsesvis lineære, stykke midt på grafen.

Som det ses på figur 10, så har man her indsat data fra to af i alt 12 rør som man lavede forsøg på i en graf.

Side 20

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

20

Figur 10 viser to logistiske modeller for de to prøver med Wt-DNA og Actin samt en graf for funktionen mellem Ct og fluorescens for de 12 prøver.

De to rør, som der blev lavede modeller over, indeholder begge gener fra vildtype-planten (Wt) med actin som referencegen, hvilket vil sige, at det udtrykkes stabilt, og det derfor kan bruges som kontrol. Det var oprindeligt planlagt, at bruge en prøve fra vildtypen og en fra den transgene plante med samme primere, så man kunne se, om de var forskelligt udtrykt. Men grundet fejl i programmet TI-Interactive, var det kun disse prøver det var muligt, at bruge. Vi fik derefter TI til, at lave to funktioner over de to lister vi har indsat. De ses begge i figur 10 og hedder WtActin1(x) og WtActin2(x). Alle resultater er at finde i bilag 1.

Alle resultaterne er sat ind i grafen som ligeledes kan ses på figur 10. Som det ses af grafen, så følges de to funktioner ad, hvilket de også gerne skulle da de er af samme plante og har fået tilført samme primer.

Hvis det havde lykkedes, at sætte resultaterne fra rørene med DNA’et fra den transgene plante, så skulle man gerne have set et andet forløb for mængden af DNA i opløsningen.

Side 21

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

21

Dette skyldes, at der her er blevet tilført generne for dannelsen af dhurrin, hvilket vil have påvirket vores resultater.

Standartkurve

Disse modeller giver os ikke en eksakt værdi for mængden af DNA i opløsningen.

Dette skyldes, at der blev målt fluorescensen af opløsningen til n cyklusser og ikke mængden af DNA. Hvis man gerne vil omregne disse værdier til koncentrationen af DNA, så kræver det, at man har en standartkurve for koncentrationen af DNA som funktion af fluorescens. man må antage, at jo mere DNA der er i opløsningen, jo mere fluorescens vil der dermed også være, hvilket gør dem

lineær proportionale (𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏). Man kan finde ligningen for denne standartkurve ved, at lave

opløsninger med kendte koncentrationer af DNA og derefter måle fluorescensen af denne opløsning med en fluorescensmåler. Dette vil give adskillige værdier for sammenhængen mellem DNA og fluorescensen i en opløsning. Disse punkter vil man kunne sætte ind i programmet TI- Interactive og få det til, at udarbejde den bedste lineære linje over punkter. Ud fra denne linje, kan man aflæse indholdet af DNA til den givne fluorescens i vores givne opløsning.

Afvigelser - residualværdier

Når man skal regne på, hvor sandsynligt de forskellige modeller er, skal man til at regne på, hvor stor residualværdien er. I TI-Interactive, kan man få programmet til at regne værdien ud og her er den bedre jo tættere på 1 en kommer, mens den i hånden skal være så tæt på 0 som muligt. Når man kigger på residualværdier, så benytter man sig af kvadrede residualer og ikke den almindelige residualer. Dette skyldes, at ved almindelig residualer, så har residualværdier enten positive eller negative tegn, som vist på billedet til venstre i figur 11.

Figur 11 viser forskellen på "almindelige" og kvadrerede residualværdier.

Side 22

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

22

Her kan en ret linje godt have en residualværdi på omkring 0, selvom punkterne ligger langt væk fra linjen. Det skyldes, at selvom punkterne ligger langt væk fra linjen og på hver sin side, så bliver de henholdsvis negative og positive. Disse vil modvirke hinanden og selvom afvigelsen fra linjen er stor, så kan residualværdien blive nær 0, da værdierne kan ophæve hinanden. Hvis man derimod kvadrer alle værdierne, så vil de ikke ophæve hinanden, men blot ligges til hinanden, og man får derved ikke en misvisende residualværdi. Formlen for dette er:

