Rapport om fermentering af penicillin

Side 1

10HTX13A

Side 1 af 35

Fermentering af penicillin

Penicillin V tegnet i Chemsketch

HTX 3. år

Forsøgspartner

HTX 3. år

Klasse 08htx11a

Dato 2/5 2011

HTX 3. år

Side 2

10HTX13A

Side 2 af 35

Selvstændighedserklæring

Jeg bekræfter herved med min underskrift, at opgavebesvarelsen er udarbejdet af mig.

Jeg har ikke anvendt tidligere bedømt arbejde uden henvisninger hertil, og opgavebesvarelsen er udfærdiget uden anvendelse af uretmæssig hjælp og uden brug af hjælpemidler, der ikke har været tilladt under prøven.

_______________________________

Elevens underskrift og dato

Side 3

10HTX13A

Side 3 af 35

Resumé

I Dette projekt har jeg i samarbejde med min forsøgspartner [navn fjernet], produceret penicillin fra skimmelsvampen Penicillinum Chrysogenum, via en fermenteringsproces.

Vi dyrkede skimmelsvampen i forkulturskolber som kickstartede væksten, herefter i dyrkningkolber. I disse 12 dyrkningkolber lavede vi 6 forskellige fermenteringer for at undersøge hvilke parametre der har indflydelse på penicillinudbyttet. Parametrene vi ændrede på, var pH-værdien, temperaturen og iltniveauet. Vi dyrkede også bakterien Micrococcus luteus, som er en grampositiv bakterie med stor følsomhed overfor penicillin. Denne blev til sidst brugt til at udføre penicillinbestemmelse ved agardiffusion og agarkopmetoden.

Efter forsøget fandt jeg ud af at Penicillinum chrysogenum har bedst vækstbetingelser ved en pH omkring 6-7, når den bliver iltet og har en temperatur på omkring 21˚C. Derudover kan jeg konkludere at alle 3 undersøgte faktorer, især iltning, har en stor effekt på udbyttet af penicillin.

Side 4

10HTX13A

Side 4 af 35

Indholdsfortegnelse

Resumé ................................................................................................................................................. 3 Indledning ............................................................................................................................................ 5 Projektbeskrivelse ................................................................................................................................ 5 Teori ..................................................................................................................................................... 6 Historien ........................................................................................................................................... 6 Mikroorganismer .............................................................................................................................. 7 Bakteriecellen ................................................................................................................................... 8 Den eukaryote celle .......................................................................................................................... 9 Dyrkning af mikroorganismer ........................................................................................................ 10 Substrater ........................................................................................................................................ 12 Fermentering .................................................................................................................................. 14 Antibiotika og penicillin ................................................................................................................. 15 Resistens ......................................................................................................................................... 17 Forsøgsbeskrivelse ............................................................................................................................. 19 Fremstilling af substrater ................................................................................................................ 19 Podning og dyrkning af skimmelsvampen ..................................................................................... 21 Dyrkning af testbakterien ............................................................................................................... 24 Koncentrering af penicillin ............................................................................................................. 24 Fremstilling af PCA-plader med testorganismen ........................................................................... 25 Dybdeudsæd og agarkopmetoden .................................................................................................. 26 Resultater ........................................................................................................................................... 28 Resultatbehandling ............................................................................................................................. 29 Udregning af koncentration ............................................................................................................ 29 Optimering...................................................................................................................................... 31 Fejlkilder ........................................................................................................................................ 32 Perspektivering................................................................................................................................... 33 Konklusion ......................................................................................................................................... 34 Litteraturliste ...................................................................................................................................... 35

Side 5

10HTX13A

Side 5 af 35

Indledning

Da Alexander Flerming opdagede penicillin i 1928, var det en stor opdagelse, men der skulle gå over 10 år før en masseproduktion blev startet. Penicillin blev betragtet som et vidundermiddel, der kunne kurere de fleste sygdomme, men prisen var høj. Senere faldt prisen, fordi man optimerede fermenteringsprocessen, og fordi man valgte en anden art af sk skimmelsvampen Penicillinum. Jeg vil optimere penicillinproduktionen fra svampen Penicillinum Chrysogenum og måle koncentrationen af den udvundne penicillinholdige væske.

Projektbeskrivelse

I dette projekt vil jeg producere penicillin fra skimmelsvampen Penicillinum Chrysogenum via en fermenteringsproces. Jeg vil optimere processen ved at udføre flere forskellige fermenteringer, hvor der ændres på enkelte faktorer, som pH, temperatur og iltniveau, herved undersøger jeg under hvilke forhold pencillinproduktionen er højest. Jeg vil via en penicillinbestemmelse ved agardiffusion og agarkopmetoden bestemme koncentrationen af produceret penicillin.

Pga. en begrænset tid, har jeg i samarbejde med min forsøgspartner [navn fjernet], valgt at undersøge 3 parametre pH, temperatur og iltniveau. Konkret har vi valgt følgende

• Vandbad ved 36˚C

• Vandbad ved 21˚C

• pH 4,25

• pH 6,86

• pH 8,21

• Iltning

• Neutral

Vi har valgt at udføre dobbeltbestemmelse i dyrkningskolberne, for at sikre et uforurenet resultat.

Vi vil bestemme koncentrationen af produceret penicillin ved at sammenligne med standardopløsninger af penicillin-G-kaliumsalt, og vi vil lave standardkurver, så den præcise koncentration kan findes.

Jeg vil i mit teoriafsnit, begrænse mig til de emner som jeg har fundet relevante for mit forsøg.

Derfor har jeg valgt at jeg i forhold til mikroorganismer vil koncentrere mig om bakteriecellen og svampecellen. Jeg vil kun kort fortælle generalt om den eukaryote celle, inden jeg fordyber mig i svampecellen i afsnittet Den eukaryote celle.

Jeg har valgt ikke at beskrive andre antibiotika end penicillin, da det er denne mit forsøg bygger på.

Jeg vil afslutte mit projekt med et perspektiveringsafsnit, hvor jeg vil snakke om multiresistente bakterier, og hvad man kan gøre for at begrænse spredningen.

Side 6

10HTX13A

Side 6 af 35

Teori

I teoriafsnittet vil jeg komme med den baggrundsviden, som jeg finder relevant i forhold til vores forsøg.

Historien

I mange hundrede år har Maya-indianerne i Mexico brugt salve med mug i, for at helbrede betændte sår. Men den første nedfældning på skrift, om at anvende mugsvampe til behandling af infektionssygdomme kom i 1640 af den engelske apoteker John Parkington. Derefter har fulgt en række mindre forsøg og observationer hvor mugsvampe er blevet kædet sammen med en hæmmet bakterievækst. Der skulle dog gå næsten 300år, før opdagelsen af penicillin blev gjort. Opdageren af penicillin var Alexander Fleming. Hans opdagelse fandt sted i år 1928 ved et tilfælde. Alexander han skulle rydde op på sit arbejdsbord og havde anbragt en stak petriskåle med stafylokokker i den ene ende af arbejdsbordet. Da han skulle til at desinficere petriskålene for at rengøre dem, så han at den ene var forurenet med en skimmelsvamp. Derudover så han også at de omkringliggende stafylokokker var ved at gå til grunde. Ud fra dette konkluderede Alexander at skimmelsvampen havde en hæmmende virkning på bakteriers vækst. Efter denne opdagelse isolerede han svampen for at undersøge den videre. Efter flere forsøg fandt han ud af at det kun var de gram-positive bakterier der blev påvirket af stoffet. Endvidere påvirkede stoffet ikke dyreceller, hvilket gav Alexander forhåbninger om at kunne bruge stoffet terapeutisk. Svampen han havde isoleret var Penicillium notatum, og det virksomme stof kalder han for Penicillin. Det lykkes ham dog kun i nogen grad at koncentrere penicillinen i en mugsaft hvor der stadig var svamperester og urenheder i.

