SRP om HPLC og Kromatografi i Matematik A og Kemi A

Side 1

HPLC og Kromatografi

SRP Matematik og Kemi

Marselisborg gymnasium

Julie

Side 2

Side 2 af 30

Indholdsfortegnelse

Abstract ............................................................................................................................................................. 3 Indledning .......................................................................................................................................................... 3 Kromatografi ...................................................................................................................................................... 3 HPLC ................................................................................................................................................................... 5

Eluenten/den mobile fase ................................................................................................................................. 5

Pumpe ................................................................................................................................................................ 7 Ventil og Injektion ............................................................................................................................................. 8

Kolonne / den stationære fase .......................................................................................................................... 8

Detekter ........................................................................................................................................................... 14 Spektrofotometri .............................................................................................................................................................. 14 Refraktometri ................................................................................................................................................................... 16 Databehandling ............................................................................................................................................... 17 Arealbestemmelse: ........................................................................................................................................................... 18 Mindste kvadraters metode: ............................................................................................................................................ 20 Konklusion ....................................................................................................................................................... 25 Litteraturliste: .................................................................................................................................................. 26 Hjemmesider .................................................................................................................................................................... 26 Bøger ................................................................................................................................................................................. 27 Bilag 1 .............................................................................................................................................................. 28 Bilag 2 .............................................................................................................................................................. 28 Bilag 3 ............................................................................................................................................................. 28 Bilag 4 .............................................................................................................................................................. 28 Bilag 5 .............................................................................................................................................................. 28 Bilag 6 .............................................................................................................................................................. 28 Bilag 7 .............................................................................................................................................................. 29 Bilag 8 .............................................................................................................................................................. 29 Bilag 9 .............................................................................................................................................................. 29 Bilag 10 ............................................................................................................................................................ 29

Side 3

Side 3 af 30

Abstract

Indledning

Kromatografi har en lang historisk udvikling bag sig. Det startede omkring 1900, hvor den russiske botaniker

Michael Tsvet^{1}, beskrev væskekromatografi. Han havde anvendt metoden til at separere farvepigmenterne

i plantepigmenter. Gennembruddet for væskekromatografi og gaskromatografi fandt dog først sted i 1940, da AJP Martins og RLM Synges beskrev metoderne. I mange år lå udviklingen på GC apparatet og først efter to årtier kom HPLC apparatet på tale. Disse metoder er blevet nogle af de vigtigste analysemetoder i kemisk

                                    2
og biokemisk udvikling og forskningsarbejde.

Jeg vil i denne opgave udarbejde en forståelse for kromatografi med HPLC apparatet som hovedemne. Via et forsøg ”Koffein i kaffe og te” lavet på Århus Universitet den belyses principperne og egen-skaberne for molekylerne i forhold til kromatografi. Og desuden foretages databehandling med forsøget som eksempel. Jeg vil løbende nævne forsøget og derfor er forsøgsvejledningen lagt til som bilag 1.

Problemformuleringen:

Du skal redegøre for sammenhængen mellem molekylernes struktur og egenskaber samt kromatografi ge-nerelt. Med udgangspunkt i øvelsen ”koffein i kaffe” ønskes endvidere en redegørelse for principperne bag HPLC herunder opbygningen af et HPLC apparat. Du skal komme ind på forskellige typer af detektion samt vise hvorledes databehandling udføres i forbindelse med øvelsen. Du skal inddrage matematisk analyse i forbindelsen med databehandlingen, herunder mindste kvadraters metode.

Kromatografi

Chromatografi er en sammensætning af to græske ord, chroma = farve og graphien = at beskrive.^{3}

Kromatografi er en analyse metode til at adskille komponenterne i en prøve. Princippet går ud på at en mobilfase og en prøve reagerer med en stationær fase, pga. prøve molekylers affinitet til den mobile eller stationære fase kan en separation af komponenterne finde sted. Dette kan forgå ved væske-faststof kro-matografi, ionbytnings kromatografi, gas-faststof kromatografi og størrelseskromatografi.,

1

http://www.denstoredanske.dk/It%2c_teknik_og_naturvidenskab/Kemi/Analytisk_kemi/kromatografi

2

Anvendt væske chromatografi side 11 og

http://www.denstoredanske.dk/It%2c_teknik_og_naturvidenskab/Kemi/Analytisk_kemi/kromatografi

3

Anvendt væske chromatografi side 11

Side 4

Side 4 af 30

Jeg vil fremstille ion kromatografering og størrelses kromatografering i afsnittet om kolonnen, da det indbe-fatter molekylernes egenskaber og struktur. Væske-faststof kromatografering fremstilles under HPLC gene-relt. I dette afsnit forklares desuden om andre former for kromatografi.

Tyndlagskromatografi (TLC) herunder papirskromatografi foregår ved den at en mobilefase trænger op igennem den stationære fase. Dette var den første form for kromatografi, der blev opfundet, og har siden været grundstenen til andre for former kromatografi. Den stationære fase er i denne form for kromatografi en plade af glas, aluminium eller plastik. Den ene side af pladen er coatet med et tyndt lag porøst stof, ofte silica, evt. med forskellige bundne funktionelle grupper. I bunden af pladen laves en startlinje, hvor på prø-verne eller rene opløsninger placeres i form af en enkelt dråbe, når disse er tørre, stilles TLC-pladen ned i den mobilefase, så det nederste af pladen er dækket, det er dog vigtigt prøverne ikke er dækket. Analysen forgår i et TLC-kar (glasbeholder med låg), låget er på under kromatograferingen så det forgår i mættet damp fra eluenten. Det er stoffernes affinitet til enten den stationære fase eller den mobilefase, der gør at prøverne rykker sig enten langsomt eller hurtig op ad pladen sammen med den mobilefase, som den porø-se overflade suger opad. Man vælger den mobilefase og den stationæres fases polaritet ud fra prøven, man skal undersøge. Polaritets bestemmelse er beskrevet under kolonnen. Idet den mobilefase når kanten tages pladen op og man kan se om prøven indeholder nogle af de rene stoffer, som prøven indeholder. omformu-leres En prøve er adskilt i forskellige pletter alt efter indholdet. For med sikkerhed at kunne sige ens prøve indeholder et stof, er det nødvendigt at lave flere kromatogrammer med andre mobile og stationære faser.

Hvis stofferne stadig er på samme linje kan man slå fast at man har fundet et stof i sin prøve.^{4} Altså TLC

bruges til kvalitative undersøgelser, altså identifikation af ukendte komponenter.

Det næste apparat der blev udviklet er GC apparatet, der kan bruges til både kvalitative og kvantitative analyser. Egentlig foregår processen med samme princip, med en stationærfase og en mobilfase, forskellen er at den mobilefase her er en gas, typisk helium nitrogen eller brint. Den stationære fase er et fast stof i en kolonne. I kolonnen er der et porøst materiale. Også her er det polariteten af prøven, den mobile- og den stationære fases, der er afgørende. For at dette kan lykkes kræves det at prøven man undersøger kan komme på gasform. Kolonnen er placeret i en ovn så temperaturen kan reguleres, på denne måde kan de

                              5
forskellige gasformer ?? kontrolleres.

4

BasisKemi A

5

Polartitet og detektoren beskrives senere i opgaven.

Side 5

Side 5 af 30

HPLC

HPLC står for High Performance Liquid Chromatography også på dansk kaldet højtydende væske kromato-grafi. HPLC er en analyseteknik, til at adskille komponenter i en prøve, og derefter identificerer stoffer og koncentrationer. Fordele ved HPLC er at analysen er hurtigere og den adskiller stofferne bedre end andre kromatografiske metoder. Arhhh nok ikke bedre en GC

Et HPLC apparat består af en pumpe, der pumper en eluent og en tilsat prøve hen til en udvalgt kolonne, derefter skilles de forskellige prøvekomponenter i kolonnen pga. polaritet, størrelses eller ionbytning. Dette resulterer i at de forskellige komponenter kommer igennem en detektor på forskellige tidspunkter, detek-toren sender sine informationer til en registrerende computer, der laver databehandlingen og resultaterne kommer ud i form af et kromatogram og er så klar til videre efterbehandling. Bilag 2, viser de forskellige apparatdele som vil blive gennemgået i nedenstående underpunkterne. Principperne i de forskellige dele i et HPLC apparatet gennemgås ligeledes, specielt eluenter, kolonner og detektorer. Som eksempel vil jeg anvende forsøget ”koffein i kaffe og te”.

Eluenten/den mobile fase

Før man går i gang med at anvende et HPLC apparat til et forsøg, skal man finde den korrekte eluent. Dette gøres efter man har valgt sin kolonne. Se under kolonne.