         1
           𝑛         2
𝑣𝑎𝑟(𝑥) =  ∑ (  𝑥 − 𝑥̅ ) , hvilket kaldes variansen, derefter beregner man standartafvigelsen
           𝑖=1  𝑖
         𝑛

ved, at tage kvadratroden af variansen: 𝜎 ( 𝑥) = √ 𝑣𝑎𝑟 ( 𝑥). Dette giver residualværdien, som

beskriver, i hvilken grad vores punkter ligger fra linjen. [36]

Perspektiverne i overførsel af gener

Diskussion

I dette afsnit vil de forskellige perspektivere i overførsel af gener med hensyn til antioxidanter og forsvarsstoffer, blive diskuteret.

Som baggrund for dette er der blevet fokuseret på 3 af de store områder indenfor denne debat:

- Konsekvenserne for miljøet

- Konsekvenserne for menneskene

- Konsekvenserne for økonomien

Når det kommer til konsekvenserne for miljøet, hvis man lavede superplanter som enten have et højt indhold af forsvarsstoffer eller antioxidanter, så er der både fordele og ulemper. Fordelen ved, at lave en plante med et højt indhold af forsvarsstoffer vil være, at man kunne slippe for, at bruge lige så mange sprøjtemidler, da planterne langt bedre ville kunne forsvare sig imod angribende bakterier, parasitter og insekter. Dette vil aflaste vores miljø enormt, da sprøjtemidlerne f.eks. bliver skyllet ned i grundvandet. [37]

Der er dog også dem der siger, at lave sådan en plante vil være dårligt for miljøet, da generne kan sprede sig til andre planter, som man ikke ønsker får disse gener. Hvis dette sker, vil der være mulighed for, at planter som før var harmløse pga. de blev nedkæmpet af naturen pludselig kunne brede sig fordi de nu er i stand til, at

36

Knud Erik Nielse m.fl., Matematik AB1, 2007

37

http://www.vandigrunden.dk/infosider/forurening-og-pesticider

Side 23

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

23 modstå angreb fra parasitter, bakterier og insekter. Planterne vil på denne måde, kunne klare sig bedre uden vores hjælp i form af sprøjtemidler mm.

Hvis man derimod sænkede eller helt fjernede disse forsvarsstoffer, så ville de være udsatte overfor angreb af parasitter, bakterier og insekter. Man er i gang med, at forske i kassavaplanten som er en af de vigtigste kilder til mad i Afrika. Kassava har normalt et højt indhold af cyanogene glukosider, hvilket er et problem for befolkningen i Afrika som primært lever af denne plante. Kassavaplanten har et højt indhold af kulhydrater og er tørketolerant, hvilket gør den ideel, at dyrke i varme og tørre områder. Kassava kan dyrkes på tørre og eroderede jorde og med et lavt ressourceinput. [38] Da den dog er så giftig som den midlertidigt er, så kræver det dog meget forarbejde, at få afgiftet denne plante. Det tager mange dage, at afgifte kassavaen før den er i stand til, at blive spist uden, at give forgiftning [39]. Der bliver årligt udledt mellem 30.000 og

                                                                      37
100.000 ton af det giftige stof hydrogencyanid (HCN) til vandløb, søer og atmosfæren. Derfor er

man begyndt, at forske i en genmodificeret kassavaplante som ikke indeholder cyanogene glukosider, hvilket vil spare miljøet for de enorme mængder gift, der årligt bliver udledt. Der er dog visse ulemper ved, at lave sådan en plante. Da cyanogene glukosider er kassavaplantens forsvar, vil det kunne forestilles, at når dette forsvar fjernes, vil andre organismer angribe planten, hvilket vil betyde, at planten er chanceløs medmindre den får hjælp.

Hvis man fremstillede en genmodificeret planter, som havde et højt indhold af antioxidanter og vitaminer, så vil det ikke skade planten. Det kan dog forstilles, at den ligesom med stigningen i forsvarsstofferne ville kunne udkonkurrere andre planter, fordi den nærmest ikke vil blive udsat for oxiderende effekter.