Alexander Fleming begynder nu sammen med Ridley og Craddock at producere penicillinen og det lykkes dem at optimerer deres oprensningsproces så de står tilbage med en renere penicillinholdig væske. Herefter laver de en række forsøg på kaniner og mus som bekræfter at penicillinet ikke er skadende på dyrenes celler. De lavede også et par forsøg på mennesker, som i nogen grad viste sig effektivt. Herefter var der en periode med stilstand, hvor arbejdet med at isolere og renfremstille penicillinet gik i stå. Først 10 år senere, i år 1938 blev der gjort fremskridt af Howard Florey og Ernst Chain, som var begyndt at arbejde videre på Flemings arbejde. Det lykkes dem at forbedre udvindingsmetoden, og de formår at udvinde et renere og mere virksomt penicillin end Flemings.

Via hundredvis af dyreforsøg beviser de for omverdenen at penicillin han kurere mus der er blevet injiceret med streptokokbakterier. Efterfølgende kom der forsøg på mennesker som førte til den første storproduktion af penicillin i en medicinalfabrik i USA, efterfølgende kom der også en produktion i England. Penicillinen der blev flittigt brugt under 2. verdenskrig på sårede soldater.

Penicillinen gjorde at soldater med sårinfektioner, som tidligere ledt til amputerede lemmer, nu hurtigt kunne komme raske tilbage i kamp. Kønssygdommen gonoré der altid florere blandt

                         1
soldater, blev hurtigt slået ned.

Den dag i dag findes der mange forskellige hel og halvsyntetiske antibiotika, men der bruges stadig skimmelsvampe til produktionen af nogle penicilliner.

1

Alexander Fleming og penicillinet, Preben Hartmann-petersen.

Side 7

10HTX13A

Side 7 af 35

Mikroorganismer

De organismer vi har på jorden, deler vi op i tre domæner, bakterier, arkæer og eukaryoter.

Bakterier og arkæer er begge prokaryote, dvs. de er kerneløse. De eukaryote (de kerneholdige) udgør de resterende celletyper, heriblandt svampe, dyr,

                             2
planter, protozoer og de fleste alger.

Figuren til højre, viser domænernes udvikling fra stamformen. Bakterier er de første organismer der springer ud fra den fælles udviklingslinje og laver sin egen. Herefter har Arkæer og Eukaryote fulgt hinanden i en periode inden de blev delt op. Dette gør at selvom både bakterier og arkæer er prokaryoter, er der stadig visse ligheder mellem arkæer og eukaryoter. [3]

Jeg vil i mit teoriafsnit ikke beskæftige mig med arkæer, da disse ikke har indgået i mit forsøg.

Ligeledes vil jeg i mit afsnit om eukaryoter, have fokus på svampe da disse har en stor rolle i mit forsøg.

2

Teoretisk mikrobiologi for laboratoriefolk, Herluf Thougaard, Verner Varlund, m.f.

3

Mikroskopisk liv. Lone Als Egebo

Side 8

10HTX13A

Side 8 af 35

Bakteriecellen

Bakterier er prokaryote mikroorganismer. Som formentlig var de første levende organismer på jorden.

                            4
Bakteriecellen indeholder følgende

• Cytoplasma, er den væske hvor bakteriecellens ”organer” er i. cytoplasmaet består af vand, enzymer, aminosyrer, salte, kulhydrater, B-vitaminer og stofskifteprodukter.

• Kromosomet, er bakteriecellens arvemateriale, som er en lang dobbelt-DNA-streng. (kaldes på skitsen til højre for (circular DNA))

• Ribosomerne, laver proteiner via proteinsyntese. Ribosomerne består af RNA og protein.

• Plasmid, indeholder små mængder DNA.

• Mesosom, er indfoldninger i plasmamembranen som enten er med til at udskille affaldsprodukter fra cytoplasmaet, eller har forbindelse til kromosomet og medvirker til deling af cellen.

• Flagel, gør det muligt for bakterien at svømme. Antallet af flageller varierer, men ens hvor hver bakterieart.

• Pili, er stive udvækster, der er fordelt over hele bakteriens overflade. Der er to slags pili, almindelige som bruges til at sætte bakterien fast på en overflade, og sexspili som bruges til at overføre DNA.

• Plasma membranen, er den inderste del af bakteriens afgrænsende ”hylster”. Den styrer hvilke stoffer der kan trænge ind og ud af cellen. Mange af cellens nedbrydningsprocesser foregår her, via de enzymer der er knyttet til membranen.

• Slimlaget, også kaldet kapslen, er det yderste lag, og omslutter cellevæggen. Slimlaget har ikke altid en funktion, men kan være med til at beskytte bakterien mod bakteriofager og udtørring.

• Cellevæggen, ligger imellem plasmamembranen og slimlaget. Cellevæggens funktion er at opretholde det osmotiske tryk i bakterien, har betydning for celledelingen og virker beskyttende mod fysiske og kemiske påvirkninger fra omgivelserne.

Man kan opdele bakterierne i to grupper, alt efter hvordan cellevæggen er opbygget. Enten er de grampositive eller gramnegative. Denne klassificering er vigtig i forhold til penicillin, da penicillinen primært rammer de grampositive celler. [5]

De gram-positive cellers cellevæg består af 50% Murein (Peptidoglycan), som er bundet sammen i kæder, og ligger i op til 40 lag, hvilket giver cellevæggen en stor styrke. Mureinlaget består af en ringbrynje af lange kæder af sukkerstoffer og aminosyrer, også kaldet NAG og NAM. På tværs er

                                                                    6 og 7
der peptidbroer (Oligopeptide) som holder kæderne sammen, og skaber ringbrynjen.

4

http://0.tqn.com/d/biology/1/0/Z/V/prokaryoticcell.jpg 27/4 2011

5

http://enfo.agt.bme.hu/drupal/sites/default/files/c27x5gram_stains.jpg 27/04 2011

6

Tegning: http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/29/Mureine.svg/432px-Mureine.svg.png 29/4

2011
7

Mikrobiologi – teori og praksis, Torben Skou og Gunnar Søgaard Jensenz

Side 9

10HTX13A

Side 9 af 35

De gram-negative cellers cellevæg er mere kompleks, og indeholder kun af 1-2 lag murein. Oven på gram-negative cellers mureinlag, er der en ydre membran, som er opbygget på samme måde som plasmamembranen, med phospholipider og lipoproteiner. Imellem mureinlaget og den ydre membran, er der lipoproteiner som fungerer som et bindeled. Denne ydre membran gør at penicillin bedst virker på grampositive bakterier, da de gramnegative bakteriers ydre membran beskytter mureinlaget. Mere om dette i afsnittet

          8 og 9 .
”Penicillin”.

Den eukaryote celle

De eukaryote celler dækker over flere riger, heriblandt dyr, planter og svampe, men også

                      10
protozoer og de fleste alger.

Eukaryote cellers opbygning afhænger af deres rige. Men der er en del fællestræk. Svampe Ascomycetes

• Plasmamembranen

(se bakteriecelle for beskrivelse)

• Cytoplasma

(se bakteriecelle for beskrivelse)

• Cellekernen

Modsat bakterier, har eukaryoter en cellekerne, som er den største organel i cellen. Her er arvematerialet, som består af dobbeltstrengede lineære DNA-molekyler

• Mitokondrier

Mitokondrierne er cellens ”kraftværk” og det er her cellen nedbryder og oxidere organiske stoffer for at lave energi. Mitokondirerne indeholder også DNA og ribosomer

• Ribosomer

(se bakteriecelle for beskrivelse)

Jeg vil have fokus på skimmelsvampe, da den eneste eukaryote mikroorganisme i mit forsøg har været skimmelsvampen Penicillium chrysogenum.

Svampe kendetegnes ved:

• De er eukaryote

• Er heterotrofe

• Har cellevæg

• Optager næring ved diffusion

8

Mikrobiologi og bioteknik. E. Waagner Nielsen og J.M. Buch Kristensen

9

Mikrobiologi. Herluf Thougaard, Verner Varlund, m.f.

10

Mikrobiologi. Herluf Thougaard, Verner Varlund, m.f.

Eukaryoter

Dyr

Planter

Protozoer og alger

Side 10

10HTX13A

Side 10 af 35

• Formere sig ved sporer/konidier

Skimmelsvampe er opbygget som lange forgrenede tråde. Hver tråd kaldes en hyfe og netværket kaldes et mycelium. Vækst sker ved forlængelse af hyferne, og dannelse af sidehyfer

Svampes formering sker ved sporer. Svampesporer kan sammenlignes med plantefrø, som kan danne nye træer, hvis de befinder sig i det rette miljø. Svampens formering kan opdeles i kønnet og ukønnet formering.