En eluent består af en sammensætning af solventer, der skal fungere som den mobilefase i det kromatogra-fiske system. Eluenten består ofte af en eller flere organiske opløsningsmidler. Eluenten bære prøven gen-nem apparatet. Før eluenten skylder igennem HPLC apparatet, opbevares eluenten typiske i en glasflaske, hvorfra den suges gennem et filter frem til pumpen. Filteret forhindre at evt. partikulære urenheder når frem til pumpe, hvor de kan sætte sig i kontraventilerne og hindre stabilt flow og tryk.

Der er nogle vigtige egenskaber ved en eluent man skal tage stilling til, før man kan vælge hvilken eluent

                                                                6
man vil anvende. Dette gælder både for eluenter til isokratisk og gradient HPLC

. De vigtige egenskaber er:

- Passende polaritet

- Viskositet

- UV cut-off^{7}

Det er vigtig at finde en passende polaritet, her skal man ud fra sin prøve tage stilling til hvilken type kroma-tografi man vil anvende. Det kan være man skal anvende omvendte fase kromatografi, hvor man skal an-vende en eluent, der er mere polær end den stationære fase eller normal fase kromatografi, hvor eluenten er mindre polær end den stationære fase. Det er derfor man først vælger kolonnen og derefter eluenten, så

6

Isokratiske og gradiente eluenter bliver beskrevet længere nede i afsnittet.

7

Apparat teknik side 368

Side 6

Side 6 af 30 man ved hvilken polaritet eluenten skal have. Historisk kom normalfase kromatografi først, og senere blev omvendt fase kromatografi taget i brug. Derfor udtrykkene normal- og omvendt-fase. I dag er omvendt fase kromatografi den langt mest udbredte. Det var også omvendt fase kromatografi vi bruget til vores forsøg.

Grunden til at polaritet har en vigtig rolle beskrives i kolonne afsnittet.

Angående viskositet tilstræbes der en lav viskositet i eluenten. Viskositeten påvirker trykket og jo hurtigere flowet er jo højere tryk, og ved høj viskositet er der et højt tryk imellem pumpen og kolonnen. Det tilsigtes derfor et lavt tryk, for ikke at stiller for høje krav til HPLC udstyret. Eluent flowet ligger i praxis omkring 1-2

mL/min^{8}. Trykket bør ikke overstige 20-25 mpa^{9}, og skal helst være under. 2-propanol er et godt eksempel

på et opløsningmiddel der ud fra sine polaritetsmæssinge egenskaber vil være en udmærket eluent, men

                                                  10
grundet sin høje viskositet er uegnet til brug i HPLC analyser.

Med UV cut-off menes der at inden for en begrænset bølgelængde interval, vil væsken gå fra at tillade lys-energi til at absorberer det hele. Dette er når bølgelængden bliver for lav, dog er det forskellige hvor dette interval ligger i forhold til eluentens egenskaber, men jo renere eluenten er jo længere kan man gå ned i bølgelængden. Et andet problem ved at måle ved lave bølgelængder er at et spektrofotometer ikke er lige så effektivt her, både lysenergien og fotocellen er ikke særlige følsomme her. Et godt eksempel på et opløs-ningsmiddel, der ud fra sine viskøse og polaritetsmæssige egenskaber vil være en god eluent er Acetone.

Men acetone har UV cut-off ved 330 nm, hvile gør den uegnet til HPLC-brug, hvor detektionen forgår ved

                 11
UV-spektrofotometri.

En anden vigtig faktor i valg og anvendelse af en eluent er den elutrope styrke, som er eluentens/den mobi-

le fases evne til at eluerer prøvekomponenterne. Elutrope styrke afhænger af eluentens polaritet. Det er vigtig at finde en passende elutrope styrke for at opnå at toppene adskilles inden for en rimelig tidsperiode, altså en kort retentionstid. For at undgå dette kan man optimere eluenten, altså ændre på blanding forhol-dene i eluenten.

Hvis den eluotrop styrke er for høj, vil toppene ligge for tæt, og det vil ikke være muligt at aflæse brugeligt data på sit kromatogram. Men er den eluotrop styrke for lav, vil det tage for lang tid for alle toppene at komme ud, og hvis nogle ikke når ud, vil disse kunne interferere på den næste kromatografering.

Der er forskellige måder at øge eller mindske den eluotrope styrke. Ved omvendt fasen gælder det at eluentens elueringstyrke er faldende med stigende polaritet. Dvs. at vand der er meget polært har en dårlig

8

Apparatteknik side 372

9

Apparatteknik side 372

10

Kan slåes op i bilag 3

11

Kan slåes op i bilag 3

Side 7

Side 7 af 30 eluerings effekt. Altså hvis eluerings styrken er for høj, kan den mindskes ved at øge vandmængden, og den kan modsat øges ved at øge indholdet af mindre polær eluenter (fx alkoholer)

Ved omvendt fasen er de mest anvendte opløsningsmidler; Vand, Metanol og Acetonitril.^{12} Ved normalfa-

sen er de mest anvendte eluent hexan eller heptan, her tilføjes lavere alkoholer for at gøre eluenten mere

polær, hvis dette er en nødvendighed.^{13}

Hvis man skal kromatograferer på en stofblanding med forskellige polariteter, kan det være umulige at finde en optimal eluent. Derfor kan man varierer eluentens sammensætning under forsøget, man ændrer altså den eluotrope styrke undervejs, dette kaldes en gradienteluering. Den mest normale proces, er hvor man anvender samme eluent under hele forsøget, det kaldes Isokratisk kromatografering.

I forsøget koffein i kaffe, anvendte vi en isokratisk eluent, en 50:50 blanding af vand og metanol. Både vand og Metanol er begge polær, metanol pga. OH-gruppen. Metanol har også upolære egenskaber i kraft af metylgruppen. Blandingsforholdet er valgt, fordi her har koffein en god retentionstid, og kommer ud efter

cirka 2 ,45 min. Koffein/prøven bliver båret med eluenten hen til kolonnen, koffein er til dels upolær og har

derfor affinitet overfor den upolære C18 kolonne. Forholdet i polaritet mellem, prøven(koffein), kolonnen og eluenten giver den ønskede retentionstid. Gøre eluenten mere upolær (feks 40:60 vand:metanol) for-mindskes rententionstiden, men det kan også give sammenfaldene toppe. Gøres eluenten mere polær(feks.

60:40 vand:metanol) giver det en længere retentionstid, dette gør at færre prøver kan analyseres.

Afgasning af eluenten er en nødvendighed da, luftbobler kan skabe forstyrrende signaler, ofte ved der dan-nes gasbobler i flowkuvetten. Der er forskellige former for for afgasning: Vakuum(herunder online dega-

                                      14
ning) , Ultralyd, Stripning med helium og Reflux

Altså skal der tages højde for polaritet, UV cut-off, visko-sitet, den elutrope styrke. Værdierne for en række opløsningsmidler kan ses bilag 3.

Pumpe

Den første del i HPLC apparatet er pumpen, der pumper eluenten ind i HPLC opstillingen. Her er det meget vigtig, at man har styr på trykket. Der er anvendt to former for pumper. En der holder konstant tryk og en der holder konstant flow. Dog er det mest konstant-flow pumperne, der er anvendes, da der er for mange bivirkninger med konstant-tryk pumperne. Den mest anvendte konstant flow pumpe er reciprocerede

stempelpumper. Det typiske analytiske arbejdsflow ligger oftest imellem 0,2 mL/min og 5,0 mL/min. Tryk-

ket stiger efter eluenten passerer pumpen. Dette sker pga. kolonnens modtryk. Oftest er trykket mellem 2 mPa og 20 mPa (megapaskal). Pumpens stempler består oftest af safir, og er lukket med en pakning bagtil.