Når det kommer til, hvilke konsekvenser der vil være for os mennesker hvis man gav planterne evnen til, at producerer færre eller flere naturstoffer, så må en af fordelen være, at man sparer ressourcer på, at skulle fjerne skadelige stoffer fra vores afgrøder. Her vil kassavaplanten igen være et godt eksempel. Når man fjerner eller knock-out’er genet for cyanogene glukosider i kassavaplanten, så vil befolkningen i udviklingslandene, kunne spise denne plante uden, at skulle igennem afgiftningsprocessen og der ville ikke længere gå så mange dage, før planten kan spises.

38

http://www.biokemi.org/biozoom/issues/525/articles/2399

39

http://www.bioethics.kvl.dk/tekster/khmjcs.htm

Side 24

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

24

Ulempen er dog, at landmanden nu skal sørge for, at der ikke sker noget med planten som f.eks., at den ikke bliver angrebet af parasitter, bakterier eller insekter.

Hvis man derimod øger forsvarsstofferne i planten, så vil ressourcerne for vedligeholdelserne af planten bliver mindre, men man vil dog være nødt til, at bruge flere ressourcer på, at afgifte dem igen for, at kunne spise dem. For når planterne får et højre indhold af forsvarsstoffer, i form af giftige forbindelser, så vil de også skulle igennem en længere proces for at fjerne disse igen, hvilket også vil være ressourcekrævende.

Hvis man forøger indholdet af antioxidanter og vitaminer i planterne, så vil det gavne os mennesker, da det vil betyde, at man ved, at spise den samme mængde eller mindre af frugt og grønt, vil kunne få langt flere sunde stoffer ind gennem kosten. Planterne med et øget indhold af antioxidanter og vitaminer vil på længere sigt kunne spare samfundet for en masse udgifter, da stofferne har en positiv indvirkning på helbredet. [40]

Hvilket betyder, at i stedet for, at ligge syge og være fraværene på arbejdsmarkedet, så vil folk kunne være på arbejde og hjælpe samfundet.

Det stik modsatte vil ske, hvis man nedsatte mængderne af antioxidanter. For det første vil folk ikke købe produkterne, da de indeholder mindre sunde stoffer end de konventionelt dyrkede planter. For det andet vil folk også have en tendens til, at blive mere syge, da de ville få mindre af de gavnlige stoffer, hvilket vil medfører en oxidation af cellerne i kroppen, da der ikke er nok antioxidanter til, at beskytte mod denne effekt.

Alt dette kræver dog, at det økonomisk kan betale sig. Hvis man ved hjælp af genmodificering kan ændre på generne, så udbyttet af en tomat- eller en kartoffelplante stiger med 10 %, så vil denne stigning i afkast betyde en tilsvarende stigning i profit for landmændene.

Det kræver dog, at folk er villige til, at købe genmodificeret mad. Der er ikke mange der gider, at forske på dette område, hvis ikke det giver økonomisk profit.

Vi har i Europa en relativ stram lovgivning omkring GMO og vores holdning til det, hjælper ikke ligefrem. En undersøgelse viser, at det godt og vel er 67 % procent af den danske befolkning, der er imod GMO [41]. Hvis de store firmaer ved, at folk ikke vil købe deres varer, så vil de heller ikke bruge penge på de genmodificerede ingredienser, der skal bruges. Dette betyder, at landmændene ikke kan få afsat deres varer, og de dermed ikke tjener nogle penge. Dertil kommer

40

http://www.meraadet.dk/gfx/uploads/rapporter_pdf/7193_antioxidanter.pdf p. 103

41

http://www.foodculture.dk/~/media/foodculture/2007/25/FoodCulture2507.ashx

Side 25

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

25 det også, at de ikke kan gemme frø fra sidste sæsons planter til næste sæson. De skal købe et nyt parti frø til hver ny såning, hvilket mange mener også er med til, at gøre det ekstra dyrt, at dyrke GMO’er. Det kan måske ses i forhold til, at man kun ønsker frø på markederne, som stadig har det samme genom som man oprindeligt gav dem. Hvis man blot beholdte frø fra de gamle planter, så ville man ikke kunne være sikre på, om der var sket en mutation i genomet, hvilket ville give dem nogle andre egenskaber. Man vil ikke tage denne risiko, da man ikke ved, hvad resultatet ville være ved en mutation hos genmodificerede planter.