• Den kønnede formering kan ske på flere forskellige måder, alt efter arten på svampen.

Hovedreglen er at der sker en sammensmeltning af enten hyfeender eller han og hunlige celler, og der dannes herved spore, som er i stand til at udvikle sig til nye celler. Kønnet formering er en fordel eftersom der sikres en større genetisk variation, og en bedre tilpasningsevne sikres. Dog er kønnet formering og mere resursekrævende eftersom der skal

dannes specialiserede hyfer/celler og organeller.

• Den ukønnede formering, beskriver når afkommet er identisk med modercellen, genetisk set. Disse sporer dannes gennem almindelig celledeling, og kaldes derfor for mitosesporer.

Ved denne delingsmetode bruges der ikke mange resurser. Dannelsen af sporene sker forskelligt fra art til art, men et eksempel er hvor sporedannelsen sker i et sporehus, hvor sporene dannes i en boble i spidsen af en hyfe, som til sidst brister, og sporene bæres med vinden.

Dyrkning af mikroorganismer

I vores forsøg skulle vi flere gange lave en forøgelse af biomassen både for vores skimmelsvamp

(Penicillium chrysogenum), og vores testbakterie (microccus luteus). Hos bakterier sker dette primært ved en forøgelse af antallet af celler. Hos skimmelsvampe sker der også en vækst i størrelsen af celler, ved at spidsen af hyferne vokser, og myceliet strækker sig ud.

Bakterier formere sig ved at dele sig i to, dette sker ved at bakterien først vokser i størrelse, herefter dannes der en tværvæg igennem cellen, og cellen deler sig i to selvstændige celler. Dette gør at bakterievækst sker eksponentielt.

Der er en lang række faktorer der i større og mindre grad har betydning for mikroorganismers vækst heriblandt

• Næringstoffer

Næringsstoffer bruges som byggesten til opbygning af nye celler, og bruges som energikilde. Læs mere om dette i afsnittet Substrater, og i afsnittet forsøgsbeskrivelse. Hvis de rigtige næringsstoffer er til stede, vil den dyrkede mikroorganisme hurtigt starte på sin vækstfase. Energikildes optagelighed afgører også hvornår den stationære fase nås. Ved

Side 11

10HTX13A

Side 11 af 35 langsomt optagelige energikilder nås den hurtigere, end ved hurtigt optagelige energikilder som glukose.

• Ilt

Det er meget forskelligt om en mikroorganisme har behov for ilt. Nogle kræver det, nogle tåler det ikke, og nogle kan leve både anerobt og aerobt.

• Vandaktivitet

Alle levende organismer har behov for vand, men vandets tilgængelighed er med til at bestemme hvor godt organismer trives i dets miljø. Ved vandaktivitet forstås koncentrationen af opløste stoffer i vandet. Ved en koncentration af opløste stoffer, svarende til 0,9% NaCl finder man den koncentration som er inde i cellerne (isotonisk miljø). Ved en højere koncentration er det et hypertonisk miljø, her trækkes vandet ud af cellen, og den trækker sig sammen til en lille klump. Ved en lavere koncentration er det et hypotonisk miljø, her vil cellen suge vand indtil trykket er så stort, så cellen brister. Disse to fænomener finder sted på grund af osmose, der er vands diffusion igennem cellens membran, som finder sted for at lave ligevægt imellem vandkoncentration uden og inden for cellens membran.

• Temperatur

Mikroorganismer kræver alle en forskellig temperatur. Den laveste temperatur en mikroorganisme er i vækst ved, kaldes minimumstemepaturen. Optimumstemperaturen kaldes den temperatur hvor væksten er højest, og makimumstemperaturen er grænsen hvor hvor høj temperaturen må være for at kikroorganismen stadig er i vækst.

Psykofile bakterier lever bedst i kulde, mesofile i mellemtemperatur og termofile ved høj temperatur.

• pH pH er en skala fra 0 til 14 som beskriver hvor surt (vil gerne afgive hydrogenatomer) eller basisk (vil gerne optage hydrogenatomer) et miljø er. Mikroorganismer er ofte kun i stand til at vokse ved en bestemt pH-interval. De fleste bakterier vokser bedst ved pH 6-8, og derfor har bakteriesubtrater normalt en pH i dette interval.

• Tryk

Sidste faktor er tryk. Den har ikke megen betydning i naturen, da der ikke er den store forskel på høj- og lavtryk. Man udnytter dog at mikroorganismer dør ved et højt tryk, når

                          11
man konserverer levnedsmidler.

Alle disse faktorer udnytter man når arbejder med mikroorganismer. Både når vækst skal bekæmpes, som ved konservering af levnedsmidler, og når vækst skal optimeres. I vores forsøg undersøger vi vores skimmelsvamps vækst og produktion ved forskellig pH, temperatur og iltforhold.

11

Teoretisk mikrobiologi for laboratoriefolk, Herluf Thougaard, Verner Varlund, m.f.

Side 12

10HTX13A

Side 12 af 35

Vækstkurven

Når man poder et lille antal bakterier en kolbe med vækstsubstrat og lader bakterierne vokse, kan man tegne en vækstkurve som beskriver hvordan bakterier i vækst forholder sig. [12]

1. Lagfasen

Når podningen har fundet sted, vil der normalt gå et lille stykke tid før celleantallet begynder at stige. Denne fase kaldes lagfasen, og her vokser de enkelte celler i størrelse, og cellerne producere enzymer. Længden af denne fase afgøres af mange betingelser, heriblandt, antallet af bakterier, alderen på disse bakterier, temperatur og substrat.

2. Vækst fasen (den eksponentielle fase)

Herefter begynder cellerne at dele sig via mitose og man kommer dermed ind i den eksponentielle vækstfase. Her stiger antallet af celler eksponentielt. Hastigheden af denne vækst beskrives med fordoblingstiden, som beskriver hvor lang tid der går, før antallet af bakterier er fordoblet. På grafen foroven, er den eksponentielle fase liniær og ikke eksponentiel stigende, fordi grafen er logaritmisk afbilledet. Hvordan det i virkeligheden ser ud, kan ses på den graf jeg har lavet til højre.

3. Stationære fase

På et tidspunkt stopper væksten, fordi der enten er mangel på næring, eller der sker en ophobning af affaldsprodukter der hæmmer væksten, fx på grund af en sinket pH-værdi. På dette tidspunkt dør ligeså mange celler som der dannes, og den stationære fase er dermed nået.

4. Dødsfasen

Den sidste fase er dødsfasen. Denne fase er eksponentielt faldende, hvilket vil sige at det er halveringstiden som beskrive den hastighed hvorved halvdelen af bakteriecellerne er gået til grunde. Enten vil alle bakterierne til sidst dø, eller også vil nogle få, mere resistente bakterier blive tilbage, som kan overleve i en længere periode. Hvis bakterien er sporedannende, kan de frie spore i teorien holde liv i kolonien i uendelig tid. [13]

Substrater

Et substrats opgave er at sikre vækst til de(t) ønskede mikroorganisme(r). Derfor skal et substrat indeholde følgende

• Alle nødvendige grundstoffer som sikre mikroorganismens vækst. Især er der behov for en nitrogenkilde

• En energikilde, som samtidige virker som C-kilde. Energikilden kan både være en let-omsættelig, eller svær-omsættelig, hvilket kan afgøre hvornår vækstfasen starter, hvornår den slutter, og hvornår dødsfasen nås.

• Nødvendige vækststoffer som fx bestemte aminosyrer og vitaminer.