12

Apparatteknik side 368

13

Side 16

14

Apparat teknik side ? ikke gået i dybden med pga. pladsmangel

Side 8

Side 8 af 30

Man skal dog her være opmærksom på der kan fremkomme brists pga. det høje tryk miljø. Der kan være både et og to stempelhoveder på stempelpumpen. Der er vigtig at holde trykvaritionerne på et minimum, da dette kan skabe en urolig basislinje og give ubrugelige kromotogrammer. Pumper med dobbelte stem-pler giver mindre pulsation, næsten alle HPLC pumper har dobbelte stempelhoveder. På hver side af pum-pehovedet sidder der kontraventiler. En kontraventil lader kun den passerende væske løbe en vej, der er en kugle oftest af safir inde i ventilen, der lukker eller åbner ventilen. Dette gør at væsken kun kan løbe en vej og derved, kan et højt arbejdstryk opbygges. Derfor har pumpen en pumpecyklus, stempelet føres lang-somt ned og lukker derved af for den øverste kontraventil og eluenten trykkes ud mod kolonnen, derefter hives stempelhovedet hurtigt tilbage og der åbnes for den anden kontra ventil, her suges eluenten ind i pumpehovedet fra et reservoir. Denne bevægelse hindrer trykket i at falde ret meget. Dog kan det stadig være nødvendig med en pulsationsdæmper efter pumpen. Dette kan være gummimembran, der opsuger noget af energien i trykket. Når stemplet trækker sig tilbage udvider pulsationsdæmperen og den opsugede energi leveres ud i systemet igen. Kontraventilerne er følsomme overfor partikulære urenheder, partikler forhindrer kuglen i at lukke af for væsken og resultatet bliver et ustabilt og lavt arbejdstryk. Derfor er det vigtigt at filtre både eluenten og prøven. Grunden til man anvender safir i både stemplet og i ventilerne er pga. dens hårdhed. På mohs’ skala er safir det andet hårdeste mineral. Stoffet er også kaldes korund(

AL_{2} O_{3}), dens absolutte hårdhed er på 400. Det hårdeste mineral er diamanten, hvis absolutte hårdhed er på
1600.^{15}

Ventil og Injektion

Efter pumpen skal prøven injiceres i eluentflowet. Dette gør man via en injektionsventil. Trykket er højt i

                               16
denne del af opstillingen (20-200 atm)

og her er en højtryksventil en nødvendighed. Med en sprøjte injice-rer man prøven i et loop, dette loop kan rumme en præcis volumen (i vores forsøg var det 20µl). Ventilen gør at loop’et kan fyldes ved atmosfæretryk, mens ventilen står i load stilling, dvs. at der ingen kontakt er med eluenten og trykket endnu. Herefter drejes ventilen håndtag til inject, herved drejes loop’et ind i eluentstrømme, der tager prøven med sig hen til kolonnen. Bemærk, man kan nu ikke injicere i loop’et, så hvis dette gøres ved en fejl påvirkes resultaterne ikke.

Kolonne / den stationære fase

Det er mange former for kolonner. Man skal vælge sin kolonne først og derefter skal man tage stilling til hvilken eluent man vil anvende.

15

16

Side 9

Side 9 af 30

En kolonne kan have mange forskellige længder, bestå af forskelligt materiale og have forskelligt rumfang.

En kolonne er oftest opbygget af et indvendig poleret rør af rustfri stål, eller indvendigt teflon eller glasbe-lagtestålrør. De essentielle dele af kolonnen er inlet og outlet fittings. Det er vigtigt påvirker til større dead-volumen. Deadvolumen bliver beskrevet senere. Et stort dead volumen kan medføre nedsættelse i effekti-viteten.

Pakkematerialet i en ideel kolonne består af lige store partikler og en ensartet pakning. Dette er kun muligt hvis kolonnematerialet har en lille variation på partikelstørrelsen. Dette vil også reducere sedimentations-

problemer^{17} og øge permeabiliteten.

Pakningen af kolonner forgår ved at pakkematerialet opslemmes i passende opløsningsmiddel. Denne op-slemning overføres til et pakkereservoir, som er sat ovenpå en HPLC kolonne. Materialet pakkes herefter ved højt tryk vha. en pumpe.

Fordi kolonner er dyre, kan det være fordelagtigt at bruge en forkolonne. Den er billigere, meget kortere og udskiftes jævnligt. Forkolonnen er af samme materiale som hovedkolonnen men med større partikler. Den deltager ikke i adskillelsen af prøvekomponenterne, men i stedet for opfanger den stoffer, der bindes irre-valibelt til kolonne materialet og på den måde skånes den dyrere hovedkolonne.

Som tidligere nævnt er det polariteten af kolonnen, der skiller komponenterne ad. Adskillelsen af kompo-nenterne i en prøve i væske-faststof kromatografi skyldes molekylernes forskellige polaritet indbyrdes og i forhold til den mobile og stationære fase. Som eksempel kan man tager omvendt fasen til at forklare polari-tetens vigtighed, her skal den mobilefase være mere polær end den stationære fase. Så ved omvendt fasen har man en eluent, der er polær og en kolonne der er upolær, så vil stofferne der i prøven der er upolære binde sig godt til kolonnen, og have en lang retentionstid. Hvorimod stofferne der er polære i prøven vil have større affinitet for den mobile fase, hvilket giver en hurtig retentionstid. Retentionstiden er tidsrum-met det tager en komponent om at komme fra injektionen til detektoren

Det der spiller en rolle for om molekyle er polært eller upolært er molekylets elektronegativitet. Eletrone-gativitet er en skala med atomers evne til at trække bindingselektronerne i en kovalentbinding til sig. skala-

en går fra 0,7 og til 4^{18}.

Man ved at flour er det mest elektronegative stof af alle stoffer. Man kan opstille en elektronegativitets-række: F > O > Cl, N > Br > C, H.

17

Sedimentering er den proces hvor molekyler i en opløsning sætter sig på en overflade og derved forlader den væske hvor i de er

opholdt.
18

Kendkemien 1 side 78

Side 10

Side 10 af 30

I en kovalent binding deles atomerne lige meget om elektroner, dette er hvis elektronegativitet forskellen er lille. Altså er der tale om upolære molekyler. Dette kan være lange kulstofkæder eller rene alifatiske C-kæder.

Et polært molekyle opstår hvis der er stor forskel i atomernes elektronegativitet. Jo større forskellen i elek-tronegativiteten er, jo mere trækker atomerne i bindingselektronerne. Elektronerne vil være forskudt mod atomet, der er mest elektronegativt. Dette skaber et molekyle med en dipol, der vil altid være polært. Der-for gælder det at alkoholer, syrer, estere og amider er polære molekyler.

Et typisk anvendt kolonnemateriale er Silica (Si), eller forskellige funktionelle grupper bundet til Silica. I forhold til om man arbejder med normal fase eller omvendt fase, skal silicaens overflade bearbejdes for-skelligt.

For normal fase gælder det at den mobile fase er mindre polær en den stationære fase. Derfor anvender man oftest umodificeret silicagel, altså man anvender den rene silica overflade. Silicagels overflade består

af ≡𝑆𝑖 − 𝑂𝐻^{19}.

Da OH-gruppen er et kraftigt polært molekyle, anvendes denne til normal fasen da det glæder at den stati-onære fase skulle være mest polær. Se bilag 3

Ved omvendt fasen skal den mobilefase være mere polær end den stationære fase. Derfor kan man ikke anvende umodificeret silicagel. Dette gøres ved at binde mere eller mindre upolære grupper til silicaen.

Dette sker via en kemisk reaktion, reaktionen sker imellem silicas overflade og den type gruppe man har valgt, og sker under dannelsen af:

𝑆𝑖− 𝑂 − 𝑆𝑖− 𝑅 , hvor radikalet kan være forskellige upolære grupper.

Kolonnen der er anvendt i koffein forsøget er en modificeret sillica kolonne. Radikalet er et C18 molekyle, det vil sige en lang kulstofkæde med 18 C-atomer. Dette gør kolonnen mere upolær. Se bilag 4

Efter C18 kæderne er bundet til silica, vil der være nogle ureagerede silanolgrupper mellem C18 kæderne.

Disse OH grupper kan deltage i kromatograferingen som ”sekundær aktivitet”. Den primær er hydrofob interaktion med C18 kæderne. OH gruppen kan lave polær interaktion og hvis pH er højt også ionisk inter-

                                                          -
aktion. Ved højt pH deprotoneres silanolgruppen, og findes altså som O

. denne sekundære aktivitet kan

nedsættes ved at ”endcappe” silanolgrupperne. Herved binde Si-(CH ) til silanolgruppen og hindre derved
                                                       3 3

den sekundære aktivitet. Se bilag 4. Kolonnen i koffein forsøget var endcapped (EC).

19

Side 11

Side 11 af 30

                                         20
Molekylet koffein(1,3,7-trimethylxanthiner)(billede ) er et alkaloid med en stofgruppe kaldet xanthiner.

Stoffet er upolært, da de eneste polære atomer i molekylet er de to dobbelt bunde O-atomer på den ene benzenring. Og på grund af hvor upolært stoffet er, vil det have en anden retentionstid end andre mere eller mindre upolær komponenter i prøven.

Silicagel anvendes pga. den kan fremstilles i små kontrollerbare størrelser. Og kan derved give den high performance som HPLC kan frem for andre væske-kromotografier. Kornstørrelsen er også vigtig, da de små korn giver en stor overflade. Kolonnematerialet skal være porøst , men hvis det bliver for porøst, altså med for mange porer kan det falde sammen under de høje tryk, der er i HPLC opstillingen. Det er derfor, som nævnt tidligere i afsnittet at en snæver størrelsesfordeling vigtig, så kolonnen ikke kollapser under tryk og gør der umuligt for væskegennemstrømning. Her er silica optimal.