Vurdering

I denne debat om GMO er der mange perspektiver, der skal tages hensyn til. Når man laver en genmodificeret plante, skal man ikke kun tænke på, hvilke fordele der er ved at ændre på plantens genom, men man skal i lige så høj grad tænke på, hvilke ulemper der hører med. I tilfældet med kassavaplanten er fordelene helt klare, mindre forurening og bedre mad, men det skal holdes op imod et øget ressource-input og i værste fald et mindre udbytte og så er man jo lige vidt.

Derfor skal ulemperne vejes op af fordelen og det gælder inde for alle tre kriterier.

Hvis ulemperne er større end fordelene ved bare ét af kriterierne, så vil det ikke være forsvarligt, at dyrke GMO. Der skal dog stadig forskes meget i genmodificerede afgrøder og virkningen af naturstofferne som planterne indeholder, samt hvordan en stigning eller en reduktion i de forskellige stoffer vil have af effekter på planten.

Konklusion

Ud fra mit arbejde med naturstoffer og særligt de to stofgrupper; antioxidanter og fytokemikalier, kan det konkluderes, at disse stoffer spiller en enorm rolle for planten. Uden dem, ville planten ikke kunne forhindre den yderst skadelige oxidation af dens celle, hvilket i sidste ende vil ende med celledød. Planten ville heller ikke kunne klare sig uden fytokemikalierne, som fungerer som plantens forsvar, når den er under angreb af fremmede organismer. Til trods for, at der er blevet fokuseret mest på fytokemikalier og antioxidanter, så har det også vist sig, at planten

Side 26

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

26 kan anvende de skadelige oxidanter til sit forsvar. Ved at dræbe sine egne celler vha. oxidation, forhindrer planten parasitter i at overtage plantens celler, hvilket vil dræbe parasitten, da den så ikke har nogen vært.

Evnen til at overføre gener mellem planter, har vist sig at være utrolig magtfuld, da der på næsten ingen tid kan laves nye planter med specifikke egenskaber. Om man succesfuldt har fået transformeret gener over i den nye plante, kan man undersøge ved at udfører en PCR på planten. Ved hjælp af PCR og en gelelektroforese kan man fastslå, om generne er blevet indsat i den nye plantes genom. Hvorvidt genet bliver udtrykt og i hvilket omfang, kan man undersøge ved at udføre en real-time PCR (qPCR) på plantens DNA. Derefter kan man beregne forskellen i genets udtrykkelse i henholdsvis den transgene plante og den originale plante. Ved hjælp af matematiske modeller og opstillinger kan det konkluderes, at udviklingen for mængden af DNA ved en PCR, fulgte en logistisk model. Dette er imod forventningerne om en ekspotentiel model, da der teoretisk set sker en fordobling af mængde af DNA ved hver cyklus.

Hvorvidt overførslen af gener mellem planter er godt eller dårligt er svært at svare på. Ud fra diskussionen er det blevet konkluderet, at der er mange forhold, der skal tages hensyn til ved gentransformation. Der skal blandt andet tænkes på, hvordan den nye plante vil påvirke naturen omkring sig, hvad den vil have af indvirkning på os mennesker, og hvordan miljøet vil blive påvirket. Det er derfor svært at komme frem til et endeligt svar på, hvorvidt gentransformation af planter er godt eller dårligt.

Bilag

Bilag 1:

Cyklus nr.