• Vand

• Passende pH

• Passende vandaktivitet

12

http://www.biotechacademy.dk/undervisningsprojekter/oel/teori/vaekstfaser.aspx 26/4 2011

13

Teoretisk mikrobiologi for laboratoriefolk, Herluf Thougaard, Verner Varlund, m.f

Side 13

10HTX13A

Side 13 af 35

Der findes mange færdiglavede substrater, som man bare tilføjer postevand eller deminiraliseret vand til. Men man kan også selv lave substrat, hvilket vi gjorde ud fra en opskrift, som var designet til penicillinfremstilling ud fra skimmelsvampen Penicillinum Chrysogenum. Til at starte væksten af skimmelsvampen, blev der brugt et substrat med glucose, som sikre en hurtig vækst, derudover også rofex, sojaolie og CaCO

3

• Rofex består udtræk af spiret majs, og bruges som nitrogenkilde. Denne er velegnet til

                                 14
penicillinfremstilling af en ukendt grund.

• Sojaolie virker både som energikilde og som skumdæmpningsmiddel, hvilket sikre at der ikke bliver dannet skum, forårsaget af omrystningen.

• CaCO bruges til at holde pH stabil på omkring 6-7

3

Efter væksten var startet, blev nye kolber med et dyrkingssubstrat podet med skimmelsvampen.

Dette substrat skulle sikre en høj penicillindannelse. Substratet havde nu overvejende lactose som energikilde, som sikre en kortere vækstfase og en længere stationær fase, og det er i denne fase at penicillindannelsen finder sted. Som noget nyt var der ammoniumsulfat og en precursor til stede.

Ammoniumsulfat skaber en N-kilde og S-kilde. En precursor bruges til at danne sekundære metabolitter [15], som penicillin er. Precursorere der kan bruges her er fenoxy-eddike og fenyleddike som sikre henholdsvis en produktion af penicillin V og penicillin G. [16]

14

Fremstilling af Penicillin- Øvelsevejledning. Nicholas Barnes.

15

Se fermentering for forklaring

16

Fremstilling af Penicillin- Øvelsevejledning. Nicholas Barnes.

Side 14

10HTX13A

Side 14 af 35

Fermentering

Fermentering er et begreb som dækker over processer hvor biologiske stoffer bliver dannet ved hjælp fra mikroorganismer og deres enzymer. Eksempler på dette er produktion af øl, ost, citrosyre,

                     17
vaskepulver og antibiotika

Fermentering kan enten foregå ved submers dyrkning, hvor mikroroganismen er opslæmmet i flydende substrat, eller ved overfladefermentering, hvor mikroorganismen befinder sig på overfladen af et flydende eller fast substrat.

Afhængig af om der tilføres nyt substrat og om der fraføres substrat kan fermenteringen være en

• Batchkultur, her standser man fermenteringen, tapper produktet og starter helt forfra.

• Fed-batch, her tilføres der løbende nyt substrat, indtil man stopper fermenteringen og tapper produtet.

• Kontinuert kultur, her tilføres nyt substrat og fratappes færdigt produkt kontinuerligt, og processen behøves i teorien ikke at stoppes.

Det er forskelligt hvornår i vækstforløbet, mikroorganismen producere det ønskede produkt.

Produktet kan enten dannes under vækstfasen eller i den stationære fase. Ved produktdannelse under vækstfasen er der tale om et produkt som er nødvendig for mikroorganismens vækst, fx proteiner og kulhydrater. Der kan også være tale om biprodukter som fx ethanol og acetone. Disse produkter kaldes primære metabolitter, da de dannes i forbindelse med mikroorganismens metabolisme.

Ved produktdannelse under den stationære fase er der derimod tale om sekundære metabolitter.

Disse stoffer har ikke nogen funktion for vækst, men kan give en fordel i det miljø mikroorganismen lever i. eksempler er antibiotika, herunder penicillin, tetracyklin m.fl. Det er oftest disse sekundære metabolitter der udnyttes i industrielle fermenteringer. [18]

17

Mikroskopisk liv – biologi med fokus på mikroorganismer. Lone Als Egebo

18

Mikrobiologi – Fødevarer hygiejne genteknologi. Herluf Thougaard m.fl.

Side 15

10HTX13A

Side 15 af 35

Antibiotika og penicillin

Antibiotika er en betegnelse for kemiske stoffer der produceres af mikroorganismer. Disse stoffer er kendetegnet ved at de er i stand til at dræbe eller hæmme andre mikroorganismer. Formålet med dette, er at give de antibiotikafremstillende mikroorganismer en fordel imod konkurrenter i dens miljø. Der findes mange naturligt forekommende antibiotika, men efter menneskets opdagelse af antibiotika, er der kommet flere halv-syntetiske og syntetiske antibiotika.

Antibiotika har forskellige virkemåder, alt efter hvilken form der er tale om. Nogle eksempler på forskellige antibiotika virkningsområder ses her:

• Hæmning af cellevægsdannelsen, virker ved at blokere cellernes mureinsyntese.

Penicillinerne er et eksempel.

• Hæmning af proteinsyntesen, cellens ribosomer sættes ud af spil, og kan derfor ikke producere livsvigtige proteiner

• Ødelæggelse af plasmamembranens funktion

Vi har dyrket skimmelsvampen Penicillium chrysogenum, som producere penicillin.

Penicillin findes i mange forskellige former, men grundstrukturen som alle penicilliner er opbygget ud fra, ses neden for. Kemisk set består den af C H N O S og en

10 13 2 4 radikal. Radikalen er den der afgører hvilken form for penicillin der bliver dannet. Eksempler på radikaler ses på skitsen for neden. (På

denne skitse er R^{1} en betegnelse for hvor penicillin sidder fast.) [19]

I dag findes der mange forskellige former for penicillin. Den første produktion af penicillin skete ud fra skimmelsvamp arten

Penicillinum notatum, senere fandt man ud af at man fik et bedre udbytte af arten Penicillinum chrysogenum, som er den art vi har brugt til vores forsøg. Denne art kan både producere Penicillin G og Penicillin V, alt efter hvilken precursor man tilsætter substratet.

I vores forsøg har vi produceret penicillin V, også kaldet Phenoxymethylpenicillin, fordi vi brugte fenoxy-eddikesyre. Hvis vi havde brugt fenyleddikesyre havde skimmelsvampen i stedet produceret penicillin G, hvilket egentlig var vores plan.

19

Alle skitser af penicillin og radikaler er tegnet i chemsketch

Side 16

10HTX13A

Side 16 af 35

Penicillin virker på gram-positive bakterier i vækst. Det sker ved at forhindre bakterierne i at danne mureinlaget i cellevæggen. Teknisk set forhindrer Penicillin at peptidtværbindinger i bakteriecellens peptidoglycanlag bliver dannet. Uden dette mureinlag bliver cellevæggen så svag at den til sidst vil briste og gå til grunde. Dette mureinlag findes kun i bakterier, derfor bliver dyreceller ikke påvirket.

Grunden til at det ikke virker på gram-negative bakterier kan ses i afsnittet ”Bakteriecellen”.

Penicillin går ind og blokere det enzym som skulle forbinde NAM/NAG-kæderne via

peptidtværbroerne. Enzymet Transpeptidase går normalt ind og forbinder peptidbroerne imellem

Alanine og L-lysine^{og} [20] [21]. Dette sker ved at Penicillin sætter sig på det aktive sted i enzymet, og

blokere herved for dannelsen af mureinlaget. Denne blokering er vist til højre. [22]

20

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/d/d0/Penicillin_inhibition.svg/382px-

Penicillin_inhibition.svg.png 29/4 2011
21

http://pharmaxchange.info/press/2011/03/animation-of-synthesis-of-peptidoglycan-layer/ 29/4 2011

22

Mikrobiologi – teori og praksis. Torben Skou og Gunnar Søgaard Jensen

Side 17

10HTX13A

Side 17 af 35

Resistens

Antibiotika, herunder penicillin, blev betragtet som et vidundermiddel i mange år efter sin opdagelse. Men et voksende problem i nutidens samfund, er at bakterier bliver resistente. [23] Resistens betyder modstandsdygtighed, og i biologiens verden forekommer det når en mikroorganisme bliver modstandsdygtige overfor fx kemiske stoffer, som penicillin.

Der findes tre former for biokemiske mekanismer, der kan gøre bakterier resistente overfor bakterier.