Effektiviteten er kolonnes evne til at indstille ligevægt imellem den stationære og mobil fase. Der er tale om en koncentrationsligevægt, altså hvor god prøvens komponenter er til at fordele sig imellem den stati-onære og den mobilefase. Effektiviteten af dette betegnes som antallet af teoretiske bunde. antallet af teoretiske bunde er vigtig, da denne anvendes til at sammenligne kolonner, og se kolonnens kvalitet.

Formelen til at beregne antallet af teoretiske bunde, og derved effektiviteten af ens kolonne:

            𝒕
             𝒓
                                                                                        21
𝑵=𝟓,𝟓𝟒𝟓 ∙ (  )  ,𝑁 = 𝑡𝑒𝑜𝑟𝑒𝑡𝑖𝑠𝑘𝑒 𝑏𝑢𝑛𝑑𝑒, 𝑡 =𝑡𝑜𝑝𝑝𝑒𝑛𝑠𝑟𝑒𝑡𝑒𝑛𝑡𝑖𝑜𝑛𝑠𝑡𝑖𝑑, b=𝑏𝑟𝑒𝑑𝑑𝑒𝑛 𝑚å𝑙𝑡 𝑖 ℎ𝑎𝑙𝑣 ℎø𝑗𝑑𝑒
                                      𝑟
            𝒃

𝟐

Hvis toppene er smalle, vil bredden være lille og derfor vil der være plads til adskillelse af flere komponen-

                                                                        22
ter, dette er ensbetydende med god effektivitet. N skal helst ligge imellem 1000 og 5000

, for at man har en acceptabel retentionstid.

Ved normal/omvendt fase kromatografi er polariteten altafgørende, men der er også andre former for

hvordan kolonnen og molekylernes egenskaber kan adskille komponenter i en prøve, en af dem er ionkro-matografi.

20

http://www.biosite.dk/leksikon/images/koffein.gif

21

Side 5

22

Side 5

Side 12

Side 12 af 30

Ved ionkromatografi er der to kolonner, kaldet ionbytningskolonner. Der bliver altså indskudt en ekstra kolonne. Den første kolonne er seperationskolonnen, der separerer de forskellige komponenter og den nye kolonne er suppressioskolonnen som fastholder eluentens ioner, så det er mulig at anvende en ledningsev-ne detektor.

Grunden til at der indskydes en suppressionskolonne er fordi det er svært at finde en detektor der kan an-vendes, specielt ledningdetektorer. Ionbytningsmaterialet gør at ion interaktion binder ion molekyler af modsatladning.

Der er to måder ionbytnings kromatografi kan foregå. Ved kationbytter eller anionbytter.

Ved reaktion i kolonnen ved kationbytning, er en kationbytter positivt ladede kationer, denne binder altså negative ioner. Herunder er der reaktionen skemaet for ionbytningen i kolonnen:

−𝑹^{−} 𝒀^{+} + 𝑿^{+} = −𝑹^{−} 𝑿^{+} + 𝒀^{+} (7-2)

23

Molekylerne i prøven 𝑋^{+} og modionen på kolonnematerialet er 𝑌^{+} konkurrere om at blive bundet til den
anioniske gruppe −𝑅^{−} på kolonne materialet.

Kationbyttere er stærkt sure eller svagt sure. Og er oftest Sulfanat- eller carboxzylgrupper. Silica er en svagt sur kationbytter, hvis en eluents pH er over 5 vil silanol grupper blive ioniserede, så her er silica også anvendeligt som kolonnemateriale.

En anion er en ion med en negativ ladning, 𝑌^{−}, sammen med ionerne i prøven 𝑋^{−}, vil de ligesom ved kat-
ionbytteren konkurrerer om at blive bunden på den kationiske gruppe −𝑅^{+}. altså Ved reaktionen i en ko-

lonnen ved anionbytning ses at:

−𝑹^{−} 𝒀^{−} + 𝑿^{−} = −𝑹^{+} 𝑿^{−} + 𝒀^{−} (7-1)

24

Anionbyttere er stærkt basiske eller svagt basiske kvartære ammonium grupper og/eller tertiære amino-

grupper.

Forøges af koncentrationen 𝑌^{−} 𝑖 eluenten forskydes ligevægten mod venstre, så der er en mindre grad af
bindingen 𝑋^{−} til kolonne materialet, dette vil resulterer i en kortere retentionstid. Ligevægten forskydes

                                                                              −
mod venstre, hvis der tilsættes andre anioner til eluenten der igen konkurrerer med bindingen 𝑋 til ko-

lonne materialet, dette vil også forskyde ligevægten mod venstre. Jo større koncentrationen af andre anio-

23

Anvendt væske chromatografi side 86

24

Anvendt væske chromatografi side 86

Side 13

Side 13 af 30

ner end 𝑋^{−}, jo hurtigere vil prøvekomponenten komme ud. Altså den elutrope styrke påvirkes af ionstyr-

ken.

Kolonnemateriale ved ion kromatografi består i dag ofte af (efter flere forskellige slags) stærkt krydsbunde

polystyren/divinylbenzen. Disse anvendes fordi de kan modstå stort tryk, er meget robuste overfor pH-

ændringer og har ikke adsorptive egenskaber, som har været problemer ved tidligere kolonnematerialer.

Eluenten i ren ionbytningskromatografi laves af vand tilsat en buffer og evt. uorganiske salte, som kan regu-

lere ionstyrken og pH, der har indflydelse/kontrollere retentionstiden.

pH kontrollerer ionsitaionsgraden af prøven, der på ionform vil absorberer til ionbytningsitet på kolonnen.

                                                             25
Fordele ved ion kromatografi er der er erfaring med separation af ionegene komponenter. Ulempen ved

dette er at separationer af blandinger af ionogene og ikke ionogene komponenter er svært, da de ikke io-nogene ikke er særlig udbredte, og det er ikke muligt af justerer på retentionen af ikke ionogene kompo-nenter ved en eluent bestående af rene vandige buffer og saltopløsninger.

Ved denne form for kromatografi adskilles komponenter på grund af ladningsgrad. Men komponenter kan også skilles på grund af størrelsen af partiklerne, dette sker ved størrelseskromatografi.

Ved størrelseskromatografi er princippet at separerer komponenterne i en prøve, ud fra deres moleky-

                                                           26
lestørrelse. Denne metode anvendes til at identificerer makromolekyler.

Der sker der ingen interaktion imellem prøvens komponenter og kolonnematerialet. Men separationen sker efter partikelstørrelse, altså da komponenterne har forskellig størrelse vil de have forskellig evne til at trænge ind i den stationære fases porøse partikler. Altså er udvekslingen af partikler mellem den mobilefase og den stationære fase forskellig i forhold til størrelse.

På grund af dette vil de mindste molekyler diffundere længst ind i de porøse partikler og tilbageholdes mest, mens de store partikler ikke kan komme ind i porerne og derfor ekskluderes. Altså vil det tage længst tid for de små komponenter at komme igennem kolonnen frem for de store komponenter, der ikke har mulighed for at diffundere.

25

Ionogene er et stof evne til at ioniseres hvilket vil sige et stof som opgiver/afgiver en eller flere elektroner..

26

Meget stort organisk eller uorganisk molekyle. Fra

http://www.denstoredanske.dk/It,_teknik_og_naturvidenskab/Kemi/Kunststoffer,_polymerkemi,_plast_og_gummi/m

akromolekyle

Side 14

Side 14 af 30

På billedet ses den stationære fases korn øverst og derefter et zoom. Man ser at de små molekyler trænger lang ind i porerne i den stationære fase og at de store ikke kan diffunderer ind i stationære fase, men fort-

sætter med den mobile fase mod detektoren. (billede^{27}).

Størrelseskromatografi bruges ofte til adskillelse af proteiner/peptider i biologiske prøver.

Detektorer

Der er mange former for detektorer, fx RI-detektoren og UV-detektoren. Begge er anvendt som detektorer i HPLC, FIA og andre apparter. Jeg vil under detektorer komme inde på spektrofotometri og refrektometri, altså teorien bag UV-detektoren og RI-dektoren.

Den mest anvendte er UV-detektoren også kaldet fotometerdetektoren. For at forstå princippet i UV-detektoren er det nødvendigt at gennemgå teorien bag nemlig spektrofotometri.

Spektrofotometri er i relation med kolorimetri, der måler på farve og farveintensitet. Men spektrofotometri har fordele ved at være uafhængig af farveopløsninger og kan måle på meget lave koncentrationer.

Princippet er at man måler absorbansforskellen mellem eluenten og prøvekomponenter. Altså er absorbansen konstant når det kun er eluenten der stømmer igennem detektoren, men når der så kommer adskildte komponenter igennem, ændres absorbansen, og der sker en ændring i kromatogrammet.