Wt m. Actin Wt m. Actin Wt m. C7 / Wt m. C7 / Wt m. C8 / Wt m. C8 / 3x m. Actin
/ 1 / 2 3 4 5 6 / 7

1 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

2 0, 0, 0, 0,5013552 0, 0, 0,

3 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

4 0, 0, 0,485006 0, 0, 0, 0,

5 0, 0,497643 0, 0, 0, 0, 0,

6 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

Side 27

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

27

7 0, 0, 0,5009263 0, 0, 0, 0,

8 0, 0, 0, 0, 0, 0,5164103 0,

9 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

10 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

11 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

12 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

13 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

14 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,6008889

15 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

16 0, 0,6051348 0, 0, 0, 0, 0,

17 | 0,5933398 | 0, | 0, | 0, | 0, | 0, | 0,

18 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,6984672

19 0, 0, 0, 0, 0,5830707 0, 0,7355605

20 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

21 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,

22 0, 0,9483143 0, 0, 0, 0, 0,

23 1, 1, 0, 0, 0, 0, 1,

24 1, 1, 0, 0, 0, 0, 1,

25 2, 2, 0, 0, 0, 1, 1,

26 3, 3, 0, 0, 1, 1, 2,

27 | 4,7866704 | 4, | 0, | 0, | 1, | 2, | 3,

28 6, 6,409968 0, 0, 2, 2, 4,

29 7, 7, 0, 0, 2, 3,8809338 6,

30 9, 9, 1, 0,9651535 3, 5, 8,331541

31 10,4543542 10,6505734 1, 1, 4, 6, 10,0498595

32 | 11,449779 | 11,6554697 | 2, | 1, | 6, | 7, | 11,4869626

33 12,2700702 12,4705754 3, 2, 7, 8, 12,6118868

34 12,9531294 13,1492143 4, 3, 7, 9, 13,5071453

35 13,4915185 13,6843337 5, 5, 8, 10,0715822 14,2013582

36 13,895265 14,0922347 7, 6, 9, 10,770776 14,7271841

37 14,1586962 14,35931 7, 7, 10,154023 11,3336176 15,0738573

38 14,3423204 14,5017275 8, 8, 10,6921448 11,8553137 15,2548681

39 14,5399181 14,6813408 9, 9, 11,262755 12,3969009 15,4812683

40 14,7375159 14,860954 9,5395639 10,3589106 11,8333652 12,9384881 15,7076686

Cyklus nr. 3x m. 3x m. C7 / 3x m. C7 / 3x m. C8 / 3x m. C8 /
Actin / 8 9 10 11 12

1 0, 0, 0, 0, 0,

2 0, 0, 0, 0, 0,

3 0, 0, 0, 0, 0,

4 0, 0, 0, 0, 0,

5 0, 0, 0, 0, 0,

6 0, 0, 0, 0, 0,

7 0, 0,6139142 0, 0,5128003 0,526746

8 0, 0, 0, 0, 0,

9 0,5467063 0, 0, 0, 0,

10 0, 0, 0, 0, 0,

11 0, 0, 0, 0, 0,

Side 28

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

28

12 0, 0, 0, 0, 0,

13 0, 0,6773832 0, 0, 0,

14 0, 0, 0, 0, 0,

15 0, 0, 0, 0, 0,

16 0, 0, 0, 0, 0,

17 0, 1,0298326 0, 0, 0,

18 0, 1, 1, 0, 0,582495

19 0, 1, 1, 0, 0,

20 0, 2,6891527 2, 0, 0,5917594

21 0, 3,8633291 3, 0, 0,

22 0, 5, 4, 0, 0,

23 0, 6, 6, 0, 0,64993

24 1, 8, 8,0490841 0, 0,

25 1, 9, 9, 0,6529192 0,

26 2, 10,6144886 10,4418353 0, 0,

27 3, 11,4130832 11,3050656 0, 1,

28 4, 12,0984509 12,0150185 0, 1,

29 6, 12,6616653 12,5784821 0,8610884 1,

30 7, 13,1377468 13,074322 1, 2,

31 9, 13,5719659 13,5183425 1,2149645 2,

32 10,5238616 13,8972496 13,8898572 1, 3,

33 11,4496434 14,2043863 14,1789067 1, 4,

34 12,2386802 14,443794 14,4215196 2, 5,

35 12,837689 14,6744473 14,631742 3, 6,

36 13,318984 14,8518163 14,8117621 3, 7,

37 13,6293638 14,9633534 14,9440614 4, 8,1420786

38 13,8325435 15,034361 14,989573 4,9303993 8,8392594

39 14,0697789 15,1638104 15,0769223 5, 9,

40 14,3070143 15,2932599 15,1642716 6, 10,2650672

Bilag 1 viser resultaterne for mit qPCR-forsøg, tallene ud for cyklus-numrene er hvor stor fluorescensen er .