• Nedsat akkumulering af antibiotika i bakterien. Betegner når en mekanisme sikre færre antibiotikamolekyler inde i cellen, dette kan ske ved at bakteriens overflade ændres, så antibiotikummet har svære ved at trænge ind i cellen, eller ved at cellen danner et protein som aktivt pumper antibiotikummet ud af cellen.

• Inaktivering af antibiotika ved hjælp fra enzymer. Enzymer binder sig til antibiotikummet som dermed bliver forhindret i at angribe cellen.

• Ændring af angrebsstedet i cellen, stedet hvor antibiotikummet angriber cellen, fx et specifikt protein, ændre opbygning så antibiotikummet ikke længere kan angribe.

Årsagen til at bakterier opnår disse ændringer, som gør dem resistente overfor enkelte antibiotika, kan deles op i 3 årsager.

• Iboende egenskab, beskriver når bakterien er resistent fra naturens side, findes fx i bakterier der selv danner antibiotika, men gramnegative bakterier er også naturligt resistente overfor visse former for antibiotika (penicillin)

• Muteret egenskab, beskriver når egenskaben skyldes en mutation i arvematerialet.

• Erhvervet resistens dækker over når bakterien modtager egenskaben fra en anden bakterie.

En bakterie kan erhverve resistens på tre måder. Konjugation, transduktion og transformation.

Erhvervet resistens foregår ved at to bakterier udveksler DNA, og dermed gener. De tre hyppigst forekommende måder er som sagt konjugation, transduktion og transformation.

1. Transformation, Her optager recipientcellen frit DNA i form af kromosomer eller plasmider. De kan enten stamme fra donorceller der er gået til grunde, eller som har valgt at

udstøde plasmider^{24}

2. Transduktion, Virus (bakteriofager) kan ved en fejl optage værtsbakteriens DNA, som derefter kan blive overført til den næste bakterie. Her kan bakterien optage DNA’et i sit kromosom, eller i et plasmid.

23

Mikroskopisk liv – biologi med fokus på mikroorganismer, Lone Als Egebo

24

Billede: http://www.emu.dk/gym/fag/bi/inspiration/nyheder/salmonella.html 29/4 2011

Side 18

10HTX13A

Side 18 af 35

3. Konjugation, Ved konjuktion udveksles DNA, ved at to celler skaber kontakt, via donorcellens sex-pili. DNA’et i donorcellen rulles ud, og den ene halvdel overføres til

                                        25 og 26
recipientcellen. Begge celler indeholder DNA’et.

Når en bakteriecelle er blevet resistens, og der bruges antibiotika i dens miljø, overlever den resistente bakteriecelle som den eneste, dermed har den ingen konkurrenter i sit miljø, og der vil hurtigt opblomstre en koloni af resistente bakterier. Dette gør at de resistente bakterier bliver fremavlet, og at der dag for dag kommer flere og flere resistente bakterier. [27]

25

Antibiotika Resistens, Sigrid Andersen

26

Mikrobiologi – Fødevarer Hygiejne Genteknologi. Herluf thougaard, m.fl.

27

Billeder: http://mobil.ing.dk/artikel//4 2011

Side 19

10HTX13A

Side 19 af 35

Forsøgsbeskrivelse

Min forsøgspartner Ida Johansson, og mit forsøgs formål var at fremstille penicillin ved dyrkning af skimmelsvampen Penicillium crysogenum). Derudover også at undersøge hvilke faktorer der har indflydelse på penicillinproduktionen. Vores forsøg har jeg opdelt i disse seks trin:

• Fremstilling af substrater og opløsninger

• Podning og dyrkning af skimmelsvampen

• Dyrkning af testbakterien: micrococcus luteus

• Koncentrering af penicillin

• Fremstilling af PCA-plader med testorganismen

• Dybdeudsæd og agarkopmetoden og aflæsning af resultat

Vi valgte at ændre på 3 faktorer, pH, temperatur og iltning. Dette er nærmere beskrevet i Projektbeskrivelse og under de enkelte punkter i forsøgsbeskrivelsen.

Når man arbejder med mikroorganismer, er det vigtigt at man holder orden i sine ting og holder klinisk rent. Man skal have nogle gode arbejdsvaner der gør at man ikke kommer til at forurene sterile arbejdsredskaber og mikroorganismer. Det er vigtigt at begrænse smittespredning, dette gøres ved at holde rent, og arbejde i en laf-bænk med udsugning, herved kan der ikke spredes mikroorganismer i luften som kan føre til luftbåren smitte.

Ud fra dette, har vi valgt at arbejde i laf-bænken, hver gang vi har med mikroorganismer at gøre.

Alle kolber og substrater blev autoklaveret ved 121˚C for at slå alle mikroorganismer og spore ihjel.

Pipetter blev opvarmet til 200˚C i 2 timer, eller der blev brugt sterile engangpipetter. Mundingen på kolber og glasrør, der skulle indeholde mikroorganismer eller gjorde det, blev altid flamberet efter åbning og inden lukning.

Vores tidsplan over forsøget kan ses i bilag 2.

Risiko og sikkerhedssætninger i forbindelse med de brugte kemikalier, kan ses i bilag 3.

Fremstilling af substrater

Inden vi gik i gang med selve forsøget, startede vi med fremstille NaOH- og HCL opløsninger som skulle bruges til indstilling af pH. (se bilag 1 for udregninger og fremgangsmåde af disse).

Derudover fremstillede vi maltvands skrårør som skulle bruges til at overføre skimmelsvampen til.

Vi fremstillede forkultursubstratet, som vores skimmelsvamp, Penicillium chrysogenum skulle opformeres i. Derudover fremstillede vi dyrkningssubstratet som Penicillium chrysogenum skulle formeres, og producere penicillin i.

Flowsheets over disse tre fremstillinger kan ses her:

Maltvands skrårør

Maltvandsskrårørne blev brugt til at overføre skimmelsvampen fra det skrårør vi modtog fra laborantskolen i næstved.

Side 20

10HTX13A

Side 20 af 35

Forkulturskolbe

Vi lavede to forkulturskolber, som skulle bruges til at opformere skimmelsvampen, inden den blev delt ud på de 12 dyrkningskolber.

Dyrkningskolbe

•9,6g Malt extract agar tilføres til 200 ml deminiraliseret vand i en 250ml konisk kolbe.

Opblanding

•substratet varmes op til kogepunktet, og afkøles til omkring 50-60˚C

Opvarmning

•Substratet fordeles på 20 rørsglas

Fordeling

•De tyve rørglas lukkes med rørhætter og autoklaveres

Autoklavering

•Skrårørne sættes skråt indtil de størkner, og gemmes i køleskab indtil brug

Størknes

•12g glucose og 6g Rofec opløses til 500ml postevand i en konisk kolbe.

Opløsning

•Via 1M NaOH indstilles pH til 5,5 pH indstilles

•Substratet fordeles på to 500ml koniske kolber

•Der tilsættes 2,5mL soyaolie og 2,5g CaCO_{3} til hver kolbe.

Fordeling og tilsætning

•Kolberne proppes med vat og sølvpapir og autoklaveres herefter.

Autoklavering

Side 21

10HTX13A

Side 21 af 35

Vi lavede 12 dyrkningskolber. 2 skulle i varmt vandbad, 2 på rystebord under iltning, 2 på rystebord uden iltning, 6 i koldt vandbad hvoraf 2 havde en uændret pH på 6,86, 2 med hævet pH på 8,21 og 2 med sænket pH på 4,25.

28

Ved at tilsætte CaCO til kolberne hævede vi pH-værdien med omkring 1, derfor målte vi

3 efterfølgende pH igen, til henholdsvis pH 4,25; 6,86 og 8,21

Podning og dyrkning af skimmelsvampen

Efter fremstillingen af substrater, skulle skimmelsvampen penicillium chrysogenum, overføres fra det originale skrårør, til vores egne 2 skrårør, derefter videre til opformering i 2 forkulturskolber og til sidst dyrkes i 12 dyrkningskolber.

De to kolber med forkultursubstratet blev podet med penicillium chrysogenum og stillet på rystebord i to døgn. Dette sørgede for at der var nok svampeceller til stede inden 10ml fra forkulturkolben med mest vækst, blev overført til hver af de tolv dyrkningskolber. De tolv dyrkingskolber vil lov til at stå på rystebord i 14 dage.