Man kan få to forskellige former for kromotogrammer ud af at måle på absorbansen, indirekte fotometri og direktefotometri. Ved direkte fotometri skal en eluenten have en så lille en absorbans som er muligt, så når komponenterne skal detekteres, har de en større absorbans end eluenten. Så når der kommer en komponent igennem detektoren vil den registrende computer opfange en højere absorbans, og der vil komme en top i kromatogrammet. Ved indirekte fotometri er det omvendt eluent har en høj absorbans , og komponenterne en lav absorbans, altså absorberer eluenten lyset, men når der kommer en komponent forbi detektoren der registeres et fald i absorbansen, og der vil komme en negativ top.

UV-detektoren kan deles op i tre forskellig slags. De har alle samme princip man udføres forskelligt. Den første er spektrofotometeret som er den mest anvendte, den kan indstilles på den bølgelængde man ønsker at anvende. Filterfotometeret derimod kan kun måle de bølgelængder man har filter til. Et filter er et farvet stykke glas som sættes ned foran detektoren og derefter kan kun lyset med samme bølgelængden som filteret slippe igennem glasset. Denne metode bliver ikke anvendt særlig ofte, da den ikke er lige så

27

Side 28

Side 15

Side 15 af 30 effektiv som spektrofotometeret. Til gengæld er det en billigere detektor. Den sidste form er Diode Array Detekter (DAD), der måler ved mange bølgelængder samtidig.

Måden et spektrofotometer(se bilag) fungerer på er at man sender lys fra en lyskilde ind i et monochromator, som er indstillet til bølgelængden der skal anvendes, dette er også kaldet monokratisk lys.

Ved et spektrofotometer er der forskellige monochromatorer: feks. Absorbtionsfilter der avendes i

filterfotometeret. Eller prisme/optisk gitter der andvendes i spektrofotometre.

Når man skal lave en undersøgelse på sin prøve er det idelle at måle ved den bølgelængde, hvor komponenterne har højest absorbans. Dette kan være svært, da absorbanen højst sandsynlig er forskellige for de forskellige komponenter, så man må finde et kompromis, der stadig giver resultater med høje absorbans værdier. Hvis man skal måle på komponenter med meget forskellige absorbans maksimum, kan man komme ud for det ikke er muligt at finde et acceptabelt kompromi for arbejdesbølgelængden. Her kan man med fordel bruge en DAD-detektor, der måler ved mange forskellige bølgelængder samtidigt.

Når man skal vælge sin bølgelængde skal man tage hensyn til energiniveauerne også kaldet elektronspring.

Ved elektronspring og absorption er der forskellige bindingstyper kaldet chromoforerne. Dette er en bindingstype der udviser absorbans(fx dobbeltbindinger). Detektion i UV-området er bygget på at stofferne absoberer UV lyset afhængigt af deres molekylestruktur. Det er altså indeholdet af bindingstyper der afgøre hvilken bølgelængde der skal anvendes. Bindingtyperne også kaldet chromoforerne kan slås op i et skema, ved hvilken bølgelængde bindingerne absorberer.

Når man skal vælge sin arbejdsbølgelængde skal man se på de funktionelle grupper i ens molekyle.

Ud fra de funktionelle grupper, kan man se hvilke chromoforer, de indeholder og derfor ved hvilken

                             28
bølgelængde de absorberer. (Billede )

Man kan bestemme arbejdesbølgelængden på to måder, ved at lave en absorbanskurve eller en transmissionskurve. Ved absorbanskurven måler man absorbansen som en funktion af bølgelængden og afbilleder den grafisk. Herefter kan man se arbejdsbølgelængden ved funktionens maximun. Ved transmissionskurven er kurven spejlvendt og finder arbejdsbølgelængden ved funktionsens minimum.

28

Side 30

Side 16

Side 16 af 30

Sammenhængen mellem absorbans og transmision er logT=2-A.

Deadvolumen kan medføre at båndspredningen forstørres. Deadvolum er et hulrum i væskestrømme, som kan have konsekvenser med at prøvens komponenter fortyndes op med mobilfasen. Der kan være forskel-lige årsager til dette, det kan skyldes en forkert pakning af kolonnen, en slidt kolonne, forkert brug af fit-tings, unødvendig lang rørføring mm. Jo mere prøven fortyndes i mobilfase, des jo bredere toppe (dårligere adskillelse)

Rent teknisk i selve detektoren er det vigtig at udforme en kuvette, der kan holde til det rest tryk der er i denne del af HPLC apparatet, og kan gør at der er et godt væskeflow uden bobler og ujævnheder. Dette ville kunne gøre at komponenter ville blive blandet sammen og toppene ville ligge oveni hinanden i kromotogrammet eller at der for lang tid imellem komponenter kommer forbi detektoren. Derfor er det vigtig at volumen i gennemstrømningen i kuvetten er lille, den er normalt omkring de 8 цL. Ved en UV

                              29
detektor skal der anvendes kvartsglas

for at undgå absorbation af lyset i glasset. En kuvette i en HPLC detector kaldes en flowkuvette.

Evt lysvej

Når lyset har passeret prøven rammer det en fotocelle, denne kan også være af forskellige slags.

Fotodioden, Spærrelagsfotocellen, Vacuum fotocellen og Fotomultiplikatoren. Ledningsevnen skal være proportional med lysstrømmen. Oftest anvendes en silica fotodiode, da den har en god linearitet, når energistrømmningen ikke er for kraftig. Hvis den bliver for kraftig er der ingen proportionalitet mellem energi i strømmen og elektriske strømme målt i kredsløbet. Herefter sender fotocellen dataerne videre til en registrende computer.

I forsøget ”koffien i kaffe og te”er der anvendt en spektrofotometer detektor, der måler ved bølgelængden

270 nm. Denne bølge længde er valgt fordi koffein har absorbansmaksimum her. I skemaet for chromoforer ses det at ketonbindingen har absorbans ved 270-285 nm, samt at benzen har absorbans maksimum ved

255 nm. Disse funktionelle grupper indgår i koffein, og disse absorbans maksimum ligger tæt på vor arbejdsbølgelænde.

Refraktometri er den anden detektionsmetode, der er anvendt i en RI-detektor. Ved refraktometri måler man refraktionsindekset. Den kan måle alle komponenter, der har et brydningsindeks forskelligt fra eluen-ten. Refraktionsindekset måles ved at bestemme grænsevinklen for lysstrålens passage grænsefladen imel-lem et glasprisme med høj refraktionsindeks og en given prøve. Der opstår en grænsevinkel ved lysstrålens

29

Side 17

Side 17 af 30 passage fra prismet til prøven. Når glas prismet har en høj refraktionsindeks vil den altid have den mindste vinkel, uanset strålens udgangspunkt.

Prøven strømmer igennem en detektor, hvor der er en lysstråle der lyser igennem en matglasplade og ned i

                                                                         30
prøven og videre ned i prismet. Når det passerer den matte glasplade vil lyset være diffust , imellem prø-

ven og prismet strålerne brydes.

Refraktionsindekset betegnes også brydningsindekset og kan betegnes som:

𝒏=

𝑪_{𝒗}
𝑪_{𝒔}

                                                                                      31
hvor n = det givne stoffets refraktionsindeks, C = lyshastigheden i vakuum, C = lyshastigheden i stoffet.
                                       v                        s

Refraktionsindekset er en stofkonstant, da lyshastigheden i vakuum er konstant, altså er det kun tempera-tur og bølgelængde der spiller en rolle.

Da vi er interesseret i at finde brydningsvinklen, kan vi anvende brydningsloven til at beregne en stråles brydningsvinkel, men kun hvis man kender indfaldsvinklen.

N_{1} · sin(i) = n_{2} ·sin(b)
Hvor N_{1} = refraktionsindeks for stof 1, Hvor N_{2} = refraktionsindeks for stof 2, i = brydningsvinklen, b = brydningsvink-
len.^{32}

Bruges til sukker analyse.

30

Lysstråler med alle tænkelige retninger

31

Apparat teknik side 453

32

Apparat teknik side 453

Side 18

Side 18 af 30

Databehandling

Ved databehandlingen behandles resultaterne enten kvalitativt og kvantitativt. Der er taget udgangspunkt i forsøget ”koffein i kaffe og te”. Nogle prøver var fortyndede for meget, disse er ikke inkluderet i den kvanti-tative efterbehandling.

Ved kvalitativt undersøgelse finder man ud af hvilke stoffer man arbejder med. Man kan ud fra et kroma-togram identificerer prøvens komponenter ved at sammenligne retentionstiden fra prøven og en kendt standard.

Dette gøres ved at tage standardopløsningernes retentions tid for koffein og finde gennemsnittet. Herefter sammenlignes der med retentionstiden for prøverne.