Litteraturliste

Websider:

Ascorbic acid. (15. December 2010). Hentede 17. December 2010 fra Wikipedia:

http://en.wikipedia.org/wiki/Ascorbic_acid

Ayers, A. (9. Marts 2010). Phytoalexins Are Natural Plant Antibiotics. Hentede 28. November 2010

fra Suite 101: http://www.suite101.com/content/phytoalexins-are-natural-plant-antibiotics-

a211410

Side 29

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

29

Bach, I. C. (22. Januar 2010). Det Biovidenskabelige Fakultet. Hentede 20. November 2010 fra Planteforskning.dk:

http://www.planteforskning.dk/profiler/koebenhavns_universitet/ku_life/barbara_halkier

Bak, S., David, B. C., Girnth-Diamba, C., Haldrup, A., Preben, B. H., Birger, L. M., et al. (2004). Tjek på Biotek. Frederiksberg: Den kgl. Veterinær- og Lanhohøjskole.

Barbara, A. H., Fenger, J., & Østergaard, K. (22. April 2010). Terpener. Hentede 26. November 2010 fra Den Store Danske:

http://www.denstoredanske.dk/It,_teknik_og_naturvidenskab/Kemi/Organiske_naturstoffer/terp

ener

Biokemisk Forening. (Ikke opgivet. Januar 2009). Fattigmandskost – forbedring af kassava’s ernæringsmæssige værdi. Hentede 14. December 2010 fra Biokemisk Forening:

http://www.biokemi.org/biozoom/issues/525/articles/2399

Birger, L. M. (20. Januar 2009). Forædling af planter med bedre sygdomsresistens og større indhold af sundhedsfremmende naturstoffer. Hentede 2. December 2010 fra LandbrugsInfo:

http://www.landbrugsinfo.dk/Planteavl/Plantevaern/Sider/PLK09_res_97_1_B_L_Moeller.pdf

Birger, L. M. (1. Februar 2009). Plantehindholdsstoffer. Hentede 9. December 2010 fra Den Store Danske:

http://www.denstoredanske.dk/Natur_og_miljø/Botanik/Plantefysiologi/planteindholdsstoffer

Catechin. (7. December 2010). Hentede 8. December 2010 fra Wikipedia:

http://en.wikipedia.org/wiki/Catechin

Catherine, A. R.-E., Nicholas, J. M., & Paganga, G. (23. Oktober 1995). Structure - Antioxidant Activity Relationsships Of Flavonoids and Phenolic Acids. Hentede 11. December 2010 fra Texas A&M Agriculture:

http://nfscfaculty.tamu.edu/talcott/Food%20Chem%20605/Class%20Papers%202010/Review-

Structure%20AOX.pdf

Condon, J., Sivakuman, G., Hubstenberger, J., Dolan, M., Sobolev, V., & Medina-Bolivar, F. (12.

Januar 2010). Induced Biosynthesis of resveratrol and the prenylated stilbenoids arachidan-1 and arachidan-3 in hairy root cultures of peanut: effects of culture medium and growth stage. Hentede

15. December 2010 fra United States Departmen of Agriculture, Agriculture Research Service:

http://www.ars.usda.gov/research/publications/publications.htm?seq_no_115=256900

Dhurrin. (Ikke opgivet. Ikke opgivet Ikke opgivet). Hentede 15. December 2010 fra R&D Chenicals:

http://www.rdchemicals.com/chemicals.php?mode=details&mol_id=7700

Dicke, M., & Hilker, M. (1. November 2001). Induced plant defences: from molecular biology to evolutionary ecology. Hentede 13. December 2010 fra Elsevier:

Side 30

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

30

http://shop.elsevier.de/elsevier/journals/files/baecol/top10/Induced_plant_defences_From_mole

cular_biology_to_evolutionary_ecology.pdf

Dixon, R. A. (14. Juni 2001). Hentede 15. December 2010 fra Natural products and plant disease resistance:

http://faculty.ksu.edu.sa/shoeib/Lectures/Mic%20522/Students%20Activities/Plant%20Pathogeni
c%20Bacteria/natural%20products.pdf

E., H. S., & L., L. C. (2. Juni 1991). Concentration of the Phytoalexin Resveratol in Wine. Hentede 14.

December 2010 fra American Journal of Enology and Viticulture:

http://www.ajevonline.org/cgi/content/abstract/43/1/49

Estep, P. (2. Juni 2000). Long PCR Reagents and Guidelines. Hentede 10. December 2010 fra Harvard Molecular Technology Group & Lipper Center for Computational Genetics:

http://arep.med.harvard.edu/labgc/estep/longPCR_protocol.html

Garry, R. B., & Beth, A. J. (12. Juni 1995). Catalytic Metals, Ascorbate and Free Radicals:

Combinations to Avoid. Hentede 10. December 2010 fra University of Iowa Health Care:

http://www.healthcare.uiowa.edu/corefacilities/esr/publications/1996/pdf/RadRes-1996-145-

532-Buettner-Acs.pdf

George, H. (18. Juni 2010). Cyanide production for plant defense agaisnt herbivores. Hentede 15.

December 2010 fra Suite 1010: http://www.suite101.com/content/cyanide-production-for-plant-

defense-against-herbivores-a251023

Giftig er bedst. (29. November 2010). Hentede 3. December 2010 fra Det Biovidenskabelige

Fakultet: http://www.life.ku.dk/forskning/online_artikler/artikler/giftigterbedst.aspx

Gyldendal. (1. Februar 2009). Naturstoffer. Hentede 8. December 2010 fra Den Store Danske, Gyldendals åbne encyklopædi:

http://www.denstoredanske.dk/It,_teknik_og_naturvidenskab/Kemi/Fysisk_kemi_og_fysisk_elekt
rokemi/naturstoffer

H., D. V., J., W. M., J., A. B., & E., E. F. (Ikke opgivet. September 1994). Two Classes of Plant Antibiotics: Phytoalexins versus "Phytoanticipins". Hentede 25. November 2010 fra American

Society of Plant Biologists: http://www.plantcell.org/cgi/reprint/6/9/1191.pdf

Induced Systemic Resistance (ISR) Against Pathogens in the Context of Induced Plant Defences. (18.

Januar 2002). Hentede 1. December 2010 fra Oxford Journals:

http://aob.oxfordjournals.org/content/89/5/503.full

Jensen, M. B. (13. Oktober 2009). Planteforsker til ing.dk-læsere: Angsten for GMO skyldes

skræmmekampanger. Hentede 10. December 2010 fra Ingeniøren: http://ing.dk/artikel/102946-

planteforsker-til-ingdk-laesere-angsten-for-gmo-skyldes-skraemmekampagner

Side 31

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

31

Kathrine, H. M., & Jens, C. S. (29. Februar 2000). Referat af workshoppen "Transgene afgrøder i udviklingslande". Hentede 12. December 2010 fra Center for Bioetik og Risikovurdering:

http://www.bioethics.kvl.dk/tekster/khmjcs.htm

Landbrugsrådet. (10. September 2007). FoodCulture. Hentede 11. December 2010 fra

Landbrugsrådet:

http://www.foodculture.dk/~/media/foodculture/2007/25/FoodCulture2507.ashx

LIFE. (6. December 2010). Forberedelsesmateriale til SRP på LIFE - Naturstoffer. Hentede 8.