28

Fremstilling af Penicillin- Øvelsevejledning. Nicholas Barnes.

•30g glucose, 300g Lactose, 120g Rofec, 30g Fenoxy-eddikesyre, 30g ammoniumsulfat opløses med 3000ml postevand i fire koniske kolber, 2 med

1000ml, og 2 med 500ml .

Stofferne opløses

•Via 1M NaOH og 1M HCl indstilles pH til 5 i de to med 1000ml, og henholdsvis 3 og 7 i de to med 500ml.

pH indstilles

•Substratet fordeles på 500ml koniske kolber med 250ml i hver.

•Der tilsættes 2mL soyaolie og 1g CaCO_{3} til hver kolbe.

Fordeling og tilsætning

•Kolberne proppes med vat og sølvpapir og autoklaveres herefter.

Autoklavering

Side 22

10HTX13A

Side 22 af 35

Flowsheet over dyrkingen af skimmelsvampen kan ses her. Dette flowsheet beskriver også den basale teknik i podning.

29

29

Fremstilling af Penicillin- Øvelsevejledning. Nicholas Barnes.

• Proppen tages af rør 1 (det modtagede skrårør. )

• Uden at lægge proppen ned, flamberes rørets munding

• En steril engangspodenål føres ned og skraber materiale af overfladen på skrårøret.

• Rørets munding flamberes igen

• Proppen sættes på og rør 1 sættes i stativ

• Proppen tages af rør 2 (maltvands skrårør) og rørets munding flamberes

• Uden at lægge proppen ned, føres podenålen ned i røret og overfører materialet til overfladen på skrårøret.

• rør 1's munding flameres og proppen sættes på.

Podning af maltvandsskrrør fra modtaget skrårør

• Maltvands skrårørne står ved stuetemperatur i 2 døgn for at sikre vækst af skimmelsvampen

Opformering i maltvands skrårør

• Proppen tages af rør 2 (maltvands skrårør )

• Uden at lægge proppen ned, flamberes rørets munding

• En steril engangspodenål føres ned og skraber materiale af overfladen på skrårøret.

• Rørets munding flamberes igen

• Proppen sættes på og rør 2 sættes i stativ

• Sølvpapir og vat tages af forkulturs kolben og mundingen flamberes

• Uden at lægge sølvpapiret med vat ned, føres podenålen ned i kolben og overfører materialet ved omrøring i kolben.

• Kolbens munding flameres og sølpapir og vat sættes på som prop.

• Trinene gentages med den anden forkulturskolbe

Podning af forkulturskolber fra Maltvands skrårør

Side 23

10HTX13A

Side 23 af 35

30

For at sikre at de to kolber der iltes, ikke forurenes, blev slanger og glasstav steriliseret og der blev indsat et membranfilter, som fjerner mikroorganismer ved at luften presses gennem filtret der har en meget lille porestørrelse. Dette gør at luftens mikrober ikke bliver blæst ned i substratet.

Efter 7 dage var det tydeligt at se skimmelvæksten, både nede i væsken, men også i overfladen var der begyndt at komme kolonier, hvilket ses på dette billede.

30

Fremstilling af Penicillin- Øvelsevejledning. Nicholas Barnes.

• De to forkulturskolber står på rystebord i 3 døgn for at skabe nok skimmelkolonier til de tolv dyrkningkolber, og sikre en ensartet fordeling af kolonier i de 12 kolber.

Opformering i forkulturskolber

• Forkulturskolben med mest vækst udvælges

• Sølvpapir og vat tages af forkulturs kolben og mundingen flamberes

• Uden at lægge sølvpapiret med vat ned, føres en steril fuldpipette ned og suger 10ml op, fuldpipetten tages op igen.

• Kolbens munding flameres og sølvpapir og vat sættes på som prop.

• Sølvpapir og vat tages af dyrkningskolben

• Mundingen flamberes og fuldpipetten frigiver sit indhold ned i kolben

• mundingen flamberes og sølvpapir og vat sættes på.

• Trinene gentages med de andre 11 dyrkningskolber

• De tolv dyrkningskolber placeres alle på, eller udfra rystebordet via gribearme

• 2 i varmt vandbad

• 2 under iltning

• 2 på rystebord

• 6 i koldt vandbad hvoraf 2 havde en uændret pH på 6,86, 2 med hævet pH på 8,21 og 2 med sænket pH på 8,21.

Podning af dyrkningskolber fra forkulturskolbe

• Dyrkningskolberne står på/udfra rystebordet i 14 døgn hvor vækst af

skimmelsvampen og produktionen af penicillin finder sted.

Opformering i forkulturskolber

Side 24

10HTX13A

Side 24 af 35

Dyrkning af testbakterien

Imens dyrkningskolberne stod på rystebord i 14 dage, blev testbakterien podet fra den PCA-plade vi modtog fra laboratoriehøjskolen i næstved, til boullionkultur rørglas

Koncentrering af penicillin

14 dage efter vi havde podet vores dyrkningskolber, udtog vi 10ml fra hver kolbe og centrifugerede, for at få bundfældet urenheder og svampemyceliet. Den klare, gullige væske blev hældt i sterile kolber og frosset ned, indtil næset uge, hvor dybdeudsædning og agarkopmetoden skulle udføres.

Alle trin i flowsheetet er blevet gjort i laf-bænk, og arbejdet udført med afsprittet og sterilt udstyr for at sikre at der ikke opstår forurening af vores prøver.

🡺 Fortsættes

• Boullionkultur substrat fremstilles efter følgende opskrift:

• 30 g tryptone soya broth opløses i 1000mL deminiraliseret vand

• proppes med vat og sølvpapir, og autoklaveres

Boullionkultur rørglas

• 2 Boullionkultur rør podes med materiale fra PCA-pladen med

Micrococcus Lutheus.

PCA-plader

• De podede boullionkultur rør sættes i varmeskab i 24 timer, herefter opbevares de i lab-bænken til 24 timer inden dybdeudsædningen

Boullionkultur rørglas

• De 12 dyrkningskolber vurderes, for se om der er forurening. Da vi har lavet dobbeltbestemmelse, kan forurenede kolber undværes, men da dette ikke er tilfældet, bruges de alle.

• 10ml fra hver kolbe udtages med en steril fuldpipette.

• Åbning af kolberne flamberes før og efter opsugning af væske.

Dyrkningskolber

• De 10ml sprøjtes ned i centrifugeglas og sættes i centrifuen.

• Dette gentages med alle kolberne

Centrifugeglas

Side 25

10HTX13A

Side 25 af 35

Fremstilling af PCA-plader med testorganismen

For at teste om vores skimmelsvamp har produceret penicillin, og styrken af denne, fremstillede vi

8 PCA-plader dybdeudsædet med testorganismen Micrococcus lutheus. Fremstillingen af de 8 PCA-plader skete på følgende måde:

🡺 Fortsættes

• Kolberne centrifugeres indtil bundfældning af mycelie

Centrifugering

• Hvert par hældes sammen, eftersom der ikke var sket en forurening af nogen dyrkningskolber. De 6 sterile kolber sættes i fryser for at bevare penicillinen indtil styrketest.

Sterile kolber

• Da penicillin virker på bakterier under vækst, podes nye rørglas.

• 8 nye sterile boullionkultur rørglas podes med ½mL væske fra det boullionkultur rørglas med mest vækst.

Boullionkultur rørglas

• De 8 nye boullionkultur rørglas podet med testorganismen stilles i varmeskab i 24 timer.

Nye Boullionkulturrørglas

• PCA fremstilles efter følgende opskrift

• 17,5gram PCA opløses i 1000mL deminiraliseret vand i en 1000mL målekolbe

• Opvarmes til kogepunktet

• 80 mL hældes i hver af 8 autoklaveflasker.

• De otte autoklaveflasker autoklaveres for at sikre imod forurening.

PCA i autoklaveflasker

Side 26

10HTX13A

Side 26 af 35

• PCA-pladerne sættes i køleskab i en time for at sikre stivnelse._{31}

Grunden til at vi fremstillede 8, og ikke 6, var at vi gerne ville være på den sikre side, så vi både havde en til at øve os på når vi skulle udføre agarkopmetoden, og havde en ekstra hvis der skete fejl.