Nu kan forskellen beregnes og hermed sandsynligheden for om det er koffein, der er fundet i prøven.

Alle prøver og standardopløsningers retentionstider ses i bilag 10.

Hvis man tager standardopløsningernes retentionstider, som med sikkerhed er koffein, og beregner gen-

          14,732 𝑚𝑖𝑛
nemsnittet:       = 2,455 𝑚𝑖𝑛, får vi den gennemsnitlige retentionstid til 2,455 min.
             6

Alle de ukendte prøver har deres top ved 2,453 min. Vi kan så beregne den procentvise forskel og se mulig-hederne for det er koffein, der er i prøverne.

                 ( 2,455−2,453
Afvigelsen beregnes:        ∙ 100=0,081 %. Da denne afvigelse er meget lille, er det med meget
                     2,455

) stor sandsynlighed koffein der er identificeret i prøverne.

Ved kvantitativt beregninger bestemmes mængden af de stoffer der analyserer på. Man bestemmer kon-centrationen af et stof, ved at lave forholdsregning mellem toparealet af prøven og standarden. Dette sker automatisk i nyere apparater. Men jeg vil i dette afsnit skrive om teorien for, hvordan man beregner area-let. Jeg kan ikke anvende det på mine data, da jeg ikke har fået angivet nogen punkter på mine toppe. Dog vil jeg regne på egne data ved mindste kvadraters metode, herunder også beregne korrelationskoefficien-ten. Dette vil vise om der er lineær sammenhæng, samt hvor god sammenhængen er.

Arealbestemmelse: I nyere moderne apparater opsamles og beregnes data automatisk til toparealer, det er muligt at sætte parametre for beregningerne i chromatografisoftwaren. Andre parametre som top-højde, areal-% mm beregnes ofte også.

Side 19

Side 19 af 30

Derfor er det ikke nødvendigt for brugerne at have en række koordinater over kromatogrammet. Derfor vil areal bestemmelsen kun blive forklaret teoretisk. I bilag 8 kan man se kromatogrammet, jeg vil anvende som udgangspunkt. Det er kromatogrammet, der er udarbejdede for Redbull.

I bilag 9 ses retentionstiden for koffein er 2,45 min og man kan derefter aflæse toparealet til 15,81

mAU/min.

For at beregne arealet af en top, er man nødt til at tage området under toppen og dele det ind i uendelige mange linjestykker. Arealet under en kurve er summen af uendelige mange små arealer.

På figur 1 visers en graf, området under grafen ønskes arealbestemt. Området deles op i små linjestykker.

Det er samme metode computeren bruger til at beregne arealet af toppene i kromatogrammet.

Figur 2 →

← Figur 1

Man har et interval der går fra a til b, se figur 2. Bredden på hver af linjestykkerne kaldes Δ𝒙 og hvis man

laver en streg ned igennem hver enkelte af bredderne kalder man punktet i midten for x_{1},x_{2,},x_{3} op til x_{n .}

For at få arealet af toppen skal man finde summen af alle sine intervaller, summen af rektanglerne kaldes middelsummen (S).

𝑆=𝑓 ( 𝑥_{1}) ∙ Δ𝑥+ 𝑓 ( 𝑥_{2}) ∙ Δ𝑥 ..+ ..𝑓 ( 𝑥_{𝑛}) ∙ Δ𝑥

Dette kan skrives om til:

𝑆=∑𝑓(𝑥) ∙ Δ𝑥

𝑖 𝑛

𝑖=1

Når man lader Δx→0 får man at (bliver intervallerne uendelige små)

𝑆=∑𝑓(𝑥) ∙ Δ𝑥 →∫ 𝑓 ( 𝑥) 𝑑𝑥

𝑖 𝑛

𝑖=1

𝑏 𝑎

Side 20

Side 20 af 30

Arealet under toppen kan beregnes ud fra formlen som vi lige har fundet:

A = ∫_{𝑎}^{𝑏} 𝑓 ( 𝑥) 𝑑𝑥^{33}

Grunden til man ikke kan beregne arealet på denne måde, er at der ikke har noget funktion for grafen, og den kan ikke estimeres uden data over punkterne.

Mindste kvadraters metode: Her findes den bedste rette linje ud fra standard opløsningernes koordi-natpunkter. Den bedste rette linje, er hvor kvadrat summen af afstanden mellem det enkelte punkt og lin-jen er mindst mulig.

34

Man har et sæt data, med et n antal punkter, i dette tilfælde antal målinger. Man vil gerne se om data sæt-

tet har lineær sammenhæng 𝑦=𝑎𝑥+ 𝑏, hvor y= areal x= koncentration.

Afstanden mellem den bedste rette linje og det enkelte punkt kan skrives som 𝑎𝑥_{1} + 𝑏 − 𝑦_{1} for punkt 1

Man skal finde kvadratsummen af disse afstande ud fra alle punkterne:

(𝑎𝑥_{1} + 𝑏 − 𝑦_{1})^{2} + (𝑎𝑥_{2} + 𝑏− 𝑦_{2})^{2}..+..(𝑎𝑥_{𝑖} + 𝑏− 𝑦_{𝑖})^{2} =∑(𝑎𝑥 + 𝑏 − 𝑦_{𝑖})^{2}

𝑖 𝑛

𝑖=1

Når summen af kvadratafstanden er mindst mulig er den bedste rette linje bestemt.

For at finde ligningen for ens data sæt, skal man finde a og b. Før vi kan gøre det, er vi nødt til at se på re-sultaterne fra HPLC’en.

33

Matematik formelsamling A, 2007, s. 28, formel 153

34

http://plusa1stx.systime.dk/fileadmin/filer/beskyttede_filer/f2.png

Side 21

Side 21 af 30

Ved kvantitativ bestemmelse er det mulig at beregne koncentrationen ud fra arealet af toppene:

Der laves en standardrække for at se om der er lineær sammenhæng imellem top arealet og koncentratio-nen af stoffet.

Standard række fremstilles således at den næste koncentration i række lave ud fra den forrige stærkere

opløsning. Hele rækken laves ud fra en stamopløsning på 200 mg/L.

                      100 𝑚𝑔/𝐿
Eksempel på udregningen:     ∙ 100 𝑚𝐿=66,67 𝑚𝐿, dvs. vi udtager 66,67 ml stamopløsning og for-
                      150 𝑚𝑔/𝐿

tyndes op til 100 ml med destilleret HPLC-vand.

Man analyserer prøverne ved HPLC, og anvender resultaterne til at lave en standardkurve. Herunder ses et skema for resultaterne for de forskellige koncentrationer:

Koncentration (mg/L) 10 20 50 100 150 200
Areal mAU/min 11,8453 23,7765 58,8098 116,2794 172,4642 230,2311

Ud fra disse resultaterne kan summerne af arealerne og koncentrationer findes. I nedenstående skema er

summerne af de tal der skal bruges for at beregne a, b og r^{2} vist:

prøver mg/L X y xy 𝑥^{2} 𝑦^{2}

1 | 10 | 11,8453 | 118,453 | 100 | 140,311
2 | 20 | 23,7765 | 475,53 | 400 | 565,322
3 | 50 | 58,8098 | 2940,49 | 2500 | 3458,59

4 100 116,2794 11 627,9 10 000 13 520,9

5 150 172,4642 25 869,6 22 500 29 743,9

6 200 230,2311 46 046,2 40 000 53 006,4

∑

530 613,406 87 078,3 75 500 100 35,38

Nu er det muligt via ligningen fra før: ∑^{𝑛}_{𝑖=1} (𝑎𝑥_{𝑖} + 𝑏 − 𝑦_{𝑖})^{2}, at finde a og b. man starter med at differtere

ligningen med hensyn til a og derefter b:

a: 2 ∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} (𝑎𝑥_{𝑖} + 𝑏 − 𝑦_{𝑖}) ∙ 𝑥_{𝑖}

b: 2 ∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} (𝑎𝑥_{𝑖} + 𝑏 − 𝑦_{𝑖})

Når der er differeret, kan man finde ligningen for a og b, ved at løse to ligninger med to ubekendte. Dette er muligt da de to størrelser er minimale og derfor er afstandkvadratsummen 0.