December 2010 fra Det Biovidenskabelige Fakultet:

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/EfterOevelsen48/naturstoffer.ashx

LIFE. (6. December 2010). Forberedelsesmateriale til SRP på LIFE - PCR og Real-Time PCR. Hentede

12. December 2010 fra LIFE:

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/EfterOevelsen48/PCR_og_RT%20PCR_sr

p.ashx

LIFE. (6. December 2010). Forberedelsesmateriale til SRP på LIFE - Transformation. Hentede 9.

December 2010 fra LIFE:

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/EfterOevelsen48/transformation_srp.as

hx

LIFE. (6. December 2010). Forberedelsesmateriale til SRP på LIFE - Øvelsesvejledning. Hentede 9.

December 2010 fra LIFE:

http://www.life.ku.dk/~/media/Skoletjeneste/SRP/Biotek/Ovelsesvejledning_2010.ashx

Mario, E. B., M., A. V., Tapia, R., Leighton, F., & Gonzales, L. (18. Juni 2001). Study Of The Iron Catechin Complexes In Dimethyl Sulphoxide. Redox Chemistry ndnteraction With Superoxide Radical Anion In This Medium. Hentede 14. December 2010 fra Scientific Electronic Library Online:

http://www.scielo.cl/scielo.php?pid=S00011&script=sci_arttext

Marja, P. K., Anu, P. H., Hikki, J. V., Rauha, J.-P., Pihlaja, K., Tytti, S. K., et al. (24. september 1999).

Antioxidant Activity of Plant Extracts Containing Phenolic Compounds. Hentede 28. November

2010 fra Oregon Raspberry & Blackberry Commission : http://oregon-
berries.com/common/docs/ARTICLE40.pdf

Max Animations. (Ikke opgivet. Ikke opgivet 2010). cDNA Animation. Hentede 12. December 2010

fra Max Animations: http://www.maxanim.com/genetics/cDNA/cDNA.htm

Motions- og Ernæringsrådet. (Ikke opgivet. Ikke opgivet 2006). Antioxidanter og Helbred. Hentede

11. December 2010 fra Motion- og Ernæringsrådet:

http://www.meraadet.dk/gfx/uploads/rapporter_pdf/7193_antioxidanter.pdf

Side 32

Bioteknologi Studieretningsprojekt

& Matematik 21. december 2010

32

Phillips, T. (Ikke opgivet. Ikke opgivet Ikke opgivet). How PCR works. Hentede 9. December 2010

fra About.com: http://biotech.about.com/od/pcr/a/PCRtheory.htm

Rice-Evans, A. C., Nicholas, J. M., & Paganga, G. (7. November 1995). Structure - Antioxidant activity relationships of flavonoids and phenolic acid. Hentede 11. December 2010 fra Texas A&M Agriculture:

http://nfscfaculty.tamu.edu/talcott/Food%20Chem%20605/Class%20Papers%202010/Review-

Structure%20AOX.pdf

Vand i grunden. (Ikke opgivet. Ikke opgivet Ikke opgivet). Fakta om sprøjtemidler. Hentede 12.

December 2010 fra Vand i grunden: http://www.vandigrunden.dk/infosider/forurening-og-

pesticider

Bøger:

Leland, J. C., Kirakosyan, A., Peter, B. K., Sara, L. W., James, A. D., & Harry, L. B. (2006). Natural Products from Plant. Boca Raton: Taylor & Francis Group.

FØTEK. (2002). Naturens Verden. København K: FØTEK.

The American Phytopathological Society. (1999). Induced Plant Defences Against Pathogens and Herbivores. Sankt Paul, Minnesota: The American Phytopathological Society.

Line, U. J. (1980). Hypersensitivitet, fytoalexiner og Sygdomsresistens. København: Aarhus Universitet - Det jordbrugsvidenskabelige Fakultet.

Marianne, L. D., Gitte, G. L., Merete, M. N., & Jo, B. P. (2001). Sammenligning af assays for antioxidativ effekt. Frederiksberg: Den Kongelige- Veterinær- og Lanbohøjskole.

Knud, E. N., & Fogh, E. (2007). Matematik AB1. Silkeborg: HAX.