Dybdeudsæd og agarkopmetoden

I denne del af forsøget, laves der en penicillinbestemmelse ved agardiffusion og agarkopmetoden.

Vi har nu fremstillet PCA-pladerne med micrococcus lutheus, som stod i køleskabet for at stivne agaren. Herefter udføres agarkopmetoden, ved at lave hunner i agaren med et propbor og fylde hullet med penicillinstandarder og vores egen fremstillede testpenicillin. Penicillinstandarderne blev fremstillet inden PCA-pladerne på følgende måde:

32

31

Fremstilling af Penicillin- Øvelsevejledning. Nicholas Barnes.

• Den flydende PCA køles ned til omkring 50˚C

• De otte podede boullionkultur rørglas hældes i de otte autoklaveflasker med PCA

• autoklaveflaskernes indhold hældes herefter i tomme og sterile petriskåle.

• Der sættes låg på de fyldte petriskåle (PCA-plader) og de køres i 8-taller for at sikre opblanding.

PCA-plader

• I bogen The Merck Index af Budavari, Susan., m.fl ses det at Penicillin G-

kaliumsalt har en enhedsværdi på 1595 i.e/mg

• Vi skal have fem penicillinstandarder på 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 og 1,6

• 100mg Penicillin G-kaliumsalt opløses i 100mL vand

• 10mL af denne opløsning fortyndes i 1000mL vand

• 10mL af denne opløsning fortyndes i 100mL vand

• Herved har vi en standard 1,595i.e/ml

Penicillinstandard

• 50ml af standardopløsningen på 1,6i.e/ml opløses i 50ml vand herved fås
en standardopløsning på 0,8i.e/ml

• Dette gentages så vi har 5 opløsninger henholdsvis 0,1; 0,2; 0,4; 0,8 og

1,6 i.e/mL

de 5 standarder fremstilles

Side 27

10HTX13A

Side 27 af 35

Nu kan agarkopmetoden udføres, dette udføres som alt andet arbejde i laf-bænken under udsugning, og sterile arbejdsrutiner.

Da vi havde otte PCA-plader til rådighed, trænede vi udboringsmetoden på den ene.

Den sidste del af forsøget, er aflæsning af resultatet, og udregning af koncentrationen. Dette sker ved efter PCA-pladerne havde stået i varmeskab i 24 timer. Aflæsningen sker ved at måle diameteren på de bakteriefri-zoner rundt om de udborede huller, via en skydelære. Billeder af resultater og diagrammer over resultater kan ses i de næste afsnit.

Efter forsøget blev alt udstyr, som havde været i kontakt med de to mikroorganismer, autoklaveret for at sikre at alle mikroorganismer og sporer gik til grunde.

32

Praktisk mikrobiologi. Herful Thougaard m.fl.

•Propboret steriliseres ved neddøbning i 70% ethanol og flambering.

•låget tages af PCA-pladen og der laves 6 huller i PCA-en

•Låget sættes på igen, og processen gentages med de resterende 5 PCA-plader

Udboring

•Låget tages af PCA-pladen

•5 huller fyldes op med penicillinstandarder og 1 hul med testpenicillinen via sterile pipetter

•låget sættes på igen, og processen gentages med de resterende PCA-plader

Opfyldning

•De 6 PCA-plader sættes i varmeskab ved 37˚C i 24 timer, da denne temperatur er optimumstemperaturen for micrococcus lutheus

Opformering

Side 28

10HTX13A

Side 28 af 35

Resultater

Efter vi havde tilført vores penicillin standarder og test til de seks huller i agaren, og ladet dem stå i varmeskabet i 24 timer ved 37˚Ceusius, tog vi billeder af PCA pladerne og målte diameteren på hæmningszonene via en skydelære. Her ses billederne af de 6 PCA plader:

PCA-plade 2: Varmt vandbad, brønden i midten er fyldt med vores testpenicillin som vi selv har produceret. Her ses det at der ikke har været produceret penicillin, da der er fuld bakterievækst.

Desuden kan det ses at der hverken er hæmmet vækst ved 0,1 og 0,2 i.e/mL

PCA-plade 3: Iltning, under iltning blev der produceret megen penicillin, og der er derfor et stort område hvor bakteriens vækst er hæmmet, med en diameter på 28,5mm

PCA-plade 4: Rystebord¸ Her skete der en lille produktion af penicillin og zonen har en diameter på 12,5mm

Side 29

10HTX13A

Side 29 af 35

PCA-plade 5: Koldt vandbad og lav pH, ved en pH på 4,25 var der hverken skimmelvækst eller penicillinproduktion.

PCA-plade 6: Koldt vandbad og høj pH, med en pH på 8,21 var der vækst i skimmelsvampen, men den producerede ikke penicillin. Standardprøvernes hæmningszoner er udtværede, mulige kilder til denne fejl, kan læses i afsnittet fejlkilder, under resultatbehandling.

PCA-Plade 7: Koldt vandbad, her var der vækst af skimmel og en produktion af penicillin med en hæmningszone med diameteren 18mm.

De samlede resultater er sat ind i dette skema:

PCA-plade Faktor hæmningszone Skimmelvækst

2 | Varmt vandbad | 0 | mm | middel

3 Iltning 28,5 mm meget

4 Rystebord 12,5 mm middel

5 | Lav pH | 0 | mm | ingen
6 | Høj pH | 0 | mm | lav

7 Koldt vandbad 18 mm middel

Resultatbehandling

I dette afsnit vil jeg udregne koncentrationen af penicillin i vores test, derudover vil jeg komme med forslag til optimering og liste mulige fejlkilder.

Udregning af koncentration

Der var kun skimmelvækst i 3 af de 6 PCA-plader. Ud fra dem vil jeg udregne koncentrationen af penicillin. Det gør jeg ved at lave en standardkurve, hvor jeg ud for diagrammet kan aflæse koncentrationen af penicillinopløsningen. Arealet af hæmningszonerne sættes som x-aksen, og

Side 30

10HTX13A

Side 30 af 35 koncentrationen af penicillinopløsningerne sættes som y-aksen. Herefter kan penicillinkoncentrationen i den penicillin vi selv har udvundet. Dette gøres ved at sætte en tendenslinje for punktserien, og sætte denne funktion lig 0.

Da vi kun så resultat på petriskål 3, 4 og 7, har jeg kun lavet diagrammer for disse. De tre

diagrammer ses forneden. (Da 0,1i.e/ml penicillinstandardopløsningen ikke kunne ses på nogen af

PCA-pladerne, har jeg ikke taget disse med i standardkurven)

I petriskål 3 diagrammet, har jeg ikke taget 0,2i.e/ml penicillinopløsningerne med da der blev
dryppet for meget 0,2i.e/ml i så brønden flød over.

Side 31

10HTX13A

Side 31 af 35

Ud fra de tre diagrammer, har jeg fået følgende resultater.

Den udvundne Penicillinopløsning fra dyrkingskolben der blev iltet, havde en

penicillinkoncentration på 2,71i.e./ml.

Den udvundne Penicillinopløsning fra dyrkingskolben der stod på rystebord, havde en

penicillinkoncentration på 0,691i.e./ml.

Den udvundne Penicillinopløsning fra dyrkingskolben i vandbad, havde en penicillinkoncentration

på 1.74i.e./ml.

Det skal dog siges, at da vores testpenicillin var penicillin V, og standardpenicillinen var penicillin G, derfor kan man ikke stole 100 % på resultaterne.

Optimering

Vores forsøg gik ud på at optimere vores produktion af penicillin ud fra skimmelsvampen Penicillinum chrysogenum. Da vi kun havde tid til en produktion valgte vi at ændre på 6 faktorer, og lave dobbeltbestemmelse på disse. Ud fra de 6 faktorer ville vi undersøge hvordan pH, temperatur og iltning havde indflydelse på koncentrationen af penicillin.

Vi fandt ud af at iltning havde en gavnlig effekt på produktionen af pencillin, helt konkret blev der produceret over dobbelt så meget penicillin da den blev iltet. Dette skyldes formentligt at skimmelsvampen arbejder aerobt, og skal derfor bruge ilt til sin metabolisme, (stofskifte).