I den der er differentieret med hensyn til b, isoleres b:

Koncentrationen mg/L 10 20 50 100 150
V(stamopløsningen) mL/100 mL 50 40 50 66,67 75

Side 22

Side 22 af 30

2 ∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} (𝑎𝑥_{𝑖} + 𝑏 − 𝑦_{𝑖}) ↔ 𝑏= ∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑦_{𝑖} − 𝑎 ∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥𝑖

1 𝑛

Den anden sættes lig med nul:

2 ∙ ∑(𝑎𝑥_{𝑖} + 𝑏 − 𝑦_{𝑖}) ∙ 𝑥_{𝑖}

𝑛

𝑖=1

𝑎∙ ∑𝑥_{𝑖}^{2} + 𝑏 ∙ ∑𝑥_{𝑖} − ∑𝑥_{𝑖} 𝑦_{𝑖} =0^{35}

𝑛 𝑛 𝑛

𝑖=1 𝑖=1 𝑖=1

For at beregne ligningen, skal jeg finde a og derefter sættes værdien for a ind i ligningen for b og på den måde kan jeg bestemme ligningen for min funktion med bedst mulig korrelationskoefficient, korrelations-koefficienten beregnes bagefter: a skal isoleres:

𝑎∙ ∑𝑥_{𝑖}^{2} + 𝑏 ∙ ∑𝑥_{𝑖} − ∑𝑥_{𝑖} 𝑦_{𝑖} =0^{36}

𝑛 𝑛 𝑛

𝑖=1 𝑖=1 𝑖=1

𝑎=

𝑏∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖} − ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖} 𝑦_{𝑖}
∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2}

          1
                             37
              𝑛         𝑛
Ligning 𝑏= ∙ ∑  𝑦  − 𝑎 ∙ ∑ 𝑥𝑖  sættes ind i ligningen:
              𝑖=1 𝑖     𝑖=1
          𝑛

𝑎= −

∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖} 𝑦_{𝑖}
∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2} ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2}

1 𝑛

∙ ( ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑦_{𝑖} − 𝑎∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}) ∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}

Man ganger ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}, ind i parentesen.

𝑎= −

∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖} 𝑦_{𝑖}
∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2} ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2}

1 1 𝑛 𝑛

∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖} ∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑦_{𝑖} − ∙ 𝑎∙ ( ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖})^{2}

a sættes udenfor brøken og det bagerste led deles op i to brøker:

               𝑛                𝑛
     𝑛
             ∙ ∑             ∙( ∑
    ∑
               𝑖=1              𝑖=1
     𝑖=1     𝑛               𝑛
𝑎=         −            + 𝑎∙
                               𝑛
                              ∑
                               𝑖=1

𝑥_{𝑖} 𝑦_{𝑖}
∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2} ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2} 𝑥_{𝑖}^{2}

1 1

𝑥_{𝑖} ∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑦_{𝑖} 𝑥_{𝑖})^{2}

Man trækker 𝑎∙^{𝑛}^{∙(}_{∑_{𝑖=1}}^{∑^{𝑛}_{𝑖=1}}_{𝑛} fra på begge sider:

1

𝑥_{𝑖})^{2}
𝑥_{𝑖}^{2}

         𝑛
       ∙( ∑                 ∙
         𝑖=1
       𝑛                   𝑛
𝑎− 𝑎 ∙         =         −
         𝑛
        ∑
         𝑖=1

1 1

𝑥_{𝑖})^{2} ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖} − ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑦_{𝑖}
𝑥_{𝑖}^{2} ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2} ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2}

∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖} 𝑦_{𝑖}

35

http://www.math.ku.dk/famos/arkiv/10-1/node2.html

36

http://www.math.ku.dk/famos/arkiv/10-1/node2.html

37

http://www.math.ku.dk/famos/arkiv/10-1/node2.html

Side 23

Side 23 af 30 a sættes udenfor parentesen:

          𝑛
        ∙( ∑                  ∙
          𝑖=1
        𝑛                    𝑛
𝑎∙ ( 1 −        ) =        −
          𝑛
         ∑
          𝑖=1

1 1

𝑥_{𝑖})^{2} ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖} ∙ ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑦_{𝑖}
𝑥_{𝑖}^{2} ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2} ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2}

∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖} 𝑦_{𝑖}

∑_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2𝑛}
∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2}

=1,𝑑𝑒𝑟𝑓𝑜𝑟:

    ∑
     𝑖=1
𝑎 ∙ (              ) =

    1        2                  1
 2𝑛     𝑛               𝑛          𝑛      𝑛
𝑥 −  ∙( ∑  𝑥 )         ∑   𝑥 𝑦 − ∙ ∑  𝑥 ∙ ∑  𝑦
            𝑖               𝑖 𝑖         𝑖     𝑖
 𝑖      𝑖=1             𝑖=1        𝑖=1    𝑖=1
    𝑛                           𝑛

∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2} ∑^{𝑛}_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2}

Ganger igennem med ∑_{𝑖=1} 𝑥_{𝑖}^{2𝑛}:

            1         2              𝟏
         2𝑛      𝑛          𝒏            𝒏      𝒏
𝒂 ∙ ( ∑ 𝑥 −   ∙ ( ∑ 𝑥 ) )= ∑   𝒙 𝒚 −   ∙ ∑  𝒙 ∙ ∑  𝒚
     𝑖=1 𝑖       𝑖=1 𝑖      𝒊=𝟏 𝒊 𝒊      𝒊=𝟏 𝒊  𝒊=𝟏 𝒊
            𝑛                        𝒏

                                        1         2
                                     2𝑛     𝑛
Dividerer igennem med igennem med ∑ 𝑥 −  ∙ ( ∑ 𝑥 ) :
                                 𝑖=1 𝑖      𝑖=1 𝑖
                                        𝑛

     𝒏
    ∑
     𝒊=𝟏
𝑎=

      𝟏
        𝒏      𝒏
𝒙 𝒚 −  ∙ ∑  𝒙 ∙ ∑ 𝒚
 𝒊 𝒊    𝒊=𝟏  𝒊 𝒊=𝟏  𝒊
      𝒏

        1         2
 𝑛    2     𝑛
∑   𝑥  − ∙( ∑  𝑥 )
                𝑖
 𝑖=1  𝑖     𝑖=1
        𝑛

Nu er a isoleret og kan beregnes, når a er beregnet sættes værdien ind i ligningen for b og så kan b bereg-

         𝒏
        ∑
         𝒊=𝟏                    1
                                     𝑛         𝑛
nes: 𝑎=                   og =    ∙ (∑  𝑦 − 𝑎∙ ∑  𝑥 )
                                     𝑖=1 𝑖     𝑖=1 𝑖
                                𝑛

      𝟏
         𝒏     𝒏
𝒙 𝒚 −  ∙ ∑  𝒙 ∙ ∑  𝒚
 𝒊 𝒊     𝒊=𝟏 𝒊 𝒊=𝟏  𝒊
      𝒏

         1        2
 𝑛    2     𝑛
∑    𝑥 − ∙( ∑  𝑥 )
                 𝑖
 𝑖=1  𝑖     𝑖=1
        𝑛

           1
    87 078,3−
           6
𝑎=                   = 1,1468

∙530∙613,406

        1
              2
75 500−  ∙(530)
        6

Nu sættes a værdien inde i b’s ligning og b beregnes:

    1
𝑏=   ∙ ( 613,406 − 1,1468∙ 530 ) = 0,933667
    6

𝒚=𝟏,𝟏𝟒𝟔𝟖 + 𝟎,𝟗𝟑𝟑𝟔𝟔𝟕, hvor y = areal x= koncentration

Beregning af korrelationskoefficienten

Nu er det mulig at beregne korrelationskoefficienten, for at få bekræftet om det er en god lineær regressi-on. Dette kan vi se fordi jo tættere koefficienten er på 1, jo bedre er den bedste rette linje:

Der gælder for r^{2} at:
- r^{2} 1 er der en tilnærmelsesvis ekstrakt lineær sammenhæng

≈

- r^{2} 0 punkterne på grafen ligger ikke på linje, der kan ikke anvendes lineær regression.

≈

𝑟=

𝑛∙ ∑ 𝑥𝑦− ∑ 𝑥∙ ∑ 𝑦
√ ∑^{2} ∑ ∑ ∑
[ 𝑛∙ 𝑥 −( 𝑥)^{2}] ∙ [ 𝑛∙ 𝑦^{2} −( 𝑦)^{2}]

38

𝑟=                                =0.99997
    √

6∙87078,3−530∙613,406
( 6∙75 500−530^{2}) ∙ ( 6∙100 435,38−613,406^{2})

r²= 0,99982

38

Statistik for hospitalslaboranter af Ove S. Lauritsen, 2 oplag 1991 side 57

Side 24

Side 24 af 30

0

50

100

150

200

250

0 200 250

Areal

Koncentration

Areal Lineær (Areal)

Beregning af koncentrationen:

Man afbilleder derefter top arealet som funktion af koncentrationen.

𝒚=𝟏,𝟏𝟒𝟔𝟖𝐱 + 𝟎,𝟗𝟑𝟑𝟕, hvor y = areal x= koncentration

Man anvender sin funktion til at beregne koncentrationen af koffein i prøverne.

Prøverne analyseres i HPLC. Det er her nødvendigt at vide at kaffeprøven fortyndes 50 gang, Te prøven fortyndes 10 gange og Redbull fortyndes 25 gange.