Derudover fandt vi ud af at pH-værdien i det miljø som skimmelsvampen voksede i, havde en afgørende betydning for produktionen af penicillin.

Ved en pH-værdi på 4,25 sås der ingen vækst af skimmel, ved 6,86 var der en god vækst og produktion af penicillin, og ved 8,21 var der vækst men ingen produktion af penicillin. Grunden til at der ikke er penicillinproduktion i kolben med høj pH, selvom der er en lav vækst af skimmel, kan

Side 32

10HTX13A

Side 32 af 35 skyldes at skimmelsvampen kun havde energi nok til lige at overleve, og ikke nok energi til at producere den sekundære metabolit, som penicillin er.

Vi fandt ud af, at ved en høj temperatur på 36˚C var det ikke muligt for skimmelsvampen at leve.

Derimod blev der produceret mere penicillin ved en fast temperatur på 21 grader, end ved en svingende stuetemperatur.

Måden hvorpå vi kan optimere vores process, hvis vi havde mere tid, ville være at lave flere forsøg, for at undersøge under hvilken temperatur, Penicillinum chrysogenum producere mest penicillin, det samme gælder for pH-værdien. Derudover kan det undersøges hvor lang tid Penicillinum chrysogenum skal stå i dyrkningskolberne, før penicillinen udtages, da der skal være balance imellem hvornår svampen starter på at producere sekundære metabolitter, og hvornår der ikke er mere næringssubstrat tilbage. Og til sidst kan der laves forsøg hvor substratets sammensætning ændres.

Når alle disse forsøg er lavet, og de optimale forhold er fundet, kan Penicillinum chrysogenum dyrkes i store tanke under kraftig gennembobling. Ved også at lave en kontinuerlig fermentering, hvor nyt substrat tilføres og penicillinholdigt substrat fraføres løbende vil udbyttet øges betragteligt.

Det penicillinholdige substrat kan efter centrifugering også behandles med 90 % alkohol, som udfælder proteinholdige forureninger, hvilket vil give en renere penicillinholdig væske. [33] Fejlkilder

I et så stort forsøg som vores, med så mange processer som vi aldrig har arbejdet med før, er det svært at undgå fejl. Her er en liste over de fejlkilder vi har begået, som kan have indflydelse på vores resultater.

• Ved en fejl kom vi til at bruge Fenoxy-eddikesyre og ikke Fenyl-eddikesyre, som precursor, hvilket resulterede i at vores skimmelsvamp producerede penicillin V i stedet for G. Dette har kun betydning for beregning af koncentrationen af penicillin, da G er stærkere end V, men det har ikke konsekvenser for sammenligning af resultater.

• Slanger og glasrør til iltning af to dyrkningskolber blev ikke autoklaveret, som nødløsning blev de kogt i 20 minutter og renset i sprit. Da vi ikke observerede en forurening af disse kolber regnede vi dem for sterile.

• Over weekenden fordampede der så meget vand fra det varme vandbad, at kolberne ikke havde kontakt med vandet, og havde derfor i op til 48 timer stået ved stuetemperatur, men da der ikke sås vækst i disse, havde det ikke konsekvenser for vores forsøg.

33

Alexander Fleming og penicillinet. Preben Hartmann-Petersen

Side 33

10HTX13A

Side 33 af 35

Perspektivering

Multiresistente bakterier kan være dødsensfarlige, da de er resistente overfor flere antibiotika, og det er derfor ikke sikkert at det rigtige antibiotikum findes i tide. Men hvad kan vi som samfund, og almindelig borger gøre ved det voksende problem med multiresistente bakterier?

Vores samfund burde begrænse brugen af antibiotika, både til brug hos mennesker og især dyr. Det har i mange år været et stort problem at antibiotika er blevet givet til dyr i landbruget som vækstfremmere. Penicillin er simpelthen blevet givet, som en del af foderet til dyrene, for at sikre dyret optimale vækstbetingelser, så udgifter til både foder og dyrlæge kan begrænses. Problemet med dette er, at det især var bredspektret antibiotika der blev givet, for at ramme så mange bakterier som muligt. Dette gør dog også at chancen for at danne resistente bakterier er mange gange højere, end hvis der var brugt smalspektret antibiotika. Dette er nu blevet forbudt her i Danmark, men bruges stadig i høj grad i andre lande. Danmark burde både selvstændigt og via EU kæmpe for at begrænse brugen af antibiotika som vækstfremmer i resten af verden, da der ikke kan være tvivl om at dette har en stor del af skylden for multiresistente bakterier. Dette burde gøres, da multiresistente ikke holder sig inde for sit land, men krydser grænser sammen med dyr og mennesker.

Ud over landbruget, burde lægerne ikke udskrive antibiotika, medmindre det er helt nødvendigt.

Hvis det er nødvendigt så skal der gøres en indsats på at bruge smalspektret antibiotika.

Når en patient med multiresistente bakterier opdages, skal patienten isoleres hurtigst muligt for at sikre at smitten ikke spreder sig. Ved dyr der har multiresistente bakterier, skal hele besætningen isoleres og i yderste konsekvens slås ned.

Den enkelte person kan også gøre et par ting for at det voksende problem med multiresistente bakterier. De kan sørge for at tage hele sin antibiotikakur, hvilket sikre at der ikke er bakterier tilbage som overlevede kuren. De kan sørge for ikke at give antibiotika videre, da denne måske ikke er rettet imod netop den sygdomsfremkaldende mikroorganisme. [34]

34

http://www.foedevarestyrelsen.dk/Nyheder/Pressemeddelelser/2007/bakterier.htm 30/4 2011

Side 34

10HTX13A

Side 34 af 35

Konklusion

Jeg fandt ud af at iltning har en gavnlig effekt på produktionen af penicillin, helt konkret blev der produceret 2,26 gange så meget penicillin i kolben der blev iltet, i forhold til den der ikke blev.

Derudover fandt jeg ud af at pH-værdien i det miljø som skimmelsvampen voksede i, havde en afgørende betydning for produktionen af penicillin. Ved en pH-værdi på 4,25 sås der ingen vækst af skimmel, ved 6,86 var der en god vækst og produktion af penicillin, og ved 8,21 var der vækst men ingen produktion af penicillin.

Jeg kan efter mit forsøg konkludere at skimmelsvampen Penicillinum chrysogenum har bedst vækstbetingelser ved en pH omkring 6-7, når den bliver iltet og har en temperatur på omkring 21˚C.

Derudover kan jeg konkludere at alle 3 undersøgte faktorer, især iltning, har en stor effekt på udbyttet af penicillin.

Side 35

10HTX13A

Side 35 af 35

Litteraturliste

Nicholas Barnes. Fremstilling af Penicillin- Øvelsevejledning. (Efter øvelsesvejledning fra

slagteriskolen i Roskilde) 28/10 1999.

Budavari, Susan., m.fl. The Merck Index. Merck & CO. Inc, 1989

Skou, Torben og Jensen, Gunnar Søgaard. Mikrobiologi – teori og praksis. Systime 2007 Thougaard, Herluf., m.fl. Mikrobiologi – Fødevarer, Hygiejne, Genetik. Nyt Teknisk Forlag 2007 Egebo, Lone Als. Mikrobiologi – Biologi med fokus på mikroorganismer. Nucleus 2004

Thougaard, Herluf., m.fl. Teoretisk mikrobiologi – for laboratoriefolk. Nyt Teknisk Forlag 1997 Bergman, Anette., m.fl. elementær mikrobiologi. Nyt Teknisk Forlag 1989

Waagner Nielsen, E og Buch Kristensen, J.M. Mikrobiologi og biotekning. Erhvervsskolernes Forlag 2006

Andersen, Sigrid. Antibiotika Resistens. Gyldendal Uddannelse. 1999

Hartmann-Petersen. Alexander Fleming og penicillinet. Polyteknisk Forlag. 2006

Röpke, Carsten. Infektionsbiologi. Munksgaard 1997

http://www.foedevarestyrelsen.dk/Nyheder/Pressemeddelelser/2007/bakterier.htm 30/4 2011