Der blev analyseret to af hver prøve, og udregnet gennem-snittet af arealerne

                       36,237+28,555
(eksempel for kaffe prøven:      =33,395).
                            2

Skemaet under viser de forskellige prøvers arealer af koffein toppene.

Prøve Kaffe 1 Kaffe 2 Gennemsnit af Grøn te Grøn te Gennemsnit Redbull Redbull Gennemsnit af kaffe 3 4 af grøn te 3 4 Redbull

Areal 36,237 28,555 33,395 15,080 15,385 15,232 15,669 15,813 15,741

Man kan nu ud fra arealerne beregne koncentrationen af stofferne i prøverne.. Først beregnes koncentra-tionen af den fortyndede opløsning og senere tages der højde for fortyndingen.

Man anvender sin funktion (y = 1,146x + 0,933), og sætter arealerne ind på y plads og finder på den måde

koncentrationen.

Eksempel: TI-nspire: 𝑆𝑜𝑙𝑣𝑒(15,741=1,1468𝑥 + 0,9337,𝑥), 𝑥 = 12,912

Altså den fortyndede koncentrationen af den gennemsnitlige redbull er 12,912.

For at få den rigtige koncentration uden fortyndingen, skal man gange antal fortyndede gange med gen-nemsnittet af den fortyndede koncentration.

Eksempel for koncentrationen for den analyserede redbull (mg/L): 25 ∙ 12,912=322,79075 𝑚𝑔/𝐿

Herunder ses de gennemsnitlige koncentrationer for den analyserede drik og de fortyndedes koncentrationer:

Prøve Gennemsnit af kaffe Gennemsnit af grøn te Gennemsnit af Redbull

Koncentration (fortyndet) (mg/L) 28,306 12,468 12,912
Koncentration (mg/L) 1415,284 124,681 322,791

Det eneste oplyste koffeinindhold der er til rådighed er på redbullen, hvor der på varedeklaration står at

koffeinindhold i redbull er 320 mg/L. her kan vi så beregne den procentvise forskel:

Side 25

Side 25 af 30

Alle disse resultater kan man også plotte på TI-nspire lommeregnerne og indstilles til lineær regression. Her kan man så se at korrelationskoefficienten (R²) er 0,99997 altså det er en god lineær regression. Man kan

også se funktionen for linjen: y = 1,146x + 0,933. altså det samme som det udregnede.

Konklusion

Efter at have udarbejdet en opgave op kromatografi, har jeg fundet ud af at der findes flere former for kromatografi, HPLC, GC, TLC og andre slags jeg ikke har beskrevet i opgaven. Øvelsen har er blevet anvendt som et konkret eksempel igennem hele opgaven og er i databehandlingen blevet behandlet kvalitativt og kvantitativt, via metoder som mindste kvadratisk metoden og areal bestemmelse, for at forstå dette til fulde har jeg beskrevet to detektorer UV-detektoren og RI-detektoren, for at forstå disse har jeg beskrevet spektrofotometri og Refraktometri.

Jeg har gået igennem hele apparatet og fundet det nødvendig i afsnittene under eluenten og kolonnen at beskrive molekylernes egenskaber og struktur for at redegøre for principperne der forgår i kolonnen. Jeg har været inde omkring vigtigheden af polaritet af molekylerne i eluenten og kolonnen, ionisering egenska-ber og størrelseskromatografi hvor strukturen i molekylerne har været relevante, alle i forhold til hvilken prøve og hvilke data man vil have ud af forsøget.

Side 26

Side 26 af 30

Litteraturliste:

Hjemmesider

- http://www.biosite.dk/leksikon/kromatografi.htm
- http://www.denstoredanske.dk/It%2c_teknik_og_naturvidenskab/Kemi/Analytisk_kemi/kromatografi

- http://www.biotechacademy.dk/Bioindex/Biolex/HPLC.aspx (billede)
- http://da.wikipedia.org/wiki/Mohs%27_h%C3%A5rdhedsskala
- http://da.wikipedia.org/wiki/Korund

- http://www.denstoredanske.dk/It,_teknik_og_naturvidenskab/Kemi/Kemisk_laboratorie-
_og_fabriksterminologi/ionbytning
- http://www.denstoredanske.dk/It,_teknik_og_naturvidenskab/Kemi/Elektrokemi/ionisering

- http://www.math.ku.dk/famos/arkiv/10-1/node2.html
- www.hmfmat.dk/SRP%20nr%202.doc
- http://www.denstoredanske.dk/It%2c_teknik_og_naturvidenskab/Matematik_og_statistik/It_og_n
umerisk_analyse/mindste_kvadraters_metode
- http://science.au.dk/fileadmin/site_files/science.au.dk/NF/Komm/Arr/Bes%C3%B8gsservice/Krom

atografi.pdf

- http://www.protein.iastate.edu/images/hplc.jpg

- http://www.biosite.dk/leksikon/images/koffein.gif
- http://www.denstoredanske.dk/It,_teknik_og_naturvidenskab/Kemi/Kunststoffer,_polymerkemi,_
plast_og_gummi/makromolekyle
- http://intra.stgym.dk/natsund/natsund/spektrofotometri/spektrofotometer.jpg
- http://plusa1stx.systime.dk/fileadmin/filer/beskyttede_filer/f2.png

Side 27

Side 27 af 30

Bøger

- Kend kemien 1, Henrik Parbo, Annette Nyvad og Kim Kusk Mortensen, 1 udgave 2008, Gyldendal.

- Kend kemien 2, Henrik Parbo, Annette Nyvad og Kim Kusk Mortensen, 1 udgave 2007, Gyldendal.

- Basiskemi A, Ole Vesterlund Nielsen og Vibeke Axelsen, Haase & søns forlag, 1 udagve 2011

- Apparatteknik udgave 2, Flemmin Simonsen, akademisk forlag 1994

- Anvendt væske chromatografi, Steen Honoré Hansen, Per Helboe og Mogens Thomsen,

Chrompress K/S, Snekkersten 1987

- Matamatisk formelsamling stx A, matematiklærerforeningen 2007

- Statistik for hospitalslaboranter, Ove S. Lauritsen, 2 oplag 1991

- Vejen til matematik A2, Knud Erik Nielsen og Esper Fogh, forlaget HAX, 1 udgave 2006

- Almen, uorganisk og organsik kemi, Preben Hartmann-Petersen og Søren Stig Nielsen, Akademisk forlag 1993.

Side 28

Side 28 af 30

Bilag 1 forsøgsvejledning

Bilag 2

Bilag 3

Bilag 4

Bilag 5

Bilag 6

Side 29

Side 29 af 30

Bilag 7

Bilag 8

Bilag 9

No. | Ret.Time | Peak Name | Height | Area | Rel.Area | Amount | Type

min mAU mAU*min % n.a.

1 | 0,03 | n.a. | 0,925 | 0,068 | 0,27 | n.a. | BMB
2 | 0,49 | n.a. | 0,004 | 0,000 | 0,00 | n.a. | BMB
3 | 0,69 | n.a. | 0,001 | 0,000 | 0,00 | n.a. | BMB
4 | 1,31 | n.a. | 29,411 | 5,788 | 23,32 | n.a. | BMB
5 | 1,65 | n.a. | 1,567 | 0,063 | 0,25 | n.a. | BM
6 | 1,73 | n.a. | 0,566 | 0,033 | 0,13 | n.a. | MB
7 | 1,83 | n.a. | 18,193 | 0,971 | 3,91 | n.a. | BM
8 | 1,95 | n.a. | 4,946 | 0,277 | 1,11 | n.a. | MB
9 | 2,45 | n.a. | 217,365 | 15,813 | 63,71 | n.a. | BMB
10 | 2,86 | n.a. | 0,023 | 0,001 | 0,01 | n.a. | BMB
11 | 3,21 | n.a. | 13,500 | 1,640 | 6,61 | n.a. | BMB
12 | 3,33 | n.a. | 2,345 | 0,168 | 0,68 | n.a. | Rd

Total: 288,846 24,821 100,00 0,000

Bilag 10

Sample Sample Name Ret.Time

No. min

Side 30

Side 30 af 30

[2.39 -

2.51]

UV_VIS_1

1 | blank | n.a.

2 10 mg/L 2,460
3 20 mg/L 2,453
4 50 mg/L 2,460
5 100 mg/L 2,453
6 150 mg/L 2,453
7 200 mg/L 2,453

8 | Kaffe | 2,453
9 | Kaffe | 2,453
10 | Grøn te | 2,453
11 | Grøn te | 2,453
12 | Grøn te 2 | 2,453
13 | Grøn te | 2,453
14 | Grøn te | 2,453
15 | Grøn te | 2,453
16 | Red bull 1 | 2,453
17 | Red bull 2 | 2